高效液相色譜法同時測定口服五維賴氨酸葡萄糖中6 種成分含量*

譚菊英，劉莊蔚，何 虹，蔣 潔，楊欣智，吳明珍，朱健萍，鄧 鳴

（廣西壯族自治區食品藥品檢驗所，廣西南寧 530021）

口服五維賴氨酸葡萄糖收載于《化學藥品地方標準上升國家標準》第五冊［1］，主要成分有葡萄糖、鹽酸賴氨酸、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺、泛酸鈣。該品適用于貧血、肝炎等慢性病所致營養不良，葡萄糖補充熱量、治療低血糖癥，鹽酸賴氨酸維持肌體氮平衡，促進蛋白質的合成和代謝，促進人體生長發育及智力發育，維生素B1維持心血管系統、神經系統及消化系統的正常功能，維生素B2維持紅細胞完整性，維生素B6促進蛋白質代謝［1］。此外，泛酸鈣參與碳水化合物等的代謝［2-3］，煙酰胺與蛋白質的代謝及兒童智力發育關系密切，并可維持皮膚和消化器官的正常功能［4］。現行質量標準僅測定了方中葡萄糖的含量。為此，本研究中參考文獻［5-13］，建立了同時測定制劑中6 種成分含量的高效液相色譜（HPLC）法，為其質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型HPLC 儀，包括二極管陣列檢測器、四元泵等（日本Shimadzu 公司）；XS205 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；9983 型超聲儀（寧波海曙科生超聲設備有限公司）。

1.2 試藥

5 批口服五維賴氨酸葡萄糖樣品及混合空白輔料（葡萄糖、蔗糖、蜂乳的混合物）均源于某企業；泛酸鈣對照品（批號為100369 - 201905，按C17H20N4O6計含量為96.8%），煙酰胺對照品（批號為100115 - 202005，按C6H6N2O 計含量為99.9%），維生素B6對照品（批號為100116 - 201906，按C8H11NO3·HCl 計含量為99.9%），鹽酸賴氨酸對照品（批號為140673 - 202010，按C6H14N2O2·HCl 計含量為99.9%），維生素B2對照品（批號為100369-201905，按C17H20N4O6計含量為98.2%），維生素B1對照品（批號為100390 - 201806，按C12H17ClN4OS·HCl 計含量為97.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：5 mmol/ L 庚烷磺酸鈉溶液（用20%磷酸水溶液調pH 至2.5，A）- 乙腈（B），梯度洗脫（0～45 min 時95%A →77%A，45～57 min 時77%A，57～58 min 時77%A →95%A，58～65 min時95%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：200 nm（泛酸鈣、鹽酸賴氨酸），261 nm（煙酰胺、維生素B2、維生素B1），290 nm（維生素B6）；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取各對照品適量，以0.1%磷酸水溶液溶解，制成泛酸鈣、煙酰胺、維生素B6、鹽酸賴氨酸、維生素B2、維生素B1質量濃度分別為58.72，210.99，26.03，1 044.00，21.39，83.80 μg/ mL 的混合對照品貯備液。精密量取2 mL，置10 mL 容量瓶中，用0.1%磷酸水溶液定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取10包樣品內容物，混勻，研細，取約2 g，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加入0.1%磷酸水溶液6 mL，超聲（功率250 W，頻率45 kHz）振搖使溶解，放冷至室溫，用0.1%磷酸水溶液定容，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

輔料溶液：取混合空白輔料適量，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下3種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果輔料溶液色譜圖中，在與混合對照品溶液色譜圖相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖1。

1. 泛酸鈣 2. 煙酰胺 3. 維生素B6 4. 鹽酸賴氨酸5. 維生素B2 6. 維生素B1a. 混合對照品溶液 b. 供試品溶液 c. 輔料溶液A.200 nm B.261 nm C.290 nm圖1 高效液相色譜圖1.Calcium pantothenate 2.Niacinamide 3.Vitamin B6 4.Lysine hydrochloride 5.Vitamin B2 6.Vitamin B1a.Mixed reference solution b.Test solution c.Adjuvant solutionA.200 nm B.261 nm C.290 nmFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.2項下混合對照品貯備液0.2，0.5，0.7，1.0，1.6，2.0，3.0，4.0 mL，置10 mL容量瓶中，加0.1%磷酸水溶液定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液，各精密量取20 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系考察結果（n=8）Tab.1 Results of the linear relation test（n = 8）

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果泛酸鈣、煙酰胺、維生素B6、鹽酸賴氨酸、維生素B2、維生素B1峰面積的RSD分別為0.13%，0.05%，0.11%，0.30%，0.08%，0.06%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，4，8，12，18，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果泛酸鈣、煙酰胺、維生素B6、鹽酸賴氨酸、維生素B2、維生素B1峰面積的RSD分別為0.16%，0.10%，0.58%，1.00%，0.19%，0.23%（n= 6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品內容物適量，精密稱定，各6份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果泛酸鈣、煙酰胺、維生素B6、鹽酸賴氨酸、維生素B2、維生素B1含量的RSD分別為1.10%，0.41%，0.57%，1.77%，0.24%，0.70%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品適量，共6份，分別加入一定質量濃度的待測對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.4 樣品含量測定

取5 批樣品各適量，分別按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（%，n=3）Tab.3 Results of the content determination of six components in samples（%，n = 3）

3 討論

制劑中6 種待測成分均為水溶性，且部分極性較大，在色譜柱中保留較弱，故參考文獻［6］以庚烷磺酸鈉作為離子對試劑，增強了各物質的保留。預試驗中比較了2，5，10 mmol / L 庚烷磺酸鈉的分離效果，結果5 mmol/ L 時的保留時間適中；比較了流動相pH 為7.2，4.2，3.1，2.5的分離效果，發現pH為7.2時，各待測成分色譜峰為帆狀，泛酸鈣色譜峰保留時間僅2.8 min；在pH 由4.2 調至3.1，再調至2.5 的過程中，各峰對稱性變好，泛酸鈣保留時間延長，維生素B6和維生素B2出峰順序發生變化（pH 為4.2，2.5 時維生素B6在前，pH 為3.1時維生素B2在前），當pH為2.5時，各峰峰形及分離度均最優，可見pH 為2.5 時各待測成分以單一成分存在［12］。

經二極管陣列檢測器采集混合對照品溶液色譜圖后，提取待測成分的紫外圖譜，結果鹽酸賴氨酸、泛酸鈣無最大吸收（僅為末端吸收），煙酰胺、維生素B6、維生素B2、維生素B1的最大吸收波長分別為261，290，267，246 nm；維生素B1、維生素B2在261 nm波長處的響應值均約為最大吸收波長處響應值的95%。由于各成分的濃度及響應相差較大，選擇多波長檢測以快速簡捷地同時測定6種成分含量。

本品除鹽酸賴氨酸外的其他5 種成分含量均在處方量的90.0%～110.0%，鹽酸賴氨酸含量稍偏低，推測原因為本品含具有還原性的葡萄糖，而鹽酸賴氨酸含有氨基，兩者可在濕熱條件下發生美拉德反應［14-15］，導致此類化合物含量減少，加之該企業使用的生產工藝為濕法制粒、熱風干燥，為美拉德反應提供了條件，故認為鹽酸賴氨酸含量偏低的原因可能為發生了美拉德反應，建議企業加以重視。

綜上所述，本研究中所建立的方法專屬性好，結果準確，能有效測定口服五維賴氨酸葡萄糖中6種成分的含量，且該方法有效彌補了現行質量標準的缺陷，可用于該產品的質量控制。