紅景天苷調控NF-κB、Bcl-2 信號通路對煙霧暴露大鼠氧化應激及肺血管內皮細胞凋亡的影響*

粟治勝 王曉江 李 正△ 劉 東

（1.重慶市九龍坡區人民醫院，重慶 400050；2.重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶 400016）

香煙暴露是導致肺損傷的病理過程之一。吸煙使得繼發呼吸道細菌反復感染加劇，導致肺部疾病的發病率和死亡率不斷增高，嚴重威脅人們身體健康［1］。對煙霧型肺損傷進行預防，并在發病機制中找尋延緩損傷的藥物是研究的關鍵問題。核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路是一種多向性轉錄因子，與B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）均存在于血管內皮細胞、平滑肌細胞及心肌細胞中，可參與多種細胞核基因轉錄，并在眾多疾病的炎癥級聯反應與慢性炎癥作用下起調節血管內皮細胞活性的作用［2-3］。經研究，肺血管內皮細胞凋亡及肺泡血管床破壞可導致肺大皰產生繼而引發肺病，而慢性炎癥、蛋白水解、抗蛋白水解活性及氧化應激等的失衡均可增加肺部內皮細胞凋亡［4］。紅景天苷（SDS）是紅景天中主要的藥物提取物，其藥理作用包括抗心肌缺血、延緩衰老、抗輻射、抗腫瘤血管新生、抗肝纖維化、抗炎抗氧化等，是中醫治療的常用藥材［5］。經研究，SDS 具有抗活性氧、過氧化氫所致的血管內皮功能障礙機制，對改善微重力環境誘導的肺部微血管內皮功能障礙有效［6-7］。本文主要探究SDS調控Bcl-2、NF-κB 信號通路影響煙霧暴露大鼠氧化應激及肺血管內皮細胞凋亡的機制，意在為臨床研究提供有力依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，年齡41 d，體質量（150±10）g，由南方醫科大學動物學部提供，使用許可證號：SCXK（湘）2020-0025。所有大鼠均在肺病中心實驗室飼養，飼養溫度18～25 ℃，相對濕度40%～60%，該實驗經過動物倫理委員會批準同意，動物倫理編號：A2009029。

1.2 試藥與儀器

1）藥物：紅景天苷（中國生物制品檢驗檢定所，批號：090818-20040），用時以0.02%的氯化鈉溶液溶解（pH7.0）。醋酸潑尼松（湖北奧翔醫藥化工有限公司，EP8.0）。2）試劑與儀器：Bcl-2、NF-κB（Abcam 公司，ab59348、ab16502）、Bax（CST 公司，#2772）、CD31 抗體（美國Santa Cruz公司，b59348），紅梅（軟黃）香煙（紅塔煙草集團有限責任公司，每包含焦油量12 mg、煙氣煙堿量1.1 mg、煙氣一氧化碳量13 mg），二甲苯（國藥集團化學試劑公司，10023418），中性樹膠（國藥集團化學試劑公司，10004160），電泳儀（北京市六一儀器廠，DYY-6C），伊紅染液（ASPEN 公司，AS1094），流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特，CytoFLEX），包埋機（武漢俊杰電子有限公司，JB-P5），戊巴比妥鈉（湖北奧翔醫藥化工有限公司，EP8.0），切片機（上海徠卡儀器有限公司，RM2016）。

1.3 模型建立

除對照組10 只大鼠外，其余均依據文獻［8］建立煙霧暴露模型。將大鼠放在自制玻璃染毒箱的隔層上，自由進食飲水及活動，于玻璃箱下1/2處點燃香煙，每周進行5 d，每天2 次，每次煙霧處理1 h，每次間隔5 h以上，香煙量為10支/次。連續干預30 d，當大鼠出現反應遲鈍、呆滯等意識障礙，呼吸急促（雙側胸廓急速運動），低氧血癥（SaO2＜90%或動脈分壓≤60 mmHg，1 mmHg ≈0.133 kPa），Micro-CT 檢測出現兩肺彌漫性滲出影為建模成功。

1.4 分組與給藥

將60只大鼠隨機分為對照組、模型組、SDS 10 mg/kg、SDS 40 mg/kg、SDS 70 mg/kg、PNS 組，每組10 只。依據文獻［9］，SDS 高、中、低劑量組分別按70、40、10 mg/kg給予混懸液2 mL灌胃，并均以0.02%的氯化鈉溶液溶解（pH7.0）；醋酸潑尼松（PNS）組大鼠給予混懸液3.6 mg/kg灌胃；對照組與模型組大鼠每日采用等量生理鹽水灌胃。各組均每日給藥1次，連續21 d。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶（SOD）、硫代巴比妥酸法檢測丙二醛（MDA） 將大鼠用1%戊巴比妥鈉按50 mg/kg 經腹腔注射麻醉后，抽取尾部靜脈血2 mL 行SOD 檢測，將血清于37 ℃下水浴30 min，波長500 nm 處行蒸餾水凋零，酶標儀測每孔OD 值，繪制標準曲線，依據［（對照OD 值-測定OD 值）÷對照OD值］÷50%×反應體系的稀釋倍數×檢測樣本前的稀釋倍數計算SOD 值。取大鼠血清，按照說明書將配好的試劑混勻于90 ℃水浴，冷卻30 min，3 000 r/min 離心15 min，取上清液，酶標儀500 nm 處測每孔OD 值，繪制標準曲線，并依據［（對照OD 值-空白OD 值）÷標準OD 值-空白OD 值］×標準品濃度（10 mol/mL）×檢測樣本前的稀釋倍數計算MDA值。

1.5.2 HE染色 采用戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠后，取肺組織樣品10 mg 經梯度濃度酒精脫水，放置于二甲苯中透明，石蠟包埋、切片、脫蠟，使用10%中性甲醛固定，依次梯度酒精脫水后沖洗，烘烤后進行蘇木素-伊紅染色，封片后于顯微鏡下觀察拍照。

1.5.3 肺血管內皮細胞的鑒定 將經免疫磁珠純化分離得到的肺血管內皮細胞接種在培養板上，靜置培養24 h，37 ℃PBS 漂洗3次，4 ℃4%多聚甲醛溶液固定15 min，加一抗兔抗大鼠CD31 抗體，4 ℃孵育過夜，PBS 代替一抗，與FITC 標記的羊抗兔IgG 37 ℃孵育30 min，DAPI 作用10 min，沖洗甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5.4 流式細胞儀檢測肺血管內皮細胞凋亡 取肺組織微血管段碾碎研磨，加0.25%胰蛋白酶消化2 h，得細胞懸液，取流式管加200 μL 細胞懸液，5 μL Annexin V-FITC 避光反應15 min，加5 μL PI 染液及200 μL 1 m×Tris Buffer 緩沖液，1 h 內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5.5 免疫印跡檢測Bcl-2、NF-κB、磷酸化NF-κB、Bcl-2相關X因子（Bax）蛋白表達 取大鼠肺組織提取細胞總蛋白，BCA 法測蛋白濃度，取50 μg 蛋白樣品行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉移至PVDF膜封閉過夜，兔多克隆抗體Bcl-2（1∶3 000）、NF-κB（1∶5 000）、p-NF-κB（1∶3 000）、Bax（1∶2 000）、β-actin（1∶2 000），孵育1 h，TBS 洗滌，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000）孵育2 h，TBS洗滌后浸液、曝光、顯影后觀察結果。

1.5.6 PCR 檢測Bcl-2、NF-κB、p-NF-κB、Bax mRNA表達 Trizol 法提取總RNA，取1 μL 總RNA，按RTPCR試劑盒說明逆轉錄合成cDNA，條件：50 ℃30 min、90 ℃5 min、40 ℃5 min，cDNA 產物PCR 擴增，引物及反應條件。見表1。150 V 下3%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并照相，分析電泳條帶灰度值，以各組與β-actin 灰度值比表示該組Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB 相對表達量，PCR產物量以光密度×面積表示。

表1 引物序列

1.6 統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析。計數資料以“n、%”表示。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 建模后大鼠Micro-CT檢測表達

Micro-CT 檢測結果顯示，對照組大鼠肺部未見明顯炎癥改變，模型組大鼠肺部炎癥大面積分布于兩肺且水腫、出血嚴重，見圖1。

圖1 Micro-CT檢測結果

2.2 各組大鼠血清中SOD、MDA表達比較

見表2。藥物干預后，SDS 70 mg/kg組的SOD 升高及MDA 降低最為顯著，差異有統計學意義（P＜0.05），且模型組與SDS 10 mg/kg 組比較無明顯差異（P＞0.05），SDS 40 mg/kg 組與PNS 組比較無明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清中SOD、MDA表達比較（±s）

表2 各組大鼠血清中SOD、MDA表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與SDS 70 mg/kg組比較，▲P ＜0.05。下同。

MDA（nmol/mg）5.54±0.08 22.91±5.52*22.89±5.49*▲16.38±3.33*#▲9.25±1.49*#16.40±3.32*#▲組 別對照組模型組SDS 10 mg/kg組SDS 40 mg/kg組SDS 70 mg/kg組PNS組n 10 10 10 10 10 10 SOD（U/mg）218.35±36.83 113.02±19.02*109.85±18.96*▲152.63±12.96*#▲174.12±15.11*#150.59±13.05*#▲

表3 各組大鼠肺血管內皮細胞凋亡表達比較（%，±s）

表3 各組大鼠肺血管內皮細胞凋亡表達比較（%，±s）

組 別對照組模型組SDS 10 mg/kg組SDS 40 mg/kg組SDS 70 mg/kg組PNS組n 10 10 10 10 10 10凋亡率3.61±0.25 40.02±10.02*39.83±10.03*▲27.09±8.96*#▲16.12±5.21*#27.10±9.05*#▲

2.3 各組大鼠肺組織HE染色

對照組大鼠肺組織結構完好；模型組肺組織損傷嚴重；藥物干預后，各組肺損傷均有所緩解，其中SDS 70 mg/kg 組肺泡間隔增厚減輕，水腫、細胞增生、腔內分泌物均改善，管周及肺泡壁有極少炎性細胞浸潤，見圖2。

圖2 各組肺組織形態（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠肺血管內皮細胞凋亡表達比較

藥物干預后，SDS 70 mg/kg 組的血管內皮細胞凋亡降低最為顯著，差異有統計學意義（P＜0.05），且模型組與SDS 10 mg/kg 比較無明顯差異（P＞0.05），SDS 40 mg/kg 與PNS 組比較無明顯差異（P＞0.05）。見表3、圖3。

圖3 各組大鼠肺血管內皮細胞凋亡表達

2.5 各組大鼠肺組織中Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB mRNA表達比較

見表4。藥物干預后，SDS 70 mg/kg 組的Bax、NFκB、p-NF-κB mRNA 降低，Bcl-2 mRNA 升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；但模型組與SDS 10 mg/kg 組比較無明顯差異（P＞0.05），SDS 40 mg/kg 組與PNS 組比較無明顯差異（P＞0.05）。

表4 各組大鼠肺組織中Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB mRNA表達比較（±s）

表4 各組大鼠肺組織中Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB mRNA表達比較（±s）

組 別對照組模型組SDS 10 mg/kg組SDS 40 mg/kg組SDS 70 mg/kg組PNS組n 10 10 10 10 10 10 Bcl-2 1.00±0.00 0.09±0.04*0.10±0.04*▲0.29±0.08*#▲0.52±0.10*#0.30±0.09*#▲Bax 1.00±0.00 4.14±1.25*4.12±1.23*▲3.05±1.08*#▲1.83±0.66*#3.02±1.03*#▲NF-κB 1.00±0.00 3.82±0.55*3.79±0.56*▲2.32±0.38*#▲1.68±0.21*#2.29±0.35*#▲p-NF-κB 1.00±0.00 3.75±0.52*3.69±0.46*▲2.30±0.30*#▲1.71±0.20*#2.25±0.32*#▲

2.6 各組大鼠肺組織Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB 蛋白表達比較

藥物干預后，SDS 70 mg/kg 組的Bax、NF-κB、p-NF-κB 降低，Bcl-2 升高，差異有統計學意義（P＜0.05），且模型組與SDS 10 mg/kg 組比較無明顯差異（P＞0.05），SDS 40 mg/kg 組與PNS 組比較無明顯差異（P＞0.05），見表5、圖4。

圖4 各組Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB蛋白條帶

表5 各組Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達比較（±s）

表5 各組Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達比較（±s）

組 別對照組模型組SDS 10 mg/kg組SDS 40 mg/kg組SDS 70 mg/kg組PNS組n 10 10 10 10 10 10 Bcl-2 1.00±0.00 0.21±0.04*0.25±0.04*▲1.82±0.29*#▲2.23±0.73*#1.83±0.30*#▲Bax 1.00±0.00 4.22±1.27*4.20±1.26*▲3.10±1.11*#▲1.91±0.70*#3.13±1.13*#▲NF-κB 1.00±0.00 3.87±0.58*3.84±0.56*▲2.37±0.38*#▲1.73±0.23*#2.35±0.39*#▲p-NF-κB 1.00±0.00 3.79±0.50*3.75±0.47*▲2.26±0.32*#▲1.68±0.20*#2.24±0.35*#▲

3 討 論

肺病時期代謝過程中會產生大量活性氧引發脂質過氧化，使氧化應激平衡被破壞，造成氧化應激反應進而影響組織功能［10］。本研究中，藥物干預后，SDS 70 mg/kg 組的SOD 升高及MDA 降低最為顯著，提示高濃度的SDS對改善煙霧暴露大鼠的氧化應激反應具有一定功效。經研究，氧化應激是由機體內氧化與抗氧化因子相互作用產生氧化中間產物而引起的反應。在肺病中氧化應激發生與SOD、MDA 失衡相關，可通過啟動多種基因的活性促進惡性生物學行為，大量中性粒細胞浸潤促使過多氧化中間產物生成，推動氣道炎癥，進而對肺造成損害［11-12］。SDS具有降血壓、提高免疫力、抗氧化、消炎等多種藥理學作用，臨床可用于治療冠心病、糖尿病等。王艷等［13］在SDS 對機械通氣致小鼠急性肺損傷的保護作用研究中表示，SDS 可通過降低肺內活性氧自由基引起的脂質過氧化反應和MDA，并通過水解過氧化氫和調節SOD 抑制過量活性氧自由基，維持肺內活性氧自由基平衡，改善肺損傷時期氧化應激反應。本研究結果與之類似。

研究發現，肺損傷時肺血管內皮細胞能以細胞凋亡方式出現，但其引發凋亡的機制可受多因素調控［14］。本研究中，藥物干預后，SDS 70 mg/kg 組的血管內皮細胞凋亡降低最為顯著，表示SDS 對肺損傷大鼠的肺血管內皮細胞凋亡具有一定抑制作用。相關研究表示，在煙熏慢性氣道炎癥環境下，會使炎癥因子和凋亡執行蛋白升高，導致肺部氣道黏膜腫脹、彌漫性肺氣腫、肺組織氣道及毛細血管內皮凋亡產生，進而促進肺部疾病與肺損傷加重［15］。現代藥理學研究表示，SDS 對肝臟、心血管和神經具有保護作用，其作用機制可能是由其抗氧化、抗炎的藥理作用所引起的。高全清等［16］在通過SDS 改善血管內皮舒縮功能實驗研究中表示，SDS 可使肺部炎癥因子和促凋亡執行蛋白顯著下降，進而改善慢性氣道炎癥導致的氣道黏膜腫脹，逆轉了肺泡隔之間血管稀薄及肺泡間隔擴大的融合趨勢，降低了肺組織氣道與毛細血管內皮凋亡。本研究與之結果相類似。

肺組織是機體合成多種效應分子的主要部位之一且過程與Bcl-2、Bax、NF-κB 等信號通路具有一定相關性［17］。本研究中，藥物干預后SDS 70 mg/kg 組的Bax、NF-κB、p-NF-κB 降低及Bcl-2 升高最為顯著，表示SDS對煙霧暴露大鼠的Bcl-2、Bax、NF-κB表達具有一定調節作用。經研究，肺病發生時可使Bax、NF-κB信號通路被激活，Bcl-2 表達被抑制，活化的Bax、NFκB 發生核易位直接激活目的基因，使凋亡執行蛋白升高，加速了肺泡毛細血管內皮凋亡［18］。李倩等表示，SDS 可能通過甲基化讓SOCS3 基因啟動子沉默，使凋亡調節信號變成抗凋亡調節信號，阻止凋亡執行蛋白激活，改善慢性氣道炎癥，抑制了肺泡壁組織及毛細血管內皮凋亡。SDS通過調節Bcl-2、Bax、NF-κB 信號通路比值以降低肺部自噬水平，并通過阻斷肺部特異位點上酪氨酸或絲氨酸磷酸化抑制下游激酶活化及肺泡巨噬細胞病理效應以降低肺損傷機制［19］。

綜上所述，SDS 可改善煙霧暴露大鼠氧化應激指標及肺組織病理結構，降低大鼠肺血管內皮細胞凋亡水平，其作用機制可能與調控經典凋亡相關信號通路Bax/Bcl-2及炎性相關因子NF-κB水平有關，但現階段對于SDS 具體作用機制尚未完全掌握，期望在日后實驗中進行驗證和補充。