一株蠟樣芽孢桿菌產抑菌物質發酵條件優化及抑菌效果研究

戴悅 彭金菊 張騰月 謝星朋 羅帥帥 譚綺梅 文嬌 馬驛

摘要 從廣東湛江紅樹林自然保護區的紅樹植物根際土壤中分離篩選出一株廣譜抑菌效果的菌株蠟樣芽孢桿菌M15，對菌株M15進行發酵培養條件優化，采用特定發酵培養基的基礎上，控制單一變量，對裝液量、接種量、發酵溫度和發酵時間進行優化，并對其抑菌活性物質的酸堿穩定性、熱穩定性和蛋白酶耐受性進行測定。結果表明：菌株M15的發酵條件為裝液量30 mL、接種量2%、發酵溫度30 ℃、發酵時間120 h時，發酵液的抑菌效果最佳，對大腸桿菌、鏈球菌和沙門氏菌抑菌圈直徑均為17 mm，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為15 mm；發酵培養基pH小于5.0或者大于6.0時，抑菌活性喪失；菌株M15的發酵液抑菌活性在30 ～60 ℃較穩定，但≥80 ℃時，發酵液抑菌物質失去活性；抑菌物質對胰蛋白酶不敏感，對木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E和蛋白酶K敏感。

關鍵詞 蠟樣芽孢桿菌；抑菌物質；發酵條件優化；抑菌效果

中圖分類號 TQ 920? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）06-0006-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.002

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Optimization of Fermentation Conditions and Inhibition Effect of a Strain of Bacillus cereus Producing Inhibitory Substances

DAI Yue，PENG Jin-ju，ZHANG Teng-yue et al

（Department of Veterinary Medicine，College of Coastal Agricultural Sciences，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524000）

Abstract A broad-spectrum antibacterial strain，Bacillus cereus M15，was isolated and screened from the rhizosphere soil of mangrove plants in Zhanjiang Mangrove Nature Reserve，Guangdong，the fermentation culture conditions were optimized for strain M15，using a specific fermentation medium based on the control of a single variable，the loading volume，inoculum，fermentation temperature and fermentation time.And its bacterial inhibitory active substances were measured for acid-base stability，heat stability and protease tolerance.The results showed that the fermentation conditions were 30 mL，2% inoculum，30 °C fermentation temperature and 120 h fermentation time，the fermentation solution had the best bacterial inhibition effect，and the circle diameter of inhibition for Escherichia coli，Streptococcus and Salmonella were 17 mm，and the circle diameter of inhibition for Staphylococcus aureus was 15 mm.When the pH of fermentation medium was less than 5.0 or more than 6.0，the antibacterial activity was lost;the antibacterial activity of fermentation broth of strain M15 was stable at 30-60 ℃，and the antibacterial substance of it loses activity when ≥80 ℃;the antibacterial activity was not sensitive to trypsin，but sensitive to papain，streptomycin E and proteinase K.

Key words Bacillus cereus;Bacteriostatic substances;Optimization of fermentation conditions;Inhibition effect

抗生素作為抗菌藥物廣泛應用于各種領域，但抗生素的濫用導致很多致病菌對其耐藥性增加，甚至出現超級細菌［1-2］。因此，急需研究和開發有抗菌活性的藥物來治療細菌性疾病。細菌素是一類由細菌核糖體合成的抗微生物蛋白質或多肽，其具有無耐藥性、不殘留、能夠抑制或殺死某些致病菌等特點，可用于臨床預防和治療細菌感染性疾病［3-5］。

作為一種動植物微生態中的優勢菌種，芽孢桿菌具有豐富的種類和廣泛的來源，它們可以在土壤、水體、空氣以及動物腸道等環境中被發現，具有多樣性和普遍性［6-7］。研究表明，芽孢桿菌所產生的細菌素比乳酸菌產生的細菌素抗菌譜更廣，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有抑菌作用，能更加適應環境和應用生產中酸堿度和高溫等影響因素，這些優良特性提示芽孢桿菌產生的細菌素和類細菌素具有廣泛的應用前景［8］。其中，蠟樣芽孢桿菌可以分泌多種細菌素，分泌的細菌素有cerein 7、cerein 7B、cerein 8A、cerein MRX1等［9-11］。該研究從紅樹植物根際土壤中分離具有廣譜抑菌效果的菌株M15，經鑒定為蠟樣芽孢桿菌，對其進行發酵培養條件優化，并對其抑菌活性物質的酸堿度穩定性、熱穩定性和蛋白酶耐受性進行測定，確定該菌產抑菌活性物質的最佳培養條件。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

從廣東湛江紅樹林自然保護區的紅樹植物根際土壤中分離具有廣譜抑菌效果的菌株，篩選一株對病原菌拮抗作用最好的菌株，通過全基因測序分析，菌株被鑒定為蠟樣芽孢桿菌，命名為蠟樣芽孢桿菌M15。

1.2 指示菌株

大腸桿菌（批號為D0028B）、金黃色葡萄球菌（批號為F0009B）、沙門氏菌（批號為F0014B）、鏈球菌（批號為G0041DX），均購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.3 培養基

發酵培養基：每100 mL培養基中含葡萄糖 4.00 g、牛肉膏0.50%、酵母提取物0.50 g、蛋白胨1.50 g、NaH2PO4·2H2O 0.02 g、Na2HPO4·2H2O 0.05 g、Mg2SO4·7H2O 0.05 g、CaCl2 0.02 g、MnSO4 0.02 g。

LB液體培養基，購自北京陸橋技術有限公司。

1.4 菌株的發酵液培養及抑菌活性測定

蠟樣芽孢桿菌M15在28 ℃條件下培養過夜后，在發酵培養基中接種，置于28 ℃的恒溫培養箱中培養72 h后，將發酵液置于離心機離心以獲得上清液，4 ℃、8 000 r/min 離心30 min。上清液的無菌處理：離心獲得的上清液采用濾膜過濾法進行無菌處理，濾膜孔徑為0.22 μm。采用固體瓊脂打孔法分別測定無菌發酵液對4種指示菌的抑菌效果，每組重復3次，采用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.5 菌株發酵培養條件優化

1.5.1 裝液量對發酵液抑菌活性的影響。

以2%的接種量分別將培養過夜的蠟樣芽孢桿菌M15接種至發酵培養基中，4個不同的培養基裝液量（30、50、70 和100 mL）置于恒溫振蕩器中，28 ℃、180 r/min培養72 h后，重復3次測量不同裝液量對發酵液抑菌物質活性的影響。

1.5.2 接種量對發酵液抑菌活性的影響。

將培養過夜的蠟樣芽孢桿菌M15分別以6個不同的接種量（1%、2%、4%、6%、8%和10%）至裝有30 mL發酵培養基的錐形瓶中，置于恒溫振蕩器中，28 ℃、180 r/min培養72 h后，重復3次測量不同接種量對發酵液抑菌物質活性的影響。

1.5.3 發酵溫度對發酵液抑菌活性的影響。

以2%的接種量將培養過夜的蠟樣芽孢桿菌M15接種至30 mL發酵培養基的錐形瓶中，5個不同的溫度（28、30、34、37和40 ℃）置于恒溫振蕩器中，180 r/min培養72 h后，重復3次測量不同發酵溫度對發酵液抑菌物質活性的影響。

1.5.4 發酵時間對發酵液抑菌活性的影響。

以2%的接種量將培養過夜的蠟樣芽孢桿菌M15接種至30 mL發酵培養基的錐形瓶中，7個不同時間（24、48、72、96、120、144和168 h）置于恒溫振蕩器中，30 ℃、180 r/min培養，重復3次測量不同發酵時間對發酵液抑菌物質活性的影響。

1.6 抑菌物質酸堿穩定性的測定

采用孔徑為0.22 μm濾膜，對離心獲得的蠟樣芽孢桿菌M15上清液進行無菌處理后，分別用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的HCl溶液調節6個不同的pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），室溫放置1 h，測定發酵液對指示菌的抑菌效果，每組重復3次，比較抑菌物質的酸堿穩定性，將未處理組設定為對照組。

1.7 抑菌物質熱穩定性的測定

采用孔徑為0.22 μm 濾膜，對離心獲得的蠟樣芽孢桿菌M15上清液進行無菌處理后，在4個溫度（40、60、80、100 ℃）的水浴鍋中放置30 min，待溫度降低至室溫后，測定熱處理后的發酵液對指示菌的抑菌效果，比較抑菌物質的熱穩定性，每組重復3次，將未處理組設定為對照組。

1.8 抑菌物質對蛋白酶耐受性的測定

采用孔徑為0.22 μm 濾膜，對離心獲得的蠟樣芽孢桿菌M15上清液進行無菌處理后，在上清液中分別加入濃度均為1 mg/mL的4個蛋白酶（木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E、胰蛋白酶、蛋白酶K），37 ℃水浴鍋中放置1 h，測定發酵液對指示菌的抑菌效果，比較抑菌物質對不同蛋白酶的耐受性，每組重復3次，將未處理組設定為對照組。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定結果

由圖1可知，M15全基因組與NCBI數據庫已知芽孢桿菌全基因組對比，運用PGAP1.2.1軟件，構建Neighbor-joining物種間系統進化樹，菌株M15和蠟樣芽孢桿菌BAG5X12-1親緣關系最近，菌株M15被鑒定為一株蠟樣芽孢桿菌，命名為蠟樣芽孢桿菌M15。

2.2 菌株發酵培養條件優化

2.2.1 裝液量對發酵液抑菌活性的影響。

由表1可知，裝液量≥70 mL時，發酵液對4種指示菌均無抑菌活性；裝液量在30 mL時，發酵液對4種指示菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最佳，故選擇30 mL的裝液量。

2.2.2 接種量對發酵液抑菌活性的影響。

由表2可知，6個不同接種量的發酵液對4種指示菌的抑菌圈直徑差異不明顯，其中接種量為2%時發酵液抑菌圈直徑最大，故選擇2%的接種量。

2.2.3 發酵溫度對發酵液抑菌活性的影響。

由表3可知，發酵溫度在40 ℃時，發酵液對4種指示菌的抑菌圈直徑最小；發酵溫度在30 ℃時，發酵液對4種指示菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最佳，故選擇30 ℃的發酵溫度。

2.2.4 發酵時間對發酵液抑菌活性的影響。

由表4可知，發酵時間為24 h時，發酵液對4種指示菌的抑菌圈直徑最??；在120 h時，發酵液對4種指示菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最佳，故選擇120 h的發酵時間。

2.3 抑菌物質酸堿穩定性的測定

由表5可知，與對照組比較（對照組pH與細菌培養時發酵液的pH一致，為5.5），不同酸堿度對抑菌活性物質影響差異較大，發酵培養基pH小于5.0或者大于6.0時，抑菌物質活性喪失，pH為5.5時，發酵液抑菌活性最強。

2.4 抑菌物質熱穩定性的測定

由表6可知，與對照組比較（對照組溫度與細菌培養時的最佳溫度一致，為30 ℃），發酵液經過不同溫度處理后，在40～60 ℃抑菌效果有所下降，但是抑菌活性依舊接近90%，故發酵液抑菌物質活性在30～60 ℃較穩定，但≥80 ℃時，發酵液抑菌物質失去活性。

2.5 抑菌物質對蛋白酶耐受性的測定

由表7可知，與對照組比較（對照組不加酶），胰蛋白酶處理后的發酵液對4種指示菌的抑菌活性無變化；木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E和蛋白酶K處理后的發酵液對4種指示菌的抑菌活性下降。故抑菌物質對木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E和蛋白酶K敏感，對胰蛋白酶不敏感。

3 結論與討論

該試驗從紅樹植物根際土壤中分離具有廣譜抑菌效果的蠟樣芽孢桿菌M15，對其發酵條件進行優化，得到最佳的發酵條件：裝液量30 mL、接種量2%、發酵溫度30 ℃、發酵時間120 h時，發酵液中抑菌物質效果最佳。劉瑾等［12］對芽孢桿菌P9培養基及發酵條件優化，得到發酵溫度30 ℃、發酵時間72 h，抑菌物質抑菌圈比初始抑菌圈直徑擴大1.7倍。解麗娟等［13］研究發現地衣芽孢桿菌產抑菌物質的培養條件在裝液量為40 mL、接種量為2%時，發酵后菌液濃度最高，得到的抑菌物質也是最高。與文獻相比，該試驗的芽孢桿菌M15發酵條件與上述文獻報道的芽孢桿菌發酵條件相近時，所產抑菌活性物質的抑菌效果最佳。

在對蠟樣芽孢桿菌M15的抑菌物質的穩定性試驗中發現，發酵液的pH在5.0～6.0時，抑菌物質活性較高，說明該菌在偏酸性條件下培養可以增加抑菌物質的產量。根據研究發現，凝結芽孢生長最適合的pH在5.5～6.5［14-15］。蠟樣芽孢桿菌M15的發酵液溫度在30～60 ℃抑菌物質活性較穩定，但溫度≥80 ℃時，發酵液抑菌物質失去活性。姚佳明［16］研究發現解淀粉芽孢桿菌B815-1發酵上清的抑菌物質在30～60 ℃上清液的抑菌活性維持較高水平，但是>80 ℃抑菌活性顯著下降。劉佳慧等［17］對一株蕈狀芽孢桿菌進行發酵條件優化，結果表明最佳的溫度為30 ℃。蠟樣芽孢桿菌M15的抑菌物質對木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E和蛋白酶K敏感，對胰蛋白酶不敏感。張毅等［18］研究發現凝結芽孢桿菌BC99代謝產物對蛋白酶K水解作用敏感。于秀菊等［19］對來自羊駝腸道中的地衣芽孢桿菌AF08發酵上清液抑菌物質是否耐受蛋白酶的試驗結果發現，鏈霉蛋白酶E處理組中，抑菌活性完全喪失。說明不同的芽孢桿菌代謝產物都可能是蛋白類產物。

參考文獻

［1］

Antimicrobial Resistance Collaborators.Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019：A systematic analysis［J］.The lancet，2022，399（10325）：629-655.

［2］ KWON J H，POWDERLY W G.The post-antibiotic era is here［J］.Science，2021，373（6554）：471-471.

［3］ HEILBRONNER S，KRISMER B，BRTZ-OESTERHELT H，et al.The microbiome-shaping roles of bacteriocins［J］.Nature reviews microbiology，2021，19（11）：726-739.

［4］ XIN B Y，XU H T，LIU H L，et al.Identification and characterization of a novel circular bacteriocin，bacicyclicin XIN-1，from Bacillus sp.Xin1［J］.Food control，2021，121：1-11.

［5］ HUANG F Q，TENG K L，LIU Y Y，et al.Bacteriocins：Potential for human health［J］.Oxidative medicine and cellular longevity，2021，2021：1-17.

［6］ SHEN S Y，FULTHORPE R.Seasonal variation of bacterial endophytes in urban trees［J］.Frontiers in microbiology，2015，6：1-13.

［7］ GOND S K，BERGEN M S，TORRES M S，et al.Endophytic Bacillus spp.produce antifungal lipopeptides and induce host defence gene expression in maize［J］.Microbiological research，2015，172：79-87.

［8］ ZEL B，瘙塁IM瘙塁EK ，AKELIK M，et al.Innovative approaches to nisin production［J］.Applied microbiology biotechnology，2018，102（15）：6299-6307.

［9］ OSCRIZ J C，CINTAS L，HOLO H，et al.Purification and sequencing of cerein 7B，a novel bacteriocin produced by Bacillus cereus Bc7［J］.FEMS microbiology letters，2006，254（1）：108-115.

［10］ BIZANI D，MOTTA A S，MORRISSY J A，et al.Antibacterial activity of cerein 8A，a bacteriocin-like peptide produced by Bacillus cereus［J］.International microbiology，2005，8（2）：125-131.

［11］ SEBEI S，ZENDO T，BOUDABOUS A，et al.Characterization，N-terminal sequencing and classification of cerein MRX1，a novel bacteriocin purified from a newly isolated bacterium：Bacillus cereus MRX1［J］.Journal of applied microbiology，2007，103（5）：1621-1631.

［12］ 劉瑾，張朝正，趙華.抗尖孢鐮刀菌貝萊斯芽孢桿菌P9培養基及發酵條件優化［J］.中國釀造，2023，42（2）：157-162.

［13］ 解麗娟，肖蕾，伍善東，等.內生解淀粉芽孢桿菌L-4-3發酵條件的優化［J］.湖南農業科學，2022（9）：10-13，21.

［14］ 黃遵錫，王雪艷，程志斌.飼用凝結芽孢桿菌的菌數檢測方法研究進展［J］.飼料工業，2023，44（3）：1-6.

［15］ 劉彬，粟勝蘭，張雅惠，等.飼用凝結芽孢桿菌的菌種特性及作用機制［J］.飼料工業，2022，43（5）：40-44.

［16］ 姚佳明.解淀粉芽孢桿菌抑菌活性成分鑒定及機理研究［D］.無錫：江南大學，2019.

［17］ 劉佳慧，呂紅，林娟.一株產低溫堿性淀粉酶蕈狀芽孢桿菌的分離篩選和發酵優化［J］.四川大學學報（自然科學版），2023，60（2）：149-155.

［18］ 張毅，牛德強，嚴濤，等.凝結芽孢桿菌BC99代謝產物抑菌效果研究［J］.食品研究與開發，2022，43（9）：192-197.

［19］ 于秀菊，韓小濤，李鈺鈺，等.地衣芽孢桿菌AF08所產抑菌活性物質的特性研究［J］.畜牧獸醫科技信息，2020（9）：38-40.