骨髓間充質干細胞來源外泌體的微小RNA-22-3p參與抑制環磷酰胺誘導卵巢顆粒細胞損傷的機制研究

吳 潔,劉彥禮,秦藝璐,張勝輝,張瑞云,秦玉飛,范文強

(1.新鄉市中心醫院/新鄉醫學院第四臨床學院,河南 新鄉,453000;2.新鄉市自身免疫診斷與藥物精準治療重點實驗室,河南 新鄉,453000;3.新鄉市醫學免疫性疾病基因診斷重點實驗室,河南 新鄉,453000;4.新鄉醫學院生命科學技術學院 新鄉醫學院干細胞與生物治療技術研究中心,河南 新鄉,453000)

卵巢早衰是一種原發性卵巢功能不全的婦科疾病,是由卵泡衰竭或功能障礙導致的,臨床癥狀有閉經、潮熱出汗、性欲減退等,患者的自然懷孕率僅為5%～10%[1]。研究[2]指出,顆粒細胞凋亡能夠引起卵泡閉鎖,最終導致卵泡減少,表明抑制顆粒細胞凋亡可能是改善卵巢早衰的一種有效方法。雌激素治療能在一定程度上降低相關并發癥的發生風險,但是不能恢復卵巢功能[3]。骨髓間充質干細胞(BMSC)能分化為不同類型的細胞,是干細胞治療領域的研究熱點[4],有研究[5]指出其能夠抑制顆粒細胞凋亡。外泌體是由質膜出芽產生的囊泡,其直徑為30～150 nm,包含膜蛋白、mRNA、非編碼RNA物種和DNA,參與胞間通訊、免疫反應和感染等[6-7]。既往研究[8]指出,BMSC外泌體微小RNA(miRNA)具有治療卵巢早衰的潛力,但BMSC來源外泌體miR-22-3p是否參與卵巢早衰疾病的發病機制尚未闡明。鑒于環磷酰胺(CTX)能通過促進卵泡中顆粒細胞的凋亡而減少卵母細胞數量[9],本研究采用CTX誘導卵巢早衰細胞模型,圍繞BMSC來源的外泌體以及BMSC來源的外泌體miR-22-3p對卵巢早衰的影響進行研究,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

NanoSight LM10分析儀購自英國馬爾文帕納科公司; 卵巢顆粒細胞、人骨髓間充質干細胞購自武漢普諾賽生物; miR-22-3p模擬物、模擬物對照、二苯基四氮唑溴鹽(MTT)細胞活性試劑盒、外泌體提取試劑盒購自廣州銳博生物; 化學發光檢測試劑、miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自南京諾唯贊生物; DMEM培養基、細胞凋亡檢測試劑、SYBR qPCR Master Mix、簇狀分化抗原63(CD63)和簇狀分化抗原9(CD9)一抗抗體,磷酸緩沖液(PBS)購自北京索萊寶生物; 透射電子顯微鏡購自日本jeol公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 臨床樣品收集:選取接受體外受精或者第二代試管嬰兒治療的卵巢早衰患者(n=23)以及接受同樣治療的因男性因素不孕的正常志愿者(n=23)提供了卵泡液。所有參與者均提供了知情同意書。卵巢早衰患者的診斷依據為間隔28 d所測量患者的卵泡刺激素>30 IU/L。本院倫理委員會同意此研究。將收集的卵巢液儲存在4 ℃冰箱。

1.2.2 BMSC來源外泌體分離及鑒定:將BMSC在DMEM培養基中培養,通過離心(350 g離心10 min)將培養上清(20 mL)收集,轉移上清至新的離心管,將離心管放入離心機,在2 000 g條件下離心30 min,轉移上清至新的離心管,將離心管放入離心機,在10 000 g條件下離心20 min,轉移上清至新的離心管; 將約1/3的外泌體提起試劑加到離心管中,4 ℃靜置過夜,將混合液分批在15 000 g轉速下離心0.5 h,棄掉上清液,所得的沉淀包含外泌體保存在-80 ℃冰箱中。分離外泌體的形態學、粒子大小以及標志蛋白,通過透射電子顯微鏡、NanoSight LM10分析儀以及蛋白免疫印跡的方法進行分析。

1.2.3 細胞處理和分組:卵巢顆粒細胞培養在12孔板,選擇匯合度為50%～60%的細胞進行后續實驗,將3個孔的細胞暴露在2 μmol/L CTX溶液中24 h以誘導卵巢早衰樣的顆粒細胞損傷[8],對照組細胞(3個孔)在相同量的PBS中孵育,相應處理的細胞記為CTX組和Control組; 將10 μg/mL的外泌體和磷酸鹽緩沖液(PBS)分別加到另外6個孔后,細胞在培養箱繼續培養48 h,相應處理的培養孔記為外泌體孵育組和PBS處理組; 其他12個培養孔被分為4組(CTX+miR-22-3p組、CTX+miR-NC組、CTX+Exosomes組以及CTX+PBS組,每組3個培養孔),一組在加入miR-22-3p模擬物和轉染試劑混合物后48 h用CTX誘導,一組在模擬物對照和轉染試劑混合物加入后48 h用CTX誘導,一組中的細胞在和分離的外泌體孵育48 h后用CTX誘導24 h,另外一組中的細胞在和PBS孵育后用CTX誘導,CTX誘導方法同上。上述處理的細胞進行下述實驗。

1.2.4 CD63和CD9蛋白表達分析:人BMSC外泌體和顆粒細胞經裂解液裂解,利用聚丙烯酰胺凝膠電泳將裂解液中的蛋白分離,用脫脂奶粉屏蔽非特異的信號后,用CD63以及CD9一抗抗體孵育聚偏二氟乙烯膜,用化學發光檢測試劑檢測抗體復合物。采用Image Lab軟件定量條帶灰度值。

1.2.5 miR-22-3p表達分析:卵泡液和顆粒細胞(經外泌體孵育、CTX處理以及轉染處理)的RNA提取參照RNeasy 96 QIAcube HT Kit 說明書。將RNA和gDNA Wiper Mix在42 ℃反應2 min,將cDNA、引物、RT Mix和HiScript II Enayme Mix按照miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書的條件反應,隨后用SYBR qPCR Master Mix定量miR-22-3p的表達。miR-22-3p上游引物和下游引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGAAGCTGCCAGTTGAAG-3′和5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′;U6為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′和5′-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3′。

1.2.6 細胞活力分析:在培養顆粒細胞的培養孔中加入MTT試劑,并在37 ℃下孵育4 h,加入二甲基亞砜后,在室溫下孵育10 min,用酶標儀分析各孔樣品。

1.2.7 細胞凋亡分析:采用冷PBS清洗細胞3次,用凋亡檢測試劑盒中的碘化丙啶和Annexin V在黑暗條件下染色15 min,然后用熒光激活細胞分選染色細胞。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 BMSC來源外泌體提取及鑒定

本研究首先利用透射掃描電子顯微鏡鑒定從BMSC上清中提取外泌體的形態學,結果顯示所提取的外泌體具有典型的杯狀囊泡(圖1A); 蛋白免疫印跡實驗分析顯示,外泌體標志蛋白CD63和CD9表達在所提取的細胞上清外泌體中,而在細胞裂解液中沒有表達(圖1B); 此外,納米顆粒跟蹤分析結果表明所提取的外泌體粒子大小為80～150 nm(圖1C)。

A:分離的外泌體形態分析; B:外泌體標志蛋白CD63和CD9表達分析; C:外泌體大小分析。

2.2 miR-22-3p在卵巢早衰患者和CTX誘導的卵巢顆粒細胞中低表達

miR-22-3p在卵巢早衰患者卵泡液中的表達低于輸卵管因素不孕癥患者卵泡液中表達,差異有統計學意義(P<0.05,圖2A); miR-22-3p在CTX刺激的卵巢顆粒細胞中的表達低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05,圖2B); 與PBS孵育的卵巢顆粒細胞相比,miR-22-3p在BMSC來源的外泌體孵育卵巢顆粒細胞中的表達增加,差異有統計學意義(P<0.05,圖2C)。

與卵巢早衰患者比較,****P<0.000 1; 與Control比較,**P<0.01; 與PBS處理比較,**P<0.01。

2.3 miR-22-3p過表達減弱CTX處理對卵巢顆粒細胞活力和凋亡的影響

miR-22-3p表達在CTX組中低于對照組,而在CTX+miR-22-3p組的表達高于CTX+miR-NC組,差異有統計學意義(P<0.05,圖3A); 顆粒細胞活力在CTX組中低于對照組,但在CTX+miR-22-3p組高于CTX+miR-NC組,差異有統計學意義(P<0.05,圖3B); 此外,顆粒細胞凋亡率在CTX組高于對照組,但在CTX+miR-22-3p組低于CTX+miR-NC組,差異有統計學意義(P<0.05,圖3C)。

A:miR-22-3p表達分析; B、C:細胞活力和凋亡分析。與CTX組比較,***P<0.001;與CTX+miR-NC組比較,**P<0.01,***P<0.001。

2.4 BMSC來源的外泌體保護卵巢顆粒細胞反抗CTX誘導的損傷

miR-22-3p表達在CTX組低于Control組,而在CTX+Exosomes組表達高于CTX+PBS組,差異有統計學意義(P<0.05,圖4A); 顆粒細胞活力在CTX組低于Control組,但在CTX+Exosomes組高于CTX+PBS組,差異有統計學意義(P<0.05,圖4B); 顆粒細胞凋亡率在CTX組高于Control組,但在CTX+Exosomes組低于CTX+PBS組,差異有統計學意義(P<0.05,圖4C)。

A:miR-22-3p表達分析; B、C:細胞活力和凋亡分析。與CTX組比較,***P<0.001; 與CTX+PBS組比較,**P<0.01。

3 討 論

卵巢早衰表現為40歲前卵巢功能不全,當前的治療手段主要包括激素替代治療、間充質干細胞治療、富含血小板血漿自體注射、體外激活治療、外泌體和miRNA治療[3,11],但這些治療方法的療效和預后較差。研究[12]表明,間充質干細胞是一種有希望治療包括卵巢早衰在內引起不孕的方法,其優勢在于豐富度高,涉及的倫理問題少,自我更新能力強。本研究圍繞BMSC來源的外泌體對卵巢早衰的影響及機制展開研究,結果表明,BMSC來源的外泌體及BMSC來源外泌體的miR-22-3p抑制CTX誘導卵巢顆粒細胞損傷過程。

在很多疾病中已研究BMSC來源外泌體的療效,例如SENGUPTA V等[13]指出異基因BMSC外泌體能夠提高新型冠狀病毒患者臨床狀況及氧合情況。BMSC外泌體在散發性阿爾茲海默氏病小鼠模型中限制膠質細胞過度激活[14],而且BMSC外泌體能夠降低順鉑對卵巢的傷害[15]。本研究結果表明,顆粒細胞活力在CTX組低于對照組,但在CTX+Exosomes組高于對照組; 另外,顆粒細胞凋亡率在CTX組高于對照組,但在CTX+Exosomes組低于對照組,表明BMSC來源的外泌體保護卵巢顆粒細胞反抗CTX誘導的損傷。研究[8]表明,BMSC來源外泌體的miR-644-5p表達在顆粒細胞中下調能夠消除BMSC來源外泌體對順鉑誘導凋亡的影響。研究[16]指出,BMSC來源外泌體的miR-144-5p參與BMSC來源外泌體對卵巢濾泡閉鎖的調控作用。研究[17]發現,miR-22-3p在卵巢早衰患者的血漿中表達下調,且人臍帶間充質干細胞分泌外泌體的miR-22-3p降低顆粒細胞凋亡率[18]。本研究發現,miR-22-3p在卵巢早衰患者卵泡液和CTX刺激的卵巢顆粒細胞中的表達低于對照組,而且miR-22-3p在BMSC來源的外泌體孵育卵巢顆粒細胞中的表達顯著增加; 此外,miR-22-3p表達和顆粒細胞活力在CTX組低于對照組,而其在CTX+miR-22-3p組表達高于CTX+miR-NC組; 顆粒細胞凋亡率在CTX組高于對照組,但在CTX+miR-22-3p組低于CTX+miR-NC組,說明miR-22-3p過表達減弱CTX處理對卵巢顆粒細胞活力和凋亡的影響。

綜上所述,本研究揭示了BMSC來源的外泌體miR-22-3p在卵巢顆粒細胞損傷中的保護作用,拓展了對外泌體生物學功能的認識,為卵巢早衰的防治提供了新的策略。但本研究所用的臨床數據較少,得到的結果只是在單個細胞模型中驗證,存在模型單一問題,還有待進一步研究。