基于快速型心律失常大鼠模型優選白喉烏頭炮制品*

崔夢茹，趙翡翠，聶繼紅，張海英，趙生俊△

（1. 新疆醫科大學第四臨床醫學院，新疆烏魯木齊 830000； 2. 新疆醫科大學附屬中醫醫院，新疆烏魯木齊 830000； 3. 新疆中藥炮制研究重點實驗室，新疆烏魯木齊 830000）

快速型心律失常可導致心排血量驟減甚至出現循環中斷，繼而發生重要器官缺血缺氧，臨床表現為心源性休克、心絞痛。其中，持續性室性快型性心律失常和心房顫動（簡稱房顫）伴快速心室率可導致血流動力學惡化，需緊急治療［1］。目前，臨床常用的抗心律失常藥物有鈉離子通道阻滯劑、β 腎上腺素能受體阻滯劑、延長動作電位間期藥物和鈣離子通道阻滯劑。多數抗心律失常藥物有致心律失常、損害心功能及心外臟器的副作用［2］。藥用植物中存在許多具有顯著藥理活性的天然成分，在抑制心律失常方面具有獨特優勢［3］。白喉烏頭收載于《哈薩克藥志》［4］等文獻，為毛茛科烏頭屬的多年生草本植物，主要分布于甘肅、新疆及東北地區。該藥材根部供藥用，其性大熱，味辛、苦，有毒，有祛風散寒、消腫止痛、通經活絡之功，多用于風寒濕痹等疾病的治療。白喉烏頭主要成分高烏甲素還具有抗炎、鎮痛、抗心律失常、抗腫瘤等作用［5-7］。高烏甲素及其水解產物刺烏寧在相應的有效劑量范圍內，室性期前收縮（又稱室性早搏）潛伏期、室性心動過速（簡稱室速）發生率、心律失常完全抑制率等與其呈劑量相關性［8-9］。白喉烏頭生品毒性較大，可通過炮制降低毒性，其中以藥典法和哈薩克族炮制法炮制品的毒性較小，前期研究表明，哈薩克族炮制法對白喉烏頭具有較好的減毒增效作用［10-11］。為此，本研究中基于快速型心律失常大鼠模型優選白喉烏頭哈薩克族炮制法炮制品?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：BL-420S型生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；FA2004N 型精密電子天平（上海菁海儀器有限公司，精度0.1 mg）；xMarkTM型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；E200型生物顯微鏡（日本Nikon公司）。

試藥：烏頭堿對照品（成都曼思特科技有限公司，批號為A0196，含量≥98%）；注射用胺碘酮（法國Sanofi - Aventis 公司，批號為DA019）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、肌酸激酶同工酶MB（CK -MB）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）及三磷酸腺苷（ATP）酶檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為A001-3-2，A003-1-2，A016-2-2，H197，H197）；免疫組化染色孵育盒（福州邁新生物技術開發有限公司，批號為BOX-1001）。白喉烏頭，采自新疆伊犁哈薩克自治州尼勒克縣，經新疆醫科大學附屬中醫醫院李永和主任中藥師鑒定為正品。

動物：Wistar 大鼠96 只，4～6 周齡，雌雄各半，體質量（180±20）g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號SCXK（新）2018-0002，實驗動物使用許可證號SYXK（新）2018 - 0003。飼養環境溫度（23±3）℃，相對濕度40%～70%。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備

白喉烏頭炮制品：采用哈薩克族炮制法炮制。分別稱取500 g 白喉烏頭生品8 份，分為2 組；第1 組每份加10倍量水浸泡24 h后，加入8%甘草和10%黑豆與其共同煎煮1，2，3，4 h，分別命名為24 h - 1 h 組、24 h -2 h 組、24 h-3 h 組、24 h-4 h 組。第2 組每份僅浸泡時間縮短為12 h，其余條件不變，分別命名為12 h-1 h組、12 h-2 h 組、12 h-3 h 組、12 h-4 h 組。煎煮完成后取出切片，晾干，烘箱烘干備用。

白喉烏頭炮制品藥液：取白喉烏頭生品及8種炮制品各200 g，加8 倍量水浸泡0.5 h，加熱煮沸30 min，4層紗布重合平鋪過濾，濾渣加8倍量水煎煮，重復2次，合并3 次濾液，制成水煎液-95%乙醇（2.5∶1，V/V）成品，置4 ℃下80 h，2 000 r/min 離心12 min，取上清液，置65 ℃恒溫水浴鍋內，濃縮成300%的藥液。

1.2.2 建模、分組及給藥

將96 只大鼠隨機分為空白對照組（等體積生理鹽水），模型組（等體積生理鹽水），白喉烏頭生品藥物組（簡稱生藥組，0.4 g/kg），白喉烏頭炮制品8 個組（1.2 g/kg，分別記為12 h-1 h 組、12 h-2 h 組、12 h-3 h組、12 h-4 h組、24 h-1 h組、24 h-2 h組、24 h-3 h組、24 h - 4 h 組），胺碘酮組（5 mg/kg），各8 只。各組大鼠每天1次灌胃相應藥物或生理鹽水，連續14 d后空白對照組大鼠尾靜脈注射等體積生理鹽水，其余各組大鼠均注射10 mg/mL烏頭堿（3.125 mg/kg）以復制快速型心律失常模型。

1.2.3 觀察指標

心電圖（ECG）：末次給藥1 h 后，麻醉，仰臥固定大鼠，皮下插針，以生物信號采集系統記錄大鼠Ⅱ導聯ECG，先記錄穩定5 min 的ECG，動態記錄大鼠ECG 20～30 min，記錄大鼠心律失常［早搏、室速、心室顫動（室顫）］的持續時間，以及大鼠死亡時間（如未死亡，僅記錄為“未死亡”）。

心臟組織病理形態：取大鼠心臟組織，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切5 μm厚片，用二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水后，蘇木素-伊紅（HE）復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

血清學指標：取大鼠腹主動脈血，4 ℃下，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，采用ELISA 法檢測大鼠血清中的SOD，MDA，CK-MB，cTnI的水平。

心臟組織ATP酶：取大鼠心臟組織適量，勻漿，檢測Na+，K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶的活性。

心臟組織Cx45 蛋白表達：取“心臟組織病理形態”項下二甲苯脫蠟成品，梯度乙醇水化，抗原修復，去除內源性過氧化物酶，孵育（一抗、二抗分別稀釋1 000倍、2 000倍），染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 ECG

模型組大鼠均出現早搏、室顫、室速癥狀。12 h-1 h組、12 h-2 h 組、12 h-3 h 組、12 h-4 h 組、24 h-2 h 組、24 h - 3 h 組、24 h - 4 h 組、胺碘酮組大鼠均僅出現早搏及室速癥狀，但平均出現時間均顯著晚于模型組（P＜0.01）；24 h-1 h 組大鼠未出現室顫、室速和早搏癥狀。詳見表1。

表1 各組大鼠早搏、室速、室顫出現時間比較Tab.1 Comparison of the occurrence time of premature beats，ventricular tachycardia and ventricular fibrillation in each group

2.2 血清學指標

與空白對照組比較，模型組大鼠的血清SOD 水平顯著降低，MDA，cTnI，CK - MB 水平均顯著升高；與模型組比較，生藥組、炮制品8個組、胺碘酮組大鼠的血清SOD水平均顯著升高，生藥組、12 h-1 h組、12 h-2 h組、24 h-1 h組大鼠的血清MDA水平均顯著降低（P＜0.05），各給藥組（除24 h-2 h 組、24 h-3 h 組外）cTnI 水平均顯著降低（P＜0.05），各給藥組（除24 h - 3 h 組外）大鼠血清CK-MB水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠血清學指標比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of serological indicators in each group（X ± s，n = 6）

表2 各組大鼠血清學指標比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of serological indicators in each group（X ± s，n = 6）

注：與空白對照組比較，#P ＜0.05。表3同。Note：Compared with those in the blank control group，#P ＜0.05（for Tab.2 - 3）.

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2.3 心臟組織ATP 酶

與空白對照組比較，模型組大鼠心臟組織的Na+，K+-ATP 酶及Ca2+-ATP 酶、Mg2+-ATP 酶活性均顯著減弱（P＜0.05）。與模型組比較，24 h-2 h 組、24 h-3 h 組、胺碘酮組大鼠心臟組織的Ca2+-ATP 酶活性均顯著增強（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠心臟組織ATP酶活性比較［±s，μmol/（mg·h），n=6］Tab.3 Comparison of ATPase activity in cardiac tissue in each group［X ± s，μmol /（mg·h），n = 6］

表3 各組大鼠心臟組織ATP酶活性比較［±s，μmol/（mg·h），n=6］Tab.3 Comparison of ATPase activity in cardiac tissue in each group［X ± s，μmol /（mg·h），n = 6］

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2.4 心臟組織病理形態

空白對照組大鼠的心肌纖維排列規則，心肌細胞形態正常，可見橫紋，細胞核、細胞質染色均勻，間質緊密，未見明顯異常。模型組大鼠的心肌纖維排列紊亂，部分纖維斷裂，消失，心肌細胞形態不規則，可見較多核固縮，細胞質紅染，間質疏松，出血，可見炎性細胞散在或灶狀浸潤。與模型組比較，生藥組大鼠的心肌細胞水腫，空泡變性，壞死區域增大，浸潤炎性細胞數量增多，間質疏松程度增加；炮制品8 個組大鼠的心肌纖維排列紊亂程度降低，心肌細胞水腫、損傷程度降低，損傷范圍縮小，浸潤炎性細胞數量未明顯減少。詳見圖1。

A. 空白對照組 B. 模型組 C. 胺碘酮組 D. 生藥組 E - L. 炮制品8個組圖1 大鼠心臟組織病理形態（HE，×400）A.Blank control group B.Model group C.Amiodarone group D.Raw drug group E - L.Eight processed product groupsFig.1 Pathological morphology of cardiac tissue in rats（HE，× 400）

2.5 Cx45 蛋白表達

與空白對照組比較，模型組大鼠的Cx45 蛋白表達水平顯著降低；與模型組比較，胺碘酮組、炮制品8個組大鼠的Cx45 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；生藥組大鼠的Cx45 蛋白表達水平稍升高，但無顯著差異（P＞0.05）。詳見圖2。

3 討論

烏頭堿所誘導的心律失常動物模型是經典的藥理學建模方法［12］，烏頭堿激活心肌細胞Na+通道，使Na+內流增加，從而影響心肌細胞線粒體功能、細胞膜離子通道、縫隙連接及誘導細胞凋亡和氧化損傷等，誘發心律失常（如早搏、室速、室顫）。SOD 的主要功能是催化超氧陰離子的歧化反應，被看作活性氧防御的第一線；MDA 是過氧化脂質的一種重要的分解產物，兩者用作評價脂質過氧化程度。心肌缺血后SOD 活性減弱，而MDA 含量增加，細胞受氧自由基攻擊的程度加重，且清除超氧陰離子的能力減弱，導致心肌細胞受損加劇。CK-MB 主要位于心肌組織中，心肌壞死后被釋放入外周血中，而cTnI 是心肌細胞死亡最敏感和最特異的標志物，兩者均作為心肌損傷的標志性診斷指標。本研究結果表明，白喉烏頭炮制品對烏頭堿所致心肌損傷有一定修復能力，并可提高心臟組織抗氧化損傷的能力。

心肌細胞幾乎全部依賴有氧代謝產生的ATP以供細胞生存及做功的需要，ATP的產生和儲存均在線粒體中進行，線粒體中ATP 酶的活性在維持心肌細胞及胞內鈣鎂的穩態方面可發揮重要作用。心肌缺血缺氧時，線粒體中Mg2+含量減少，而Na+和Ca2+含量增多，可能引起能量代謝障礙，使依賴于ATP 的Na+，K+-ATP 酶及Ca2+，Mg2+-ATP 酶活性減弱，致使心肌能量代謝出現障礙［13-14］。本研究結果表明，白喉烏頭炮制品對烏頭堿所致心肌細胞能量代謝障礙有一定修復能力，可促進能量代謝。

HE 染色主要用于觀察細胞內部的形態結構；顯微鏡下大體可觀察到心肌纖維的排列、心肌細胞的形態及細胞核、細胞質染色是否均勻，間質是否緊密；借此可判定心肌損傷的程度。本研究結果可知，生藥組小鼠的心肌細胞水腫，空泡變性，壞死區域增大，表明生藥對心肌細胞毒性較大；炮制品8個組大鼠的心肌纖維排列紊亂程度降低，心肌細胞水腫、損傷程度降低，損傷范圍減小，表明白喉烏頭經炮制后毒性降低，對烏頭堿所致心肌細胞損害有一定防護作用。

縫隙連接（GJ）是由連接相鄰2 個細胞之間的連接通道排列而成的一種特殊膜結構，構成縫隙連接的基本單位是連接蛋白Cx。研究顯示，在成年人心臟組織中Cx43 含量最豐富，主要存在于工作心肌細胞內。Cx40 及Cx45 含量較少，Cx40 主要分布于心房及近端傳導系，Cx45 分布于整個傳導系統，是竇房結和房室結縫隙連接的主要成分?？梢?，心臟不同部位Cx 的表達和分布情況與其電傳導功能密切相關［15］。顯微鏡下觀察Cx45 的表達，可對比心肌損傷程度的差異［16］。本研究結果表明，白喉烏頭炮制品可修復烏頭堿所致心肌損傷。

綜上所述，哈薩克族炮制法制成的白喉烏頭炮制品對模型大鼠快速型心律失常均有一定預防作用，其中以24 h-1 h炮制品效果較顯著。