作物中葉酸合成及生物強化研究進展

馬云 王虹

摘要 葉酸是四氫葉酸及其一碳單位取代衍生物的統稱，對植物生長發育和人類健康發揮著至關重要的作用。人體本身不具備合成葉酸的能力，因此必須從膳食中獲取。利用生物強化提高作物中葉酸含量是一種有效解決全球性葉酸缺乏的方法。介紹了葉酸的結構與功能、生物合成途徑、葉酸的提取與檢測方法，并重點闡述了不同作物中葉酸生物強化的現狀，對全球葉酸強化做出展望。

關鍵詞 作物；葉酸；生物合成；生物強化

中圖分類號 Q 945? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）06-0010-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.003

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research Progress on Folate Biosynthesis and Biofortification in Crops

MA Yun，WANG Hong

（State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Hebei Sub-center of National Maize Improvement Center of China/College of Agronomy， Hebei Agricultural University， Baoding， Hebei 071000）

Abstract Folate is a collective term for tetrahydrofolate （THF） and its derivatives substituted with one carbon unit， playing a crucial role in plant growth and human health. The human body cannot synthesize folate itself， so it must be obtained from the diet. Improving folate content in plants through biofortification is an effective method to address the global folate deficiency problem. This review introduced the structure， functions， the biosynthesis pathways， and the extraction and detection methods of folate. Moreover， it focused on the current status of folate biofortification in different crops， and prospected for global folate biofortfication.

Key words Crops;Folate;Biosynthesis;Biofortification

葉酸（folates）化學名為蝶酰谷氨酸（pteroylglutamic acid，PGA），又名維生素B9，是一種水溶性B族維生素，為四氫葉酸（tetrahydrofolate，THF）及其一碳衍生物的統稱。葉酸作為一碳單位的供體和受體，參與著許多重要的生物化學反應，如甲基化循環、核苷酸與氨基酸的合成等，是人體生命活動所必需的微量營養物質［1］。植物和微生物自身可以從頭合成葉酸，然而人類和其他高等哺乳動物因缺乏完整的葉酸合成系統，故需要通過膳食攝取葉酸。醫學研究表明，成年人每天的葉酸建議攝入量為400 μg，孕婦則建議每天攝入600 μg葉酸才能有效防止胎兒先天性畸形［2］。但目前大部分地區人口的葉酸攝入量達不到這一標準，葉酸缺乏成為影響發達國家和發展中國家的全球性健康問題之一［3］。藥劑補充和作物葉酸強化是目前解決葉酸缺乏問題的兩種有效途徑，前者對于偏遠和貧窮地區的發展中國家來說難以實現。因此，通過對作物葉酸合成代謝途徑的調控來提高作物中葉酸含量，成為解決葉酸攝入不足的新興選擇［4］。該研究綜述了葉酸的結構與功能、葉酸的生物合成途徑、葉酸的提取與檢測技術及不同作物葉酸生物強化研究進展，并對解決葉酸缺乏問題進行展望。

1 葉酸的功能

1.1 葉酸缺乏與人類疾病

維持體內一定的葉酸水平對人類健康非常重要。人體葉酸缺乏可能誘發神經管缺陷、心血管疾病、癌癥和其他出生缺陷等重要疾病［5］，但產生疾病的生化原理和發育機制還尚不清楚。

神經管缺陷（neural tube defects，NTDs）是全球常見的胎兒畸形之一，其中脊柱裂和無腦畸形最為嚴重［6］。NTDs在全球孕婦中的發病率為0.5%～2.0%，我國是神經管畸形的高發區。我國2001—2004年NTDs發病率達0.11%［7］，在一些不發達國家的農村地區，新生兒NTDs比例可達到4.80%［8］。據一項全球性新生兒出生缺陷報告顯示，世界上每年有30萬名新生兒患NTDs［9］。若孕婦孕前每天服用400 μg葉酸，可降低70%的NTDs發生率［10］。另外，葉酸的缺乏還會引起一系列神經認知退行性疾病，如阿爾茨海默病和其他形式的智能障礙綜合征。Ramos等［11］指出紅細胞的葉酸水平與人的認知能力直接相關且與老年癡呆的發生率呈負相關，而葉酸可以通過改善甲硫氨酸代謝產物、外周血炎癥因子水平及DNA甲基化途徑來改善認知功能。

研究發現，血漿的同型半胱氨酸是導致心梗和心血管疾病的危險因素［12］，人體葉酸缺乏可能導致甲硫氨酸的生成受阻，進而引起血漿同型半胱氨酸濃度升高；當增加葉酸后甲硫氨酸循環又可繼續進行，使血漿同型半胱氨酸濃度降低［13］。

大量研究都證實了葉酸與大多數疾病包括癌癥密切相關，Choi［14］和潘慧穎等［15］發現葉酸缺乏和葉酸依賴性酶的多態性可能引起卵巢功能受損和直腸癌等癌癥風險上升。

研究表明，葉酸缺乏也會對視覺系統和骨骼肌細胞產生影響，造成營養性視弱和骨骼肌發育障礙等疾病［16］。同時有研究發現，巨成紅細胞貧血的疾病機制與葉酸缺乏有關［6］。因此，葉酸對于人體的生長發育是不可或缺的。

1.2 葉酸在植物中的作用

四氫葉酸（tetrahydrofolic，THF）及其衍生物作為一碳單位的供體和受體，是參與C1轉移反應的重要輔酶，參與了生物體內許多重要的生命過程，如在嘌呤、胸苷酸、氨基酸及蛋白質的合成及甲基化循環等過程中葉酸均發揮重要作用［17］。在植物中，葉酸的一碳單位衍生物參與蝶啶和胸苷酸的形成以合成DNA；同時也通過參與絲氨酸、甘氨酸的相互轉化以在光呼吸中發揮重要作用［18］；另外，Pribat等［19］通過研究揭示了四氫蝶呤或10-甲酰四氫葉酸（10-formyltetrahydrofolate，10-F-THF）與芳香族氨基酸代謝之間新的聯系。研究發現，葉酸通過S-腺苷甲硫氨酸與甲基化過程相聯系實現甲基化循環［20］，并通過甲基化循環為甜菜堿的生成提供一碳基團。此外，葉酸合成的中間代謝產物對氨基苯甲酸（p-aminobenzoate，p-ABA）的前體物分支酸可通過苯丙氨酸參與木質素的合成［21］。因此，在植物體中，葉酸對于

光呼吸以及木質素、甜菜堿、葉綠素的生物合成也發揮著重要的作用。

此外，葉酸在植物體內的新功能陸續被揭示。Lin等［22］ 、Malhotra等［23］發現葉酸分子中的蝶啶環及葉酸衍生物在依賴葉酸的光裂合酶和隱花色素輔酶作用下起光能捕獲天然色素的作用。Webb等［24］研究發現，植物體內葉酸衍生物的含量及分布狀況會對整個植物的甲基化循環和葉綠素合成產生影響。Storozhenko等［25］發現，葉酸含量還與氧化逆境耐受性之間可能存在某種關系。

綜上所述，葉酸在植物的生長發育過程中發揮著不可替代的作用，但關于葉酸在植物體內的深入研究仍需進一步挖掘。

2 葉酸的結構與生物合成途徑

2.1 葉酸的化學結構

葉酸分子由蝶啶、對氨基苯甲酸和一個單（多）谷氨酸尾（Glu）3部分組成。蝶啶與p-ABA由一個亞甲基相連，p-ABA又通過γ肽鍵與一個或多個L型谷氨酸相連。理論上，葉酸分子有150多種存在形式［26］，但目前在動植物組織中僅發現不到50種［27］。不同氧化水平的一碳單位（甲基、甲酰基、亞甲基等）可以在葉酸代謝相關酶的作用下連接到蝶啶的N5或p-ABA的N10位置，形成不同形式的葉酸衍生物。不同一碳取代基也可經酶促反應相互轉化，用于各種代謝反應的C1基團供體［28］，在不同的代謝途徑中發揮不同的功能。蝶啶環有完全氧化、部分氧化及完全還原3種形式，所對應葉酸形式分別為蝶酰谷氨酸、二氫葉酸（dihydrofolate，DHF）和四氫葉酸［27］。葉酸的化學結構見圖1。

2.2 葉酸的合成途徑

2.2.1 葉酸的合成。

葉酸存在于植物細胞的線粒體、細胞質、液泡和質體中，其合成代謝途徑極其保守。植物和微生物中葉酸的合成途徑類似，蝶啶環和對氨基苯甲酸先分別在其細胞質和質體中合成，隨后二者進入線粒體，與谷氨酸組成形成完整的葉酸分子，具體的葉酸合成途徑如圖2所示。

在植物中，蝶啶在細胞質內以尿苷三磷酸（GTP）為底物，在GTP環化水解酶I（GCHI）的作用下生成二氫新蝶呤三磷酸（DHN-P3），DHN-P3在三磷酸二氫新蝶呤焦磷酸水解酶（DHNTP）的作用下生成二氫新蝶呤一磷酸（DHN-P），再經非特異性磷酸酶去磷酸化后生成二氫新蝶呤（DHN）。DHN經二氫新蝶呤醛縮酶（DHNA）催化生成6-羥甲基二氫蝶呤（HMDHP）并進入線粒體。接著，進入線粒體的HMDHP在HMDHP焦磷酸激酶（HPPK）的催化下生成6-羥基二氫蝶呤焦磷酸（HMDHP-P2）。對氨基苯甲酸（p-ABA）的合成是在質體中以分支酸（Chorismate）為底物開始，通過氨基酸脫氧分支酸合成酶（ADCS）催化形成氨基酸脫氧分支酸（ADC），再經氨基酸脫氧核苷酸裂解酶（ADCL）催化形成p-ABA進入線粒體。HMDHP-P2和p-ABA在二氫蝶酸合成酶（DHPS）的作用下生成二氫蝶酸（DHP）。DHP與谷氨酸（Glu）在線粒體內的二氫葉酸合成酶（DHFS）的作用下生成二氫葉酸（DHF），最后，DHF在二氫葉酸還原酶（DHFR）的作用下被還原成單谷氨酸尾的四氫葉酸（THF）［29］。

2.2.2 葉酸的多聚谷氨酸化。

線粒體內合成的THF被轉運至其他細胞器中，由葉酰多聚谷氨酸合成酶（FPGS）催化更多的谷氨酸殘基逐一連接到葉酸中谷氨酸的γ位，形成具有多谷氨酸尾的THF。在模式植物擬南芥中，FPGS有3種異構體，分別位于細胞的細胞質、線粒體和葉綠體3個細胞器中行使加尾功能［30］。

自然形式的葉酸主要以多聚谷氨酸形式存在，葉酸的谷氨酸鏈長度在1～14，其隨著葉酸所處細胞或細胞器的不同而不同。單谷氨酸葉酸是葉酸轉運體所偏愛的形式，多谷氨酸葉酸則是參與一碳代謝的葉酸依賴型酶所偏愛的形式［31］。多尾形式的葉酸傾向于與蛋白質結合，穩定了葉酸的狀態，同時可以降低多谷氨酸葉酸被γ-谷氨酰水解酶（GGH）水解的速率［32］。在植物中，谷氨酸尾長度越長，與其結合的酶的活性就越高，如甲硫氨酸合成酶、甘氨酸脫羧酶、絲氨酸羥甲基轉移酶等［27］。同時也有研究表明，多聚谷氨酸形式對葉酸的區室化和依賴葉酸的代謝過程如光呼吸、泛酸和蛋氨酸的合成十分重要［33］。多聚谷氨酸鏈的長度變化可能存在著一定的生理作用，但其在不同生物中存在變化的原因還尚不明確［34］。

3 葉酸的測定

3.1 植物中葉酸的提取方法

植物性食品原料中葉酸含量較低，且受植物種類、收獲季節、種植氣候及采后處理等因素的影響［35］。由于葉酸極不穩定，易在光、熱和氧氣中降解，因此試驗操作均應在暗光下進行，提取與測定過程中的玻璃儀器應為棕色，并在提取液中加入抗氧化劑。另外，由于葉酸被埋在基質中而不利于提取，且許多生物材料含有內源性共軛酶和能夠引起各種形式的葉酸衍生物相互轉化及分布變化的酶，進而影響了葉酸測定［36］，因此研究植物葉酸的提取與測定具有一定的挑戰性。

目前，提取葉酸的方法主要有化學法和酶解法。化學法是利用葉酸在中性或堿性溶液中溶解度高和穩定性強的特性，常采用熱偏磷酸浸提法進行提取［37］，如小米中葉酸的提取［38］。化學法的優點是操作簡單、條件易控制且成本較低。酶解法則是利用葉酸軛合酶、蛋白酶和淀粉酶等聯合處理樣品，使與蛋白質、淀粉等相結合的葉酸充分水解出來［39］。葉曉利等［40］通過單因素和響應面法優化化學法磷酸鹽溶液提取玉米葉酸的最佳條件為溫度42 ℃、料液比1∶11.7（g∶mL）、活性炭用量1.2 g、提取時間7.3 h，且各因素對玉米籽粒中葉酸提取的影響為溫度>料液比>時間。王博倫等［41］發現了一種利用酶解法優化玉米中5-甲基四氫葉酸（5-methyl-tetrahydrofolate，5-M-THF）的提取方法，評價了高效液相色譜法（HPLC）測定玉米中5-M-THF含量的準確性。結果表明，優化最佳提取參數為葉酸提取液pH為6.5，蛋白酶、α-淀粉酶、大鼠血清的添加量分別為0.028、12.000、14.000 μL/mL，固相萃取凈化柱收集洗脫液2.5 mL，樣品加標平均回收率為104.57%。優化后的HPLC條件適用于測定玉米中5-M-THF與總葉酸含量。另外，郭文柱［42］指出，三酶法包括了多谷氨酸尾的水解，若提取的目標化合物為多谷氨酸葉酸，二酶法（蛋白酶、α-淀粉酶）效果更佳，并發現玉米籽粒加入0.48～0.72 U/mg的α-淀粉酶，加入0.002 1～0.002 8 U/mg的蛋白酶效果最優。但是有一些學者僅僅用葉酸軛合酶處理谷物樣品，其得到的結果卻比與用3種酶處理的偏高，這可能是因為谷物的三酶處理導致葉酸的損失，由于萃取液的不穩定性和不良峰形的影響，不能準確測定出葉酸的含量［43］。

3.2 葉酸的檢測方法

各種天然食品中存在的不同形式葉酸的分析和檢測技術取得一定進展。檢測葉酸的方法主要有：微生物法、高效液相色譜法、液相色譜串聯質譜法、熒光法和電化學法等。測定食品中葉酸含量的標準方法為微生物法，通常所用的微生物有鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus（ATCC 7469）及糞鏈球菌Streptococcus faecalis（ATCC8043）。國家標準（GB 5009.211—2014）中選用的微生物為鼠李糖乳桿菌［28］。微生物法適用范圍較廣，但局限于樣品中總葉酸含量的測定，無法單獨測定不同葉酸衍生物的含量。HPLC彌補了這一缺點，基于不同葉酸衍生物與色譜柱親和能力的差異，利用流動相對目標物進行梯度洗脫，可將樣品中THF、5-M-THF、5-F-THF（5-Formyltetrahydrofolate）、10-F-THF、DHF等分離，進而測定不同形式葉酸的含量［36，44］。液相色譜串聯質譜技術（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）測定食品中葉酸的方法近年也開始迅速發展，其優點是能同時快速地測定出數種不同葉酸形式及不同尾數谷氨酸形式的葉酸含量［36］，且與HPLC相比，LC-MS具有更高的特異性、靈敏性和穩定性，但質譜在定量準確性方面低于HPLC，且設備及日常維護費用較高。另外，研究者們利用電化學法和熒光法可測定出食品或復合維生素制劑中葉酸的含量［45-46］，但相對來說測定葉酸的形式較為單一［47］。綜上可知，每種測定方法的應用各不相同，主要根據檢測葉酸樣品的種類來決定。

4 作物中葉酸強化的研究進展

強化作物中葉酸含量一般從兩種途徑出發，一是提高作物食用部分葉酸的生物利用率及減少葉酸降解，如改變食品加工方式，研究發現微生物發酵后的谷物與浸泡過的豆類食品中葉酸含量顯著增加［48-50］。二是提高食物中葉酸的水平。近幾十年來，通過植物育種、基因工程、代謝工程等手段鑒定葉酸積累關鍵調控基因以及優良等位變異，進而實現作物葉酸生物強化成為一種解決葉酸缺乏現狀的重要途徑。

4.1 基因工程

在利用基因工程加強葉酸生物合成方面，可通過提高葉酸合成支路中關鍵酶的基因轉錄水平來增加葉酸含量，也可通過降低GGH的活性來減少葉酸的降解。GCHI和ADCS是葉酸合成通路中2種重要的酶。研究表明，同時過表達GCHI和ADCS會比單獨過表達其中1個基因對提升葉酸含量的效應更高［25］。只有當兩者共同表達，使蝶啶和p-ABA含量同時增加，才能使葉酸含量顯著增加。其他葉酸合成途徑的酶也會引起葉酸含量的改變，擬南芥和各作物的葉酸代謝基因工程研究匯總結果見表1。

4.1.1 水稻。

水稻是我國及世界重要的糧食作物，但其米粒尤其是經蒸煮加工后的大米葉酸含量極低，不能滿足人體的葉酸需求。在水稻的葉酸生物強化研究中，Storozhenko等［25］研究發現，僅表達AtGCHI的水稻株系中蝶啶含量提高25倍但葉酸含量未發現提高，僅過表達AtADCS的水稻株系p-ABA含量提高49倍且葉酸含量提高6倍，同時過表達AtGCHI和AtADCS的水稻株系中葉酸含量達到野生型對照的100倍，說明通過過表達ADCS提高p-ABA含量對于葉酸含量的提升至關重要。Blancquaert等［20］的研究也支持該結果。Gillies等［56］在水稻中過表達小麥TaHPPK/TaDHPS，發現株系葉片葉酸含量增加75%，籽粒葉酸增加40%。董薇［34］研究發現，過表達AtGCHI、AtADCS、AtDHFS和AtFPGS，葉酸含量分別增加3.7～6.1倍、1.5～1.8倍、14.5%～27.2%和7.5%～19.9%，但轉AtDHNA或AtADCL的轉基因水稻株系中葉酸含量下降。Blancquaert等［65］研究發現，在過表達OsGCHI和OsADCS的轉基因水稻中同時過表達線粒體和細胞質定位的AtFPGS和牛來源的FBP，可以獲得比野生型葉酸含量高出150倍的水稻株系，這是因為葉酸與FBP形成的化合物可以提高轉基因水稻中四氫葉酸的穩定性［69］。

4.1.2 玉米。

玉米作為世界主要糧食作物之一，其葉酸合成相關基因和生物強化仍處于起步階段且相關研究十分有限。已有的研究中，在玉米中過表達編碼GCHI的大腸桿菌folE基因使得玉米籽粒葉酸含量增加了2倍［57］，聯合過表達大豆來源的GmGCHI/GmADCS使得葉酸含量增加了4.2倍。同時，連通［70］研究發現，在蛋白序列上，玉米籽粒中葉酸合成相關基因的轉錄水平與葉酸含量積累水平之間無明顯相關性，表明玉米籽粒發育過程中的葉酸積累較為復雜，其調控機制仍需進一步探究。

4.1.3 番茄。

De La Carza等［52］研究發現，將哺乳動物小鼠的GCHI轉入番茄中，蝶啶和葉酸的含量分別提高了140倍和2倍，將小鼠GCHI轉入番茄中并施加外源性p-ABA，葉酸含量提高了10倍。接著，將番茄中的GCHI和ADCS基因過表達后，發現葉酸含量增加了25倍，這表明只有同時提高蝶啶和p-ABA的含量才能使葉酸含量增加。另外，也有研究證實，將番茄液泡中的LeGGH的含量提高3倍，可使葉酸含量下降46%［59］。

4.1.4 擬南芥和煙草。

在擬南芥的葉酸生物強化相關研究中，人們發現不同來源的GCHI和ADCS使蝶啶和p-ABA含量以不同的倍數增加。如Hanson等［51］將大腸桿菌中的GCHI編碼基因folE轉入擬南芥，其蝶啶和葉酸的含量分別增加了1 250倍和2～4倍；而姚琳［61］將大豆來源的GmGCHI和聯合GmGCHI/GmADCS分別在擬南芥中過表達，結果發現葉酸的含量分別增加了57%和111%，這與汪冉冉［63］的試驗結果類似。Akhtar等［59］在擬南芥將GGH的表達量提高3倍，使得葉酸含量減少39%，而通過RNAi減少GGH表達，會使多聚谷氨酸尾增加，導致擬南芥中葉酸含量增加34%。

除葉酸合成途徑中GCHI、ADCS和GGH 3種主要的酶外，有學者在模式植物中展開了對其他酶如5-FCL、DHPS、PTR1的研究。5-FCL是合成葉酸主要形式5-F-THF的重要酶之一，但5-F-THF會抑制其他葉酸依賴性酶的合成。Goyer等［53］通過抑制擬南芥中5-FCL使得其葉酸含量增加了2倍。梁業紅等［54］利用過表達細菌來源的DHPS使得葉酸含量提高45%，證實了DHPS在葉酸合成途徑中的調控作用。鹿曄等［60］通過利用組成型啟動子驅動依賴NADPH的利什曼原來源PTR1在擬南芥和煙草中進行過表達，發現轉基因PTR1的擬南芥5-F-THF含量增加，轉基因PTR1的煙草中5-M-THF含量增加。除此之外，陳金鳳等［64］為了研究葉酰聚谷氨酸合成酶DFB對其同工酶DFC的彌補作用，在擬南芥DFC突變體中過表達AtDFB，使得葉酸增加了90%～116%，進而驗證了DFB對DFC缺失的彌補作用。

4.1.5 其他物種。

在小麥中，研究發現分別過表達大豆來源的GmGCHI/GmADCS，可使葉酸含量提高62%～230%，但過表達密碼子優化的GmGCH/GmADCS可使小麥葉酸含量提高5.6倍［63］。在生菜和菜豆中，分別過表達雞和擬南芥來源的GCHI，使葉酸含量分別增加2.1～8.5倍和3.0倍，但在過表達AtGCHI和過表達AtGCHI/ADCS的馬鈴薯中葉酸含量無顯著變化［58，62，66］。因此，在不同的植物中過表達相同的葉酸合成代謝酶，葉酸的含量變化存在差異。

在轉錄水平，馬貴芳等［71］根據轉錄組分析結果揭示了ADCS、DHFR2 和GGH基因是谷穗葉酸積累的關鍵基因。張玖漪等［72］發現，在菠菜中除 SoGCHI、SoADCS和SoGGH外，大部分葉酸合成代謝途徑相關基因的表達量與菠菜葉酸總含量沒有明顯的規律性。在黃瓜中，周琪等［73］發現CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS、CsDHNA和CsADCS是影響黃瓜果實葉酸含量變化的關鍵基因，GCHI和ADCS是調控葉酸合成限速步驟的關鍵酶基因且功能相對保守。

綜上所述，同時過表達GCHI基因和ADCS基因會使葉酸含量顯著增加，但在相同作物中過表達不同來源的2個基因或在不同作物中過表達相同來源的2個基因結果導致葉酸增加比例不同，說明在不同植物中相同的酶可能發揮作用程度不同。另外，過表達HPPK、DHPS、DHFS、FPGS、DFB、GGHRNAi基因也會使作物中葉酸含量呈不同比例增加，但過表達GGH會使葉酸含量下降。這說明提高葉酸合成途徑中相關酶的編碼基因的表達或降低葉酸降解相關酶的編碼基因的表達對葉酸含量的提高存在著巨大潛力。因此，雖然已成功運用一些工程策略來提高葉酸含量，但不同作物中葉酸的代謝途徑較為復雜，未來仍需對其進行更深入的研究。

4.2 利用自然變異

由于公眾對于利用基因工程技術來提高葉酸含量的接受度相對較低，有研究者開始通過現代育種手段來改善農作物中微量元素的含量。分子育種技術是生物強化的一種行之有效的途徑，利用分子育種可以創制微量營養素強化作物，進而改善人們部分營養素缺乏現狀。

通過育種手段進行葉酸生物強化的前提是葉酸含量在目標物種中存在著足夠大的表型變異，進而可從群體中找到影響表型的數量性狀位點。董薇［34］通過QTL定位在重組自交系群體和回交群體中鑒定出3個與水稻葉酸含量相關的QTL（qFC-3a、qFC-3b和qFC-3c），貢獻率分別為7.8%、11.1%～15.8%和24.8%。Shahid［74］對524份對不同種質糙米中葉酸含量進行了全基因組關聯分析，針對5-M-THF、5-F-THF、THF和總葉酸4種成分含量性狀確定了16個顯著關聯SNP，并初步確定了16個葉酸含量候選基因。郭文柱［42］利用全基因組關聯分析和候選基因關聯分析發現了玉米籽粒中與5-F-THF含量變異顯著關聯基因ZmGFT1，并在該基因上發現2個顯著SNP位點，可以解釋5-F-THF含量變異的27.6%。接著對GFT1基因進行擴增重測序分析和表達分析發現了4個位于該基因5′UTR顯著關聯的InDel功能位點，并通過構建分離群體定位QTL與該基因的遺傳變異互相印證。潘廣磊等［75］通過對玉米GFT1基因的功能SNP位點分析發現，該位點存在3種類型的等位基因變異，即GGG、CAA、GAA，基因型為GGG的玉米中籽粒葉酸含量顯著高于基因型為GAA的玉米。根據功能SNP位點開發的CAPS標記GFT1-2，能準確鑒定GFT1的基因型。同時趙桐等［76］也通過五引物擴增受阻突變體系（penta-primer amplification refractory mutation system，PARMS）識別到GGG基因型玉米材料的平均葉酸含量顯著高于GAA和CAA 2種基因型。

目前，在作物中利用全基因組關聯分析或QTL定位來尋找與葉酸性狀相關聯的位點的研究還相對較少，未來可以通過該途徑尋找相應的變異位點，并進行進一步研究，為培育高葉酸作物品種打下分子基礎。

5 展望

隨著生活水平的提高，人們越來越重視葉酸缺乏的問題，葉酸生物強化也成為一個研究熱點。目前，對植物體內葉酸的合成代謝途徑已基本闡述清楚，然而，葉酸合成代謝的調控機理方面的研究還鮮有報道。研究者們已經在水稻和番茄等作物中通過基因工程手段提高葉酸含量，但此方法在其他作物中的應用仍待進一步研究。首先，后續研究可從轉錄水平、翻譯水平和代謝水平3個層次對不同作物的不同組織器官進行分析，這將有助于準確找到葉酸生物強化的突破點。其次，應加強對現有植物種質資源的挖掘，通過關聯分析和連鎖分析，挖掘植物中調控葉酸的新基因，結合分子標記輔助育種，將優良等位變異快速導入具有其他優良農藝性狀的親本中，縮短育種周期、提高育種效率。最后，可利用動物飼喂試驗測試葉酸生物強化的效果，闡明葉酸生物強化育種與人類健康的具體關系，明確不同葉酸衍生物對人體健康的影響，上述問題的回答將對人類的營養健康產生積極的影響。

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