黃粉蟲抗菌肽的誘導?分離及其抗菌活性研究

劉雪蘭 董以雷 Dalle Zotte 伏春燕 張亨 石天虹 李霞 魏祥法 劉瑞亭 閻佩佩

摘要 ［目的］探討不同方法誘導對黃粉蟲抗菌肽活性的影響，為黃粉蟲抗菌肽的修飾改造、分子克隆、外源表達等奠定基礎。［方法］選 7 齡、8 齡、9 齡的黃粉蟲幼蟲，以巴氏桿菌和沙門氏菌為誘導菌采用微量注射法、針刺法誘導抗菌肽，對不同菌液濃度和不同方法誘導的不同齡期黃粉蟲幼蟲抗菌肽的抑菌效果進行研究。［結果］①黃粉蟲齡期對抗菌肽活性有顯著影響。釆用巴氏桿菌和沙門氏菌作為誘導菌， 對 7 齡、8 齡和9 齡黃粉蟲進行誘導，在誘導處理中，8 齡幼蟲誘導的抗菌肽活性顯著大于其他齡期幼蟲誘導的抗菌肽活性 （P<0.05）。②不同菌液濃度誘導黃粉蟲幼蟲產生的抗菌肽抑菌活性存在差異。菌液濃度為對數期濃度稀釋100倍時抗菌肽活性顯著大于其他稀釋倍數誘導的抗菌肽活性 （P<0.05）。③不同方法誘導產生的抗菌肽抑菌活性存在差異。微量注射誘導的抗菌肽活性顯著大于針刺誘導的抗菌肽活性 （P<0.05）。④2種細菌誘導的抗菌肽活性有顯著差異。采用沙門氏菌誘導的抗菌肽最高活性顯著大于采用巴氏桿菌誘導的抗菌最高活性（P<0.05）。［結論］黃粉蟲抗菌肽的活性受黃粉蟲齡期、誘導源微生物種類、菌液濃度、誘導方法的影響。該研究中， 以8齡黃粉蟲為試驗動物，采用對數期沙門氏菌液稀釋100倍進行微量注射法誘導，所獲得的抗菌肽活性最好。

關鍵詞 抗菌肽；黃粉蟲；抑菌活性；誘導方法

中圖分類號 S899? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）06-0086-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.019

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Induction， Isolation and Antibacterial Activity of Antibacterial Peptides from Tenebrio molitor

LIU Xue-lan1，DONG Yi-lei1，Dalle Zotte2 et al

（1.Poultry Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciencces，Jinan， Shandong 250100； 2.University of Padua， Italy 35020）

Abstract? ［Objective］The purpose of this study was to explore the effects of different induction methods on the activity of Tenebrio molitor antimicrobial peptides， and lay the foundation for modification， molecular cloning， and exogenous expression of Tenebrio molitor antimicrobial peptides. ［Method］The 7， 8 and 9 instar larvae of Tenebrio molitor were selected for this study. Antibacterial peptides were induced by Pasteurella and Salmonella. Microinjection and acupuncture methods were used to study the antibacterial effects of antibacterial peptides induced by different concentrations of bacteria and different methods in Tenebrio molitor larvae of different ages. ［Result］The results showed that： ①The age of Tenebrio molitor had significant effect on the activity of antimicrobial peptides. The activity of antibacterial peptides induced by 8th instar larvae was significantly higher than that induced by other instar larvae （P<0.05）. ②The antibacterial activity of antibacterial?? peptides induced by different concentrations of bacterial solution was different. When the concentration of bacterial solution was diluted 100 times of the logarithmic phase concentration， the antibacterial peptide activity was significantly higher than that induced by other dilution multiples （P<0.05）. ③The antibacterial activities of antibacterial peptides obtained by different induction methods were different. The activity of antibacterial peptides induced by microinjection was significantly higher than that induced by acupuncture （P<0.05）. ④ The activity of antibacterial peptides induced by different bacteria was significantly different. The highest activity of antimicrobial peptides induced by Salmonella was significantly higher than that?? induced by Pasteurella （P<0.05）. ［Conclusion］The activity of antimicrobial peptide of Tenebrio molitor is affected by the age of Tenebrio molitor， the type of microorganism， the concentration of bacterial solution and the method of induction. In this study， Tenebrio molitor at the age of 8 was used as the experimental animal， and was induced by microinjection of salmonella solution diluted 100 times in logarithmic phase， and the antibacterial peptide activity obtained was the best.

Key words Antibacterial peptide；Tenebrio molitor；Antibacterial activity；Induction method

抗菌肽又叫抗微生物肽、肽抗生素，是生物機體在抵抗病原微生物侵染時產生的一類防御性小肽，通常為陽離子肽，含有 10～50 個氨基酸，分子量小，水溶性好，熱穩定性強，無免疫原性［1］ 。它作用于革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌、真菌、寄生蟲等，可以快速查殺靶標。與傳統抗生素相比，抗菌肽最大的優勢在于對機體安全、無毒、無副作用，病原菌不易產生耐藥性，是前景廣闊的新一代替抗產品。

昆蟲是現今陸生動物中最繁盛的一個類群，它在漫長的進化過程中形成了獨特而高效的先天防御體系。 當它受到損傷或被微生物感染后，短時間內迅速合成抗菌肽，并釋放入血淋巴中作用于細菌、病毒、 真菌等［2］。黃粉蟲是昆蟲家族中的重要成員，其食性雜、繁殖力強、飼養簡單、成本低，是很好的抗菌肽資源，引起科研工作者的廣泛關注。謝咸升等［3-7］學者曾對黃粉蟲抗菌肽的誘導、抗菌肽活性等進行了研究，但這些研究尚不系統，結果也不一致。為此，筆者對黃粉蟲抗菌肽的誘導、分離及其活性進行了較系統的研究，以期為黃粉蟲抗菌肽的修飾改造、分子克隆、外源表達等奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物。采用劉光華等［8］對蟲齡的劃分方法，選取 7、8、9 齡3個齡期的黃粉蟲幼蟲作為供試昆蟲，進行相關試驗。 由濟南秀泉黃粉蟲養殖中心提供。

1.1.2 試驗菌種。巴氏桿菌、沙門氏菌，該單位保存。

1.2 方法

1.2.1 黃粉蟲的飼養。黃粉蟲飼養在專門的養蟲室 （溫度 25～30 ℃ ，濕度 50%～80%），飼喂專門配制的飼料，飼料含水率控制在15%左右， 以保證黃粉蟲發育整齊。

1.2.2 抗菌肽誘導方法。

1.2.2.1 特定濃度菌液對黃粉蟲幼蟲抗菌肽的誘導。

（1）注射誘導。將以上試驗菌分別在 LB 肉湯培養基中培養至對數生長期，離心收集菌體，用無菌去離子水將菌液配制成 0.5 個麥氏比濁度，然后將菌液與 0.2%甲醛溶液在 28 ℃混合培養 12 h 進行滅活。

取飼養至 7、8和9 齡的幼蟲放入培養皿中，每個組 60 頭，每組分別用微量注射器注射菌液 0.8、1.2、1.6 pL ，在最佳條件下 （溫度 28℃ ，濕度 70%）飼養，分別在 24、48和 72 h 收集有活力 的幼蟲，-40 ℃保存， 以無誘導的幼蟲作為對照。每個處理重復 6 次。

（2）針刺誘導。取 7 、8 和 9 齡幼蟲各 60 頭為 1 組，共 3 組，用昆蟲針蘸取上述方法處理好的菌液，針刺幼蟲體壁，分別為 1 次、 2 次和 3 次，在最佳條件下飼養 （溫度 28 ℃ ，濕度 70%），于 72 h 收集有活力的幼蟲于-40 ℃保存， 以無誘導的幼蟲作為對照。每個處理重復 6 次。

1.2.2.2 不同濃度菌液對黃粉蟲幼蟲抗菌肽的誘導。

（1）注射誘導。取培養至對數生長期的巴氏桿菌、沙門氏菌菌液，離心收集菌體，加入 1mL無菌去離子水配制成菌懸 獨液，再用無菌去離子水將巴氏桿菌和沙門氏菌分別稀釋10 倍、100 倍、1000 倍，分別選取 7 齡、8 齡和 9 齡的黃粉蟲各 6 0 頭作為 1 組，共取 3 組。用微量注射器吸取 l pL菌液，從黃粉蟲幼蟲的背部注入。注射后繼續飼養 （溫度28 ℃，濕度 70%），3 天后收集存活的幼蟲，-40 ℃保存，以未處理的幼蟲為對照。每個處理重復6次。

（2）針刺誘導。菌液制備同上。用昆蟲針蘸取菌液，針刺幼蟲體壁，每只幼蟲扎刺 3 下，然后將誘導后的幼蟲在最佳條件下 （溫度 28℃ ，濕度 70%）分別繼續飼養，3 d后收集存活的幼蟲，-40 ℃保存， 以未處理的幼蟲為對照。每個處理重復 6 次。

1.2.3 抗菌肽的提取。取-40 ℃保存黃粉蟲幼蟲 0.5 g，加入1.5 mL的緩沖液，置于冰上充分研磨，移入 1.5 mL的離心管中，4 ℃，12 000 r/min，30 min；取出，將上清液移入新的 1.5 mL離心管中，置于 100 ℃水 浴 10 min；之后 4 ℃，12 000 r/min，離心30 min，將不含油層的粗提液移入 1.5 mL離心管中，-40 ℃保存備用。

1.2.4 抑菌試驗。在超凈臺內取 100 pL 0.5 麥氏比濁度的菌液 （巴氏桿菌、沙門氏菌）加入 NA 固體培養基，涂布均勻， 菌液干后在培養基上放置 6 片 0.5 mm滅菌雙層濾紙片 （離邊緣不小于 1.5 cm ，離中心不小于 2.5 cm）， 每片濾紙片上加入 25 pL抗菌肽粗提液并封口，待培養基表面干后將培養皿倒置于 37 ℃恒溫箱內培養，24 h后取出，測量抑菌圈大小，每個濾紙片測量 6 次。

1.2.5 數據處理方法。試驗數據以平均值±標準差表示，用 SAS 9.1.3 統計軟件進行單因素方差分析， 當差異顯著時（P<0.05），采用 Duncan 氏法做多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 微量注射特定濃度菌液對黃粉蟲抗菌肽的誘導

2.1.1 微量注射特定濃度巴氏桿菌對黃粉蟲抗菌肽的誘導。表1結果表明：7、8、9齡黃粉蟲幼蟲注射特定濃度的巴氏桿菌后，誘導的抗菌肽抑菌活性顯著大于未注射組 （P<0.05）；0.8 pL 組的 7 齡和 8 齡期黃粉蟲抗菌肽的活性隨作用時間的延長而顯著增加 （P<0.05）；1.2 pL 組的7 齡黃粉蟲抗菌肽的活性以 48 h最高，顯著高于 24 h的 活性（P<0.05），8 齡和 9 齡黃粉蟲的抗菌肽活性以 24 h的活性最高，顯著高于 48 h的活性（P<0.05）； 1.6 pL 組的 7 齡黃粉蟲抗菌肽活性以 72 h 最高，顯著高于 24和 48 h的活性 （P<0.05），8 齡和 9 齡黃粉蟲 24和 48 h的抗菌肽活性顯著高于 72 h的活性（P<0.05），24和 48 h間的抗菌肽活性差異不顯著 （P>0.05）。由表1 可以看出，用巴氏桿菌微量注射法誘導抗菌肽以注射 0.8 pL作用 72 h為宜。

2.1.2 微量注射特定濃度沙門氏菌對黃粉蟲抗菌肽的誘導。表2結果顯示：7 齡、8 齡和9 齡黃粉蟲注射特定濃度的沙門氏菌后，誘導的抗菌肽抑菌活性顯著大于未注射組 （P<0.05）；0.8 pL 組 7齡、8 齡、9齡期黃粉蟲的抗菌肽活性隨作用時間的延長而顯著增加 （P<0.05）；1.2 pL 組7齡黃粉蟲的抗菌肽的活性以 72 h最高，顯著高于 24 h的活性（P<0.05），8 齡和 9 齡黃粉蟲的抗菌肽的活性以 24 h的活性最高，顯著高于 48 h和 72 h的活性（P<0.05）；1.6 pL 組的7齡黃粉蟲抗菌肽的活性以 72 h最高，顯著高于 24 h的活性 （P<0.05），8 齡和 9 齡黃粉蟲各時間段的抗菌肽活性差異不顯著 （P>0.05）。試驗結果表明，以沙門氏菌微量注射法誘導抗菌肽以注射 0.8 pL 作用 72 h為宜。

2.2 針刺不同次數對黃粉蟲抗菌肽的誘導

2.2.1 針刺巴氏桿菌次數對不同齡期黃粉蟲抗菌肽的誘導結果。圖1 結果顯示：用同一濃度的巴氏桿菌針刺 7 齡黃粉蟲，針刺次數對誘導的抗菌肽抑菌活性無顯著影響 （P>0.05）；針刺 8 齡黃粉蟲，針刺次數對誘導的抗菌肽抑菌活性有顯著影響，針刺 2 次和 3 次的 抑菌活性顯著大于針刺 1 次 （P<0.05）；針刺 9 齡黃粉蟲，針刺次數對誘導的抗菌肽的抑菌活性也有顯著 影響，針刺 3 次的抑菌活性顯著大于針刺 1 次和 2 次 （P<0.05）。

2.2.2 針刺沙門氏菌次數對不同齡期黃粉蟲抗菌肽的誘導結果。圖2 結果表明：用同一濃度的沙門氏菌針刺7齡黃粉蟲，針刺次數對誘導的抗菌肽抑菌活性有顯著 影響 （P<0.05），針刺 2 次和 3 次獲得的抗菌肽抑菌活性顯著大于針刺 1 次 （P<0.05）；針刺 8 齡黃粉蟲，針刺次數對誘導的抗菌肽抑菌活性無顯著影響 （P>0.05）；針刺 9 齡黃粉蟲，針刺次數對誘導的抗菌肽的抑菌活性也有顯著影響，針刺 1次和3次的抑菌活性顯著大于針刺 2 次 （P<0.05）。

2.3 微量注射不同濃度菌液對黃粉蟲抗菌肽的誘導

2.3.1 微量注射不同濃度巴氏桿菌液對不同齡期黃粉蟲抗菌肽的誘導。圖 3 結果顯示：用不同濃度的巴氏桿菌注射 7 齡黃粉蟲誘導的抗菌肽活性以 1/100組最高，顯著高于1/10組和 1/1 000 組（P<0.05）；對于 8 齡黃粉蟲抗菌肽的誘導，1/10組和 1/100 組的活性顯著大于 1/1 000組 （P<0.05）；用 9 齡黃粉蟲進行抗菌肽誘導，1/10 組的活性顯著大于 1/100組和 1/1 000組 （P<0.05）， 1/100組顯著大于 1/1 000組（P<0.05）。

2.3.2 微量注射不同濃度沙門氏菌液對不同齡期黃粉蟲抗菌肽的誘導。圖4顯示：用不同濃度的沙門氏菌注射 7 齡黃粉蟲誘導的抗菌肽活性以 1/100 組最高，顯著高于 1/10 組和1/100組（P<0.05）；對于 8 齡黃粉蟲抗菌肽的誘導，各注射組的活性顯著大于對照組 （P<0.05），注射組間差異不顯著 （P>0.05）；用 9 齡黃粉蟲進行抗菌肽誘導，1/10 組的活性顯著大于 1/100 組和 1/1 000組（P<0.05），1/100 組和1/1 000組間差異不顯著 （P>0.05）。

2.4 針刺不同濃度菌液對黃粉蟲抗菌肽的誘導

2.4.1 針刺不同濃度巴氏桿菌液對不同齡期黃粉蟲抗菌肽的誘導。

圖5顯示：用不同濃度的巴氏桿菌液針刺 7 齡黃粉蟲誘導的抗菌肽活性以 1/100 組最高，顯著 高于 1/10 組和 1/1 000 組 （P<0.05）；對于 8 齡黃粉蟲抗菌肽的誘導，1/10 組和 1/100 組抗菌肽的活性顯著大于 1/1 000 組和對照組（P<0.05）；用 9 齡黃粉蟲進行抗菌肽誘導時，1/100 組的活性顯著大于 1/1 000組和對照組 （P<0.05），1/10 組和 1/100 組之間差異不顯著 （P>0.05）。

2.4.2 針刺不同濃度的沙門氏菌對不同齡期黃粉蟲抗菌肽的誘導。圖6結果顯示：用不同濃度的沙門氏菌針刺 7 齡黃粉蟲誘導的抗菌肽活性以 1/100 組最高，顯著高于 1/10 組、1/1 000 組和對照組 （P<0.05），1/10 組活性顯著大于 1/1 000組和對照組 （P<0.05），1/1 000 組和對照組間差異不顯著 （P>0.05）；對于 8 齡黃粉蟲抗菌肽的誘導，1/10 組和1/100組抗菌肽的活性顯著 大于 1/1 000 組和對照組 （P<0.05），1/10 組和 1/100 組之間、1/1 000 組和對照組之間差異不顯著 （P>0.05）； 用 9 齡黃粉蟲進行抗菌肽誘導時，1/100組的活性顯著大于 1/10 組、1/1 000 組和對照組 （P<0.05），1/10組和 1/1 000 組之間差異不顯著 （P>0.05）但顯著大于對照組 （P<0.05）。

3 討論

3.1 黃粉蟲齡期對抗菌肽活性的影響 該研究發現，黃粉蟲齡期對抗菌肽活性有顯著影響。用微量注射特定濃度巴氏桿菌液的方法誘導時， 注射的 3 種劑量均以 8和9 齡的黃粉蟲誘導的抗菌肽活性最大；注射特定濃度沙門氏菌 液誘導時，注射劑量為 0.8和1.2 pL 時， 以8和9齡的黃粉蟲誘導的抗菌肽活性最好，注射劑量為 1.6 pL 時，各齡期之間抗菌肽的活性趨同。微量注射不同濃度的巴氏桿菌和沙門氏菌菌液進行誘導時，7 齡黃粉蟲抗菌肽的活性最好。針刺相同濃度菌液進行抗菌肽的誘導時，7 齡和 8 齡黃粉蟲抗菌肽的活性高于9 齡黃粉蟲誘導的抗菌肽活性。針刺不同濃度巴氏桿菌和沙門氏菌菌液時，8和9 齡黃粉蟲抗菌肽的活性高于 7 齡。綜上，無論采取注射誘導還是針刺誘導，誘導源無論是巴氏桿菌還是沙門氏菌，以 8 齡黃粉蟲最佳。陳銳［9］分別以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為誘導源，分別誘導 8、9、10齡黃粉蟲抗菌肽時，各齡期的誘導效果不同，與該研究結果基本一致，但是不同的是，其認為9 齡黃粉蟲誘導效果最好，可能是由于誘導源不同所致。

3.2 誘導源的微生物種類對抗菌肽活性的影響 該研究中，2種細菌誘導的抗菌肽活性有顯著差異。 以沙門氏菌為誘導源所獲得的抗菌肽最高活性大于以巴氏桿菌為誘導源獲得的抗菌肽最高活性。謝咸升等［10］研究表明，不同菌源誘導免疫的黃粉蟲抗菌肽抑菌活性存在明顯差異。陳銳［9］分別以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為誘導源采用多種誘導方法對黃粉蟲 抗菌肽進行誘導，2種細菌所獲得的抗菌肽活性也有較大差異。 因此，微生物的種類對誘導的黃粉蟲抗菌肽活性具有顯著影響。

3.3 不同誘導方法對抗菌肽活性的影響 該研究分別用微量注射法和針刺法對黃粉蟲抗菌肽進行誘導，針刺法所獲抗菌肽的抑菌圈直徑最大為 0.80 mm，微量注射法所得抗菌肽的抑菌圈直徑最大為 0.91 mm 顯著大于針刺法， 由此可以看出，不同誘導方法誘導的抗菌肽活性有差異。陳銳［9］分別用注射法、微量注射法、飼喂法誘導黃粉蟲抗菌肽，誘導效果之 間的關系為微量注射法>注射法>飼喂法。陶淑霞等［6］采用紫外線、超聲波、菌液飼喂、菌液注射對黃粉蟲進 行抗菌肽的誘導，結果表明：不同誘導方法的黃粉蟲幼蟲血淋巴抑菌活性大小為菌液注射＞紫外線＞菌液飼喂＞超聲波。董杰超［11］采用針刺大腸桿菌法、超聲法、紫外線照射法誘導黃粉蟲抗菌肽，發現針刺大 腸桿菌法誘導的抗菌肽活性顯著大于超聲法和紫外線法，超聲法和紫外線法間結果差異不顯著。該研究及以上學者的研究結果表明，黃粉蟲抗菌肽的抑菌活性受誘導方法的影響。

3.4 菌液濃度對誘導的抗菌肽活性的影響 該研究發現，不同濃度菌液誘導的抗菌肽活性有顯著差異，且活性隨菌液濃度的變化有一個峰值， 以 稀釋 100 倍時誘導的抗菌肽活性最大， 當稀釋 1 000 倍時活性降低。陶淑霞等［6，9，11］與該研究得出的結果一致。陶淑霞等［6］用 5 齡黃粉蟲誘導抗菌肽，菌液注射劑量為 104 cfu/頭時獲得的抗菌肽活性大于注射劑量為 105cfu/頭時的活性；董杰超［11］用濃度分別為 1×105、1×107、1×109、1×1011、1×1013個/mL的大腸桿菌誘導黃粉蟲抗菌肽時，1×1011和 1×1013個/mL誘導的抗菌肽活性顯著大于其他濃度組。陳銳［9］研究表明：不同菌液濃度誘導黃粉蟲幼蟲產生的抗菌肽抑菌活性上存在差異；他將一定濃度的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別稀釋 10、100、1 000 倍，經過3種不同濃度的菌液誘導后發現，所有不同菌液濃度誘導處理中，菌液濃度為對數期濃度稀釋 100 倍時效果較好。

4 結論

誘導的黃粉蟲抗菌肽活性受黃粉蟲齡期、誘導源種類、菌液濃度、誘導方法的影響。該研究中，以 8 齡黃粉蟲為試驗動物，采用對數期沙門氏菌液稀釋 100 倍進行微量注射所獲得的抗菌肽活性最大。

參考文獻

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