m6A甲基化修飾蛋白在卵巢癌中的研究進展*

楊惠雯，李安，藍婷

（徐州醫科大學 醫學技術學院，江蘇 徐州 221004）

表觀遺傳學修飾包括DNA、RNA和蛋白質的化學修飾。其中RNA存在100余種化學修飾，RNA修飾是一種轉錄后水平的調控方式。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上發生甲基化修飾，是真核細胞mRNA最常見的轉錄后修飾，20世紀70年代首次在真核生物的mRNA中發現，占RNA甲基化修飾的80%。m6A甲基化修飾涉及甲基轉移酶、去甲基化酶和甲基化閱讀器，同時m6A甲基化修飾也被證明是一個可逆性過程。卵巢癌是女性生殖系統最常見且病死率最高的惡性腫瘤之一，大多數患者發現時已處于晚期，5年生存率不足50%，具有高復發率、高病死率[1-2]。近年來，越來越多的研究表明m6A修飾與癌癥之間存在潛在聯系。本綜述將重點介紹m6A甲基化修飾對卵巢癌的增殖、轉移的影響及其分子機制。

1 m6A甲基化修飾蛋白的組成及功能

m6A修飾是mRNA最常見的一種RNA修飾，m6A修飾具有保守基序RRACH（R表示A或G，H表示A、U或C），其分布富集于長外顯子、終止密碼子以及3′-非翻譯區（3′-UTR），m6A甲基化根據其修飾的基因組位置不同調節不同的RNA過程和生物功能，5′-非翻譯區（5′-UTR）的m6A甲基化修飾可以繞過5′-帽子結構，直接與真核起始因子3（eukaryotic initiation factor 3，EIF3）結合，促進蛋白質翻譯的啟動，位于編碼序列的m6A修飾有利于RNA的穩定性和細胞增殖，位于終止密碼子的m6A甲基化與3′-UTR處的多聚腺苷酸化有關[3]。m6A是個動態可逆的過程，m6A修飾的調節主要是由m6A甲基轉移酶、去甲基化酶和結合蛋白組成（見圖1）[4]。其中m6A甲基轉移酶即“寫入器”，催化m6A修飾的發生。m6A甲基轉移酶包括甲基轉移酶樣蛋白3（methyltransferase-like 3，METTL3）、甲基轉移酶樣蛋白14（methyltransferase-like 3，METTL14）和Wilms腫瘤1相關蛋白（Wilms′tumor 1-associating protein，WTAP），m6A去甲基化酶即“擦除器”，如肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）和ALKB同系物5（AlkB homolog 5，ALKBH5）等蛋白質可以使細胞中mRNA的m6A水平降低，即發生了去甲基化。同時m6A結合蛋白即“閱讀器”，包括YTH結構域蛋白家族成員YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3和異質性胞核核糖核蛋白、IGF2BP1等，負責讀取識別m6A甲基化修飾。m6A修飾發生在轉錄和mRNA加工過程中的pre-mRNA階段[5]，該過程主要由m6A甲基轉移酶復合體催化。

圖1 m6A修飾相關蛋白的示意圖

2 m6A甲基轉移酶在卵巢癌中的研究進展

METTL3作為m6A修飾的寫入器參與RNA生命周期的所有階段，并通過調節關鍵癌基因或抑癌基因的m6A修飾來影響腫瘤進展，METTL3調節RNA的半衰期，并調控mRNA前體的剪切、miRNA處理、核轉運、翻譯和RNA降解[6]。m6A修飾通過影響剪接因子與其結合位點的結合來調控mRNA前體的剪切，敲低細胞中的METTL3后，導致選擇性剪接變化，并且與具有選擇性、剪接特性的外顯子和內含子相比，組成性的外顯子和內含子具有更多的m6A修飾。METTL3還能夠對pri-miRNA上GGAC motif的腺苷酸（A）進行m6A修飾。m6A修飾能夠促進pri-miRNA被DiGeorge綜合征危象區基因8特異性識別，并影響后續成熟體miRNA的加工。因此，METTL3也可以調控miRNA前體并加速其成熟[7]。METTL3可以通過多種機制參與m6A修飾介導的mRNA翻譯過程，包括依賴YTHDF1-EIF3調控翻譯、與EIF3直接作用調控翻譯、結合mRNA的蛋白質編碼區（coding sequence，CDS）調控翻譯[8-9]。此外，在METTL3催化的m6A中，m6A識別酶YTHDF2的羧基末端結構域能夠選擇性地與含m6A的mRNA結合，而氨基末端結構域則負責將YTHDF2-mRNA復合物定位到細胞質處理小體等RNA降解的場所，從而調節mRNA的降解[10]。METTL3在不同癌癥中會發生表達上調或下調，所以其在腫瘤發生、發展中的具體作用仍存在爭議。有研究表明，在胃癌、結直腸癌、膀胱癌及肝細胞癌等惡性腫瘤中，METTL3的表達水平上調[11]，同時也存在METTL3在子宮內膜癌中表達降低[12]。在卵巢癌中，METTL3過表達后，m6A修飾水平明顯上升并對腫瘤細胞的增殖和轉移有促進作用。BI等[13]在分析對比75例卵巢癌患者和健康人的卵巢組織METTL3 mRNA水平后，得出METTL3在卵巢癌患者中的表達明顯高于健康人。因此METTL3作為卵巢癌中的腫瘤促進因子，其表達水平與卵巢癌的進展密切相關。

關于METTL3是如何調控卵巢癌的進展，BI等[13]研究發現，METTL3通過介導pri-miR-126-5p的m6A修飾來調控miR-126-5p的表達，進而激活抑癌基因人張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）介導的PI3K/Akt/mTOR通路，促進卵巢癌的進展[13-16]。除此之外，有研究表明，miR-1246在卵巢癌患者樣本中高表達，METTL3可以通過調控miR-1246的m6A甲基化修飾來促進miR-1246的表達，進而促進卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移，同時抑制其凋亡。METTL3可以識別pri-miR-1246的m6A修飾，并進一步促進pri-miR-1246的成熟，miR-1246通過與細胞周期蛋白G2（CCNG2）的3′-UTR區結合抑制CCNG2的表達從而促進卵巢癌的發生和轉移[17]。在結直腸癌中，METTL3也通過上調pri-miR-1246的m6A修飾，催化miR-1246成熟，并促進結直腸癌的轉移[18]。此外，HUA等[19]研究發現，METTL3通過調節受體酪氨酸激酶翻譯和上皮-間充質轉化，促進卵巢癌的生長和侵襲。SHEN等[20]發現存在磷脂酶A2激活蛋白（phospholipase A2 activating protein，PLAA）-METTL3-瞬時受體電位通道經典3（transient receptor potential channel canonical 3，TRPC3）軸調控卵巢癌的轉移，METTL3介導的m6A修飾促進了TRPC3的表達，進一步促進卵巢癌的轉移，而PLAA作為METTL3的上游分子通過靶向泛素化METTL3，使其降解，進而抑制由METTL3介導的對TRPC3 mRNA的修飾，抑制卵巢癌細胞轉移。

METTL14是m6A甲基轉移酶復合物的關鍵部分，負責與RNA結合[21]。METTL14表達增加已被證明抑制某些癌癥的進展，但其會導致急性髓細胞增殖[22]。肌鈣蛋白相關蛋白（trophinin associated protein，TROAP）被發現參與許多癌癥的增殖、侵襲和遷移[23]。當METTL14過表達時，TROAP mRNA的3′-UTR區m6A修飾水平增加，進而降低TROAP mRNA的穩定性，抑制卵巢癌細胞的增殖[24]。

3 m6A結合蛋白在卵巢癌中的研究進展

目前，對卵巢癌中m6A甲基化修飾“讀寫器”的研究主要集中于YTHDF1和YTHDF2。YTH結構域能直接與RNA的m6A位點相結合。YTHDF1是m6A修飾結合蛋白，其可以結合到m6A修飾的轉錄本的終止密碼子附近，整體分布與m6A修飾非常相似。而YTHDF2可以介導m6A修飾的mRNA降解，正常條件下，YTHDF2可與脫腺苷酸酶復合物及脫帽復合物蛋白共定位，并將其靶基因的轉錄本帶入降解小體[10]來介導m6A修飾的mRNA降解。

YTHDF1可直接與翻譯起始復合物作用，促進m6A修飾的RNA底物的翻譯效率[25]。在乳腺癌、肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤中存在YTHDF1的明顯上調[26-27]。在LIU等[25]研究中，通過癌癥基因組圖譜數據庫發現，YTHDF1在高級別漿液性卵巢癌中上調，表明YTHDF1是一種原癌基因。通過分析卵巢癌數據庫發現YTHDF1表達與腫瘤分級、FIGO分期和總生存率相關。YTHDF1通過募集EIF3來調節mRNA的翻譯，從而調控卵巢癌的進展。此外，有報道稱YTHDF1通過結合蝸牛蛋白miRNA的CDS的m6A位點，并通過招募真核延伸因子來增強其翻譯，表明YTHDF1可以通過調節翻譯延長和翻譯啟動來發揮作用[28]。除此之外，有學者認為YTHDF1通過調控三元基序蛋白（tripartite motif-29，TRIM29）的表達來促進卵巢癌的順鉑耐藥。TRIM29是一種致癌基因，在各種癌癥中異常表達，TRIM29通過不同的信號通路促進或抑制不同的癌癥進展[29-35]。有研究發現，TRIM29在順鉑耐藥卵巢癌細胞中的表達上調，而在敲除TRIM29之后顯著抑制了卵巢癌細胞的干細胞樣特征，并且抑制了順鉑耐藥卵巢癌細胞皮下植瘤的裸鼠腫瘤的體積[35]。順鉑耐藥卵巢癌細胞中YTHDF1對TRIM29 mRNA的招募增加，YTHDF1通過識別卵巢癌細胞中TRIM29的3′-UTR區，促進TRIM29的翻譯[35]。

YTHDF2可以介導m6A修飾的mRNA降解，有研究表明，在卵巢癌細胞中敲除YTHDF2后，其mRNA的m6A修飾水平上調，并且卵巢癌細胞的增殖明顯減少，凋亡增加，敲除YTHDF2還抑制了卵巢癌細胞的遷移和侵襲；而當YTHDF2過表達時，則得到相反的結果。在LI等[36]研究中發現，卵巢癌中miR-145的表達與YTHDF2呈負相關，當YTHDF2過表達后miR-145的表達水平降低，而當miR-145過表達后YTHDF2的表達水平又受到了抑制，表明在YTHDF2與miR-145之間存在著一種雙向負反饋調節機制：miR-145以YTHDF2為靶點，靶向結合YTHDF2的3′-UTR，從而抑制YTHDF2的表達，YTHDF2介導m6A修飾的mRNA的降解，使miR-145降解，從而促進了卵巢癌的發生、發展。

4 m6A去甲基化酶在卵巢癌中的研究進展

FTO最初被稱為肥胖相關蛋白，是第一個發現的m6A去甲基化酶[37]，可以使單鏈RNA上的m6A修飾位點去甲基化。目前研究表明FTO在惡性腫瘤中的表達情況并不一致，在膠質母細胞瘤、白血病和乳腺癌中均有著促進腫瘤發生的功能[38-39]，而在高級別漿液性卵巢癌中FTO的表達明顯低于正常輸卵管上皮。據HUANG等[40]研究發現，FTO對卵巢癌細胞的轉錄有顯著影響，包括與干細胞信號傳導、RNA轉錄、mRNA剪接和DNA修復相關的通路。FTO過表達時，可以使磷酸二酯酶4B（phosphodiesterase 4B，PDE4B）和磷酸二酯酶1C（phosphodiesterase 1C，PDE1C）m6A甲基化修飾水平降低并處于低表達狀態，抑制由PDE4B和PDE1C介導的第二信使環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）及下游通路的激活，從而保持高水平的cAMP，抑制卵巢癌的發生、發展。因此PDE4B和PDE1C可以作為FTO調控m6A修飾的潛在靶點[40]。然而，也有研究表明，FTO在卵巢癌中起著關鍵的致癌作用，過表達時顯著促進卵巢癌細胞增殖，但對FTO是如何作為m6A修飾的去甲基化酶促進卵巢癌的發展還不明確[41]。

除FTO之外，同樣具有m6A去甲基化作用的ALKBH5也調控著惡性腫瘤的發生、發展。ALKBH5在上皮性卵巢癌組織中過度表達，并通過抑制上皮性卵巢癌細胞的自噬促進癌癥進展[42]。研究發現，在卵巢癌細胞中存在著ALKBH5-同源框A10（homeobox A10，HOXA10）雙向調節環路，ALKBH5通過維持HOXA10 mRNA的穩定性介導HOXA10上調，HOXA10作為轉錄因子與ALKBH5的啟動子區域相結合，從而上調ALKBH5在卵巢癌細胞中的表達[43]。JAK2/STAT3信號通路已被廣泛證明與各種惡性腫瘤的腫瘤生長和化療耐藥性有關。ALKBH5過表達降低了卵巢癌細胞中JAK2 mRNA 3′UTR區的m6A修飾水平，并通過降低YTHDF2介導的mRNA降解來維持JAK2 mRNA的表達。ALKBH5-HOXA10過表達后激活JAK2/STAT通路，進而導致上皮性卵巢癌的化療耐藥性[43]。SUN等[44]研究發現，ALKBH5過表達促進卵巢癌淋巴結轉移。進一步研究發現，ALKBH5通過轉錄后機制下調了整合素β1（Integrin β1，ITGB1）mRNA的m6A修飾水平，抑制了YTHDF2蛋白介導的m6A依賴的ITGB1 mRNA降解，導致ITGB1表達增加，并磷酸化了局部黏著斑激酶和酪氨酸受體激酶原癌基因蛋白，增加了卵巢癌淋巴結轉移。

5 總結

綜上所述，m6A修飾作為真核細胞最常見的轉錄后修飾，近年來在惡性腫瘤發生、發展中的作用引起了極大關注，在卵巢癌中，m6A修飾蛋白通過調節關鍵癌基因或抑癌基因促進或抑制卵巢癌的發生或轉移。目前的研究發現，METTL3、YTHDF1、YTHDF2和ALKBH5通過不同機制促進卵巢癌的進展，METTL14則抑制卵巢癌的發展，FTO在卵巢癌的作用尚不明確，促進及抑制均有報道（見表1）。雖然m6A在卵巢癌中的作用正逐漸被揭示，但其分子機制并未完全明確，需要在以后的研究中進一步探索，其可能通過其涉及的上游刺激因子、下游信號級聯、癌細胞和腫瘤微環境等不同的甲基化修飾蛋白作用的靶點，明確其在卵巢癌中具體的作用。

表1 卵巢癌m6A修飾相關蛋白

續表1