擬南芥TRX-h5基因的克隆和表達分析

穆秀杰, 張林林, 韓 毅

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

干旱、重金屬、紫外線等不利因素會影響植物自身的生長、發育。為了適應環境,植物演化出一套完整的氧化還原調節系統來維持體內內環境氧化還原的平衡。植物受到外界刺激時,會在體內產生大量的活性氧(reactive oxide species,ROS)分子,如過氧化氫、羥基自由基以及超氧陰離子等[1]。高水平的ROS對植物有毒害作用,ROS的清除分為酶促系統和非酶促系統2種,得以維持細胞內氧化還原水平的穩態[2-4]。酶促系統包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等;維生素C、還原型谷胱甘肽、類黃酮等[5]構成非酶促系統。近期研究表明,ROS還可以作為信號分子[6],參與病原體防御、調節氣孔關閉及生長發育等過程。ROS產生后,其自身作為信號分子激發磷酸化級聯反應、鈣信號及激素介導的信號通路,以此做出防御。因此,生物體內的ROS在一個合適的水平才得以維持細胞內生理生化反應的正常進行。

擬南芥硫氧還蛋白(TRX-h)是一個由19個基因編碼的小分子蛋白,基因定位于細胞質、葉綠體、線粒體等,內質網和細胞核中也存在TRX-h蛋白[7],但功能尚不清楚。TRX-h基因家族成員的表達水平及表達模式各不相同,表明各自具有特異的功能[8]。擬南芥TRX-h1至TRX-h5 mRNA 在地上器官(如幼葉、成熟葉、長角果、花芽、花)中豐度高,而莖中豐度低些。TRX-h2、TRX-h4和TRX-h5在根中表達量很低,TRX-h1和TRX-h3 mRNA在根中根本檢測不到。通常情況下,TRX-h蛋白以還原形式存在,并且具有清除ROS的功能[9-10]。有研究顯示,棉花硫氧還蛋白參與花期調控[11],在黃萎病菌入侵后,棉花體內硫氧還蛋白豐度提高,這表明硫氧還蛋白參與了這一防御過程。此外,在煙草中過表達γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶,體內TRX-h基因的轉錄水平顯著增強,進而增強了對丁香假胞菌的耐受性[12]。

本研究從野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia(Col-0)中克隆了TRX-h5基因,并對其進行生物信息學分析,為探索該基因的蛋白功能提供了理論依據。同時將TRX-h5基因的第39位和第42位半胱氨酸位點突變(TRX-h5M),探究該位點對TRX-h5蛋白活性的影響,為研究TRXs蛋白參與調控的ROS信號通路提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

野生型擬南芥植株Col-0、EYFP-TRX-h5-C39S-C42S(TRX-h5M)重組載體、表達載體pET28a(+)、大腸桿菌DH5α克隆菌株、大腸桿菌BL21表達菌株均由本實驗室保存。

1.1.2 實驗試劑與儀器

反轉錄酶、dNTP聚合物、高保真酶、限制性內切酶(XhoⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ、HindⅢ)、T4DNA連接酶、咪唑(C3H4N2)、His標簽鎳柱、質粒提取試劑盒、切膠純化試劑盒、瓊脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨、氯化鈉、卡納霉素(工作質量濃度為50 μg/mL)。

本實驗所用主要儀器有聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀、凝膠成像儀分析系統、電泳儀、高溫高壓滅菌鍋、恒溫培養箱、超凈工作臺、搖床、超聲波細胞破碎儀、真空泵、超低溫離心機、恒溫培養震蕩器,紫外分光光度計、冷柜等。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析

用ExPASy-ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件對TRX-h5基因編碼的氨基酸進行基本理化性質的分析;采用ProtScale在線工具(https://web.expasy.org/protscale/)對TRX-h5蛋白進行親/疏水性分析;采用PSORT Prediction(http://psort1.hgc.jp/form.html)在線軟件分析TRX-h5蛋白的亞細胞定位;采用 NetPhos3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線軟件對TRX-h5蛋白進行磷酸化位點分析;利用美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數據庫BLUST工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析TRX-h5蛋白的保守功能結構域;采用 NPS@: SOPMA secondary structure prediction 和SWISS-MODEL預測TRX-h5蛋白的二級結構和三級結構。

1.2.2 引物設計與合成

首先從tair網站獲取TRX-h5基因的編碼序列(coding sequence,CDS),再使用Primer5.0設計引物。上游引物(NdeⅠ-FP):5’-GGAATTCCATATGATGGCCGGTGAAGGAGAAG-3’(下劃線部分為NdeⅠ酶切位點);下游引物XhoⅠ-RP:5’-CCGCTCGAGTCAAGCAGAAGCTACA AGACCACC-3’(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點)。

以EYFP-TRX-h5M重組載體為模板的上游引物(BamHⅠ-FP)為:AAAAGGATCCATG GCCGGTGAAGGAGAAG;下游引物(HindⅢ-RP)為:AAAAAAGCTTTCAAGCAGAAGCTA CAAGACCAC。

1.2.3 總RNA的提取和反轉錄

采用Trizol法提取RNA,利用反轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)獲得cDNA,反應體系為:2 μL的 5×PrimeScriptRT Mix,2 μg的 Total RNA,RNase Free ddH2O補齊至10 μL。反應條件為:25 ℃,10 min;42 ℃,30 min;85 ℃,5 min;4 ℃,3 min。

1.2.4TRX-h5基因的擴增和純化

以擬南芥cDNA為模板,擴增TRX-h5基因的CDS序列;以EYFP-TRX-h5M重組載體為模板擴增TRX-h5第39位和第42位點突變(C突變為S)的序列。PCR(5 μL)反應體系為:5.0 μL的10×buffer,4.0 μL 的dNTP,2.0 μL的FP,2.0 μL的RP,0.6 μL的高保真酶,2.0 μL的Template DNA,34.4 μL的ddH2O。PCR反應條件為:94 ℃預變性5 min;然后進行30個PCR循環(94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min);72 ℃延伸10 min。PCR程序結束后,瓊脂糖凝膠電泳驗證條帶大小是否正確,通過切膠純化的方式回收目的基因。

1.2.5 重組載體的構建和轉化

將TRX-h5的膠回收產物和PET28a(+)質粒使用XhoⅠ/NdeⅠ雙酶切;TRX-h5M膠回收和PET28a(+)使用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切。酶切后膠回收目的基因及線性化載體。連接反應16 ℃過夜。連接體系為:5×buffer和基因片段各2 μL,T4 DNA連接酶和ddH2O各1 μL,pET28a(+)線性化載體4 μL。

將連接后的產物轉化大腸桿菌 DH5α感受態細胞,用卡納霉素瓊脂平板篩選陽性克隆過夜培養。挑選陽性克隆進行PCR和雙酶切鑒定,鑒定為陽性的重組質粒,送至生工生物工程股份有限公司進行測序,測序正確后,將重組載體命名為pET28a(+)TRX-h5、pET28a(+)TRX-h5M,將重組載體轉化BL21感受態細胞。

1.2.6 目的蛋白的誘導表達及純化

將轉化大腸桿菌 BL21的陽性單菌落先小搖后大搖,在220 r/min、37 ℃的條件下搖至A600為0.6,加入誘導劑IPTG(終濃度0.2 mmol/L),22 ℃的條件下誘導16～24 h。

誘導后的菌液4 ℃,6 000 r/min離心20 min去上清。沉淀用solution1(0.3 mol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl,pH值7.6)按照每升誘導液加入30 mL的比例重懸,破細胞30 min,再用高速離心機4 ℃,12 000 r/min離心30 min取上清置冰上備用。

分別用solution1、solution2(20 mmol/LTris-HCl,0.3 mol/L NaCl,50 mmol/L咪唑,pH值7.6)洗脫雜蛋白,然后用solution3(20 mmol/L Tris-HCl,0.3 mol/L NaCl,0.3 mol/L咪唑,pH值7.6)洗脫目的蛋白。并利用透析袋除去咪唑,將蛋白保存在-80 ℃備用。

1.2.7 目的蛋白質量濃度和酶活的檢測

以牛血清蛋白為標準蛋白制作標準曲線,將目的蛋白稀釋合適的倍數后使用紫外分光光度計在595 nm波長下測吸光度值,計算蛋白質量濃度。TRX-h酶活測定反應體系包含100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 值7.0)、2 mmol/L EDTA和130 μmol/L牛胰島素(含或不含2 μmol/LTRX-h5)。通過添加0.33 mmol/L DTT啟動酶促反應。在650 nm處監測TRX-h5引起的濁度。

2 結果與分析

2.1 TRX-h5基因的基本理化性質分析

TRX-h5基因編碼一條含118個氨基酸的肽鏈,分子式為C594H933N149O169S8,相對分子質量為13 122.32,理論等電點為5.19,脂溶性指數為89.24。該蛋白的不穩定參數為26.74,屬于穩定性蛋白(小于40為穩定蛋白)。在氨基酸殘基的組成上,丙氨酸(Ala)和纈氨酸(Val)數目最多,各占11.9%。

使用NCBI Concserved Domain軟件對TRX-h5蛋白進行保守結構域分析,結果如圖1a所示。由圖1a可知,該蛋白屬于TRX家族。采用ExPASy-ProtScale對親疏水性進行分析,結果如圖1b所示。由圖1b可知,TRX-h5蛋白為親水性蛋白。對TRX-h5蛋白進行磷酸化位點預測分析,結果如圖1c所示。由圖1c可知,該蛋白含有3個磷酸化位點,分別是2個絲氨酸(Ser)、1個蘇氨酸(Thr)。

圖1 TRX-h5蛋白一級結構理化性質分析

2.2 二級結構和三級結構預測

TRX-h5蛋白的二級結構運用SOPMA在線軟件進行分析,如圖2a所示。

圖2 TRX-h5蛋白結構分析

從圖2a可以看出,該蛋白的二級結構包括α-螺旋(45.76%)、無規則卷曲(22.88%)、伸展鏈(19.49%)和β折疊(11.86%),α-螺旋和無規則卷曲為該蛋白二級結構的主要元件。

運用 SWISS-MODEL建模軟件對TRX-h5蛋白三級結構預測分析,模型是以同源建模的方式模擬,是在二級結構基礎上盤繞、折疊產生的特定空間結構,如圖2b所示。

2.3 TRX-h5的PCR擴增

以擬南芥野生型CDS為模板,以TRX-h5-F和TRX-h5為引物進行擴增,核酸瓊脂糖電泳檢測結果如圖3所示,擴增產物有一條特異性條帶,與擬南芥TRX-h5基因的大小相符(TRX-h5大小為357 bp)。

圖3 PCR擴增TRX-h5基因片段瓊脂糖電泳圖

2.4 PET28a(+)-TRX-h5載體的構建

提取陽性菌落質粒進行測序,結果顯示質粒中連接的目的基因與TRX-h5基因片段完全相符,未發生任何突變,將送去測序的菌落進行擴搖,提取質粒并轉入表達菌株BL21,挑取單克隆進行菌落鑒定。

本文利用Primer 5軟件在PET28a(+)載體上設計引物pET28a(+)-F(TAGTTATTGCTCAGCGGTGG)和pET28a(+)-R(TCATGAGCGCTTGTTTCGGC),利用PCR擴增,確認TRX-h5基因片段與載體是否成功連接。條帶在250～500 bp中間的位置,與實際大小357 bp相符,選取含目的基因的單克隆作為誘導菌種,如圖4所示。

圖4 菌落pET28a(+)-TRX-h5/BL21 PCR電泳圖

2.5 TRX-h5蛋白的誘導及純化

在22 ℃條件下,終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導12～16 h,SDS-PAGE電泳檢測誘導的蛋白表達情況。誘導表達后的BL21菌體通過超聲波細胞破碎儀得到表達后的蛋白,經鎳柱后,帶有His標簽的TRX-h5蛋白和TRX-h5M蛋白得以純化,如圖5所示。

圖5 蛋白SDS-PAGE電泳圖

圖5中:M代表Marker;泳道1代表誘導前蛋白表達情況;泳道2代表誘導后蛋白表達情況;泳道3代表樣品洗脫液;泳道4和泳道5代表雜蛋白的洗脫;泳道6和泳道7代表目的蛋白的洗脫。

由圖5可知,在接近14 kDa(TRX-h5分子量為13.1 kDa,6個組氨酸分子量為0.9 kDa)處出現單一的條帶,符合TRX-h5蛋白分子量大小。

2.6 TRX-h5蛋白的質量濃度及酶活檢測結果

以牛血清蛋白為標準蛋白制作標準曲線,如圖6所示。

圖6 TRX-h5、TRX-h5M蛋白的酶活測定

根據此標準曲線算出表達的TRX-h5蛋白質量濃度為0.4 μg/μL;TRX-h5M蛋白質量濃度為0.5 μg/μL。TRX-h5蛋白的2個半胱氨酸位點突變后,酶活力顯著降低。

3 討 論

在生長發育過程中,脅迫因子會使植物體內氧化還原狀態失去平衡,造成氧化脅迫。植物會演化出多種調節途徑和調節方式來對體內氧化還原狀態進行調節,以避免氧化性傷害的產生,其中主要的調節方式包括:活性氧的酶促清除和非酶促清除;與谷胱甘肽相關的氧化還原調節等方式。

擬南芥硫氧還蛋白是由118個氨基酸組成的小分子蛋白。對TRX-h5蛋白進行磷酸化位點預測分析,結果表明該蛋白含有3個磷酸化位點,分別是2個絲氨酸(Ser)、1個蘇氨酸(Thr)。TRX-h5是否參與了擬南芥氧化平衡的調節,這些磷酸化位點是否為TRX-h5蛋白的修飾位點,需要進一步探究。TRX-h5蛋白屬于穩定性蛋白,其二級結構元件包括α-螺旋(45.76%)、無規則卷曲(22.88%)、伸展鏈(19.49%)和β折疊(11.86%),α-螺旋和無規則卷曲為該蛋白二級結構的主要元件。

運用 SWISS-MODEL建模軟件對TRX-h5蛋白三級結構預測分析,該蛋白有3個半胱氨酸位點,其中第39位和第42位半胱氨酸裸露在蛋白質表面,將這2個半胱氨酸位點突變后,運用原核表達系統體外表達TRX-h5M蛋白和TRX-h5,并測定2個蛋白的酶活力,分析發現TRX-h5的第39位和第42位半胱氨酸位點決定了該蛋白的催化活性。這意味著第39位和第42位這2個位點的半胱氨酸可能是調節擬南芥TRX-h5蛋白活力的關鍵位點。

植物在受到氧化脅迫后,信號分子引發防御信號,硫氧還蛋白作為參與調節氧化還原平衡的關鍵蛋白,其第39位和第42位半胱氨酸可能是信號分子的作用位點,從而促發下游防御信號。這種調節方式需要進一步證明。

本文對TRX-h5蛋白進行結構上的預測,對研究其功能提供了理論依據。同時建立了體外表達TRX-h5的方法,探究了其第39位和第42位半胱氨酸對TRX-h5酶活力的影響。為TRX-h5的功能調節機制及植物氧化還原系統的研究提供了新思路。