microRNA在非滲出性年齡相關性黃斑變性氧化應激和脂質代謝中的作用

田 珍,張甜甜 ,李 靜

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)是一種慢性退行性疾病,也是導致發達國家不可逆中心視力喪失的主要疾病之一,隨著人口老齡化的發展,我國乃至全世界ARMD的患病率也呈現不斷上升趨勢,全世界約有170.2億人患有ARMD,全球約4%的失明原因是由于ARMD引起[1-3]。臨床上將ARMD主要分為兩種類型,即干性ARMD和濕性ARMD,干性ARMD也稱為非滲出性年齡相關性黃斑變性(nonexudative age-related macular degeneration,ARMD),干性ARMD患病人數占ARMD總人數的90%,其早期特征是視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)功能障礙以及玻璃膜疣(drusen)的形成,晚期發展為地圖樣萎縮(geographic atroph,GA)。缺氧及慢性炎癥導致Bruch膜通透性受損,脈絡膜毛細血管清除的物質積聚在RPE和Bruch膜之間形成玻璃膜疣,玻璃膜疣與局部Bruch膜膠原層增厚有關,而后者與脂質、蛋白質積累以及晚期糖基化終產物形成有關,晚期脂質糖基化終產物的沉積會破壞蛋白質穩定性并誘導光感受器和RPE細胞凋亡[4-5]。非滲出性ARMD的早期和中期階段視力變化不顯著,就診率低,患者多在影響視力及生活時就診,此時多數患者已發展到ARMD的晚期階段——萎縮期和瘢痕期[6]。

微小核糖核酸(microribonucleic acid,miRNA)是一類由18-22個核苷酸組成的內源性短鏈非編碼RNA,是基因表達的主要調節因子,通過堿基互補配對原則結合到靶信使RNA 3’非翻譯區(3’-UTR),在轉錄后調控目的基因的表達[7-8]。既往研究發現,miRNA失調與角膜、視網膜的多種疾病相關,多種miRNA在視網膜穩態和光感受器發育中起核心作用[9-11]。ARMD的發病機制涉及氧化應激、脂質代謝、炎癥、血管生成、細胞凋亡和吞噬等多方面的紊亂[12]。氧化應激是非滲出性ARMD的關鍵因素,RPE細胞受到不同程度的氧化損傷后細胞內miRNA表達量發生變化,且該變化與細胞損傷程度相關[13]。此外,在脂質代謝過程中,近期研究發現高濃度的高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)與非滲出性ARMD的風險增加有關,而高濃度總膽固醇和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)患者非滲出性ARMD的風險減少[14-16]。不同的miRNA可能通過不同的酶、蛋白通道或細胞在玻璃膜疣產生、脂質生成過程中發揮作用。雖然目前該領域的研究已取得了較大進展,但關于miRNA在非滲出性ARMD氧化應激、脂質代謝中的作用仍需進一步探索。本文對miRNA在非滲出性ARMD氧化應激、脂質代謝方面的作用機制進行綜述。

1 miRNA在非滲出性ARMD氧化應激中的作用

氧化應激誘導的RPE損傷和功能障礙是引起ARMD的主要致病因素之一[17],RPE位于感光細胞和脈絡膜毛細血管層之間,參與構成血-視網膜外屏障[18]。RPE對光感受器外節的吞噬、光感受器和脈絡膜毛細血管之間營養物質的攝取和廢物清除極其重要[19]。黃斑中心凹和RPE的血供主要來源于后方脈絡膜毛細血管系統,黃斑處RPE作為視網膜耗氧量最高的組織之一,其長期受到各種內源性和外源性氧化刺激,產生活性氧(reactive oxygen species,ROS),如超氧化物(O2·-)、羥基自由基(·OH)、過氧化氫(hydrogenperoxide,H2O2),導致RPE結構和功能損傷[20-21]。幾種常見的miRNA在非滲出性ARMD氧化應激中的作用見圖1。

1.1miR-125b和miR-626通過靶向Nrf2/HIF-1α信號通路保護RPE細胞免受氧化應激的影響Liu等[22]在濃度為500 μmol/L H2O2誘導的人視網膜色素上皮細胞(ARPE-19細胞)氧化損傷模型中發現miR-125b是一種全新的靶向Kelch樣ECH相關蛋白(Kelch-like ECH-related protein,Keap1)的miRNA,即Keap1是miR-125b的新靶點,過表達miR-125b可顯著抑制RPE細胞Keap1 3’-UTR活性,降低Keap1蛋白表達,減少抗氧化基因核因子E2相關因子(nuclear factor erythrocyte 2 related factor 2,Nrf2)降解并增加Nrf2核轉位,促進缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducing factor-1α,HIF-1α)蛋白降解,從而激活Nrf2/HIF-1α信號通路,提高細胞增殖能力和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平,減少ROS的過度產生,保護RPE細胞免受氧化損傷的影響;此外,miR-125b可直接與HIF-1α內部核糖體進入位點(IREs)結合,抑制HIF-1α蛋白表達,從而逆轉ROS誘導的HIF-1α表達增加,表明Nrf2和HIF-1α之間呈負相關,Nrf2是miR-125b的下游基因,miR-125b通過靶向Nrf2/HIF-1α信號通路保護RPE,減少其受到的氧化損傷,從而延緩非滲出性ARMD的發展。Yang等[23]研究表明,miR-125b模擬物可以直接促進Nrf2表達,也可以通過調節Keap1轉錄后提高Nrf2相應基因的表達,通過外源性補充miR-125b可以逆轉碘酸鈉(NaIO3)誘導的外層視網膜變薄,敲除Nrf2時,外層視網膜變厚的保護作用也隨之消失。Nrf2是miR-125b的下游靶基因在Zhang等[24]研究中也得到證實,該研究通過染色質免疫沉淀分析的方法發現Nrf2結合miR-125b的5’非翻譯區,Nrf2級聯激活可以保護RPE細胞免受氧化應激的影響。此外,Xu等[25]研究證明miR-626也可以靶向Keap1,激活Nrf2級聯反應,保護RPE細胞和其他細胞免受H2O2誘導的氧化損傷,相反,抑制miR-626可誘導Keap1上調和Nrf2級聯抑制,加劇RPE細胞的氧化損傷,miR-626在Keap1基因敲除或Nrf2基因敲除的RPE細胞中無效。由此可知,Nrf2級聯激活可減少RPE細胞氧化應激,miR-125b和miR-626通過靶向Keap1和Nrf2/HIF-1α信號通路調節Nrf2級聯反應減輕RPE氧化損傷,從而延緩非滲出性ARMD的發展。

圖1 miRNA在非滲出性ARMD氧化應激中的作用。

1.2miR-184通過HIF-1α/MMPs或AKT2/mTOR信號通路抑制缺氧減輕氧化應激Aykutlu等[26]通過使用甲磺酸甲氧胺鹽(DFX)和H2O2兩種缺氧和氧化應激誘導物建立體外ARMD模型發現miR-184可以通過抑制缺氧、血管生成和細胞凋亡減輕氧化應激和DNA損傷引起的非滲出性ARMD改變,轉染miR-184后抗氧化和DNA修復基因減少;過表達miR-184,HIF-1α和HIF-1β基因表達顯著降低,HIF軸下游的基質金屬蛋白酶(MMP)3基因和MMP9基因表達也降低。氧化應激誘導ARPE-19細胞中血管內皮生長因子(VEGF)上調的同時,增加HIF-1α的表達[27]。Babapoor-Farrokhran等[28]發現RPE在氧化應激刺激下,HIF-1α表達增加會引起HIF-1α依賴性血管生成物質升高,促進脈絡膜新生血管的發展,但光感受器中HIF-1α低表達也與非滲出性ARMD相關,表明HIF-1α在晚期非滲出性ARMD患者光感受器中發揮作用。Yang等[29]發現miR-184主要來源于RPE-脈絡膜,而不是視網膜,過表達miR-184可以抑制人脈絡膜內皮細胞(human choroidal endothelial cells,hCEC)的增殖和遷移,而miR-184抑制劑對遷移沒有顯著影響。miR-184在非滲出性ARMD患者的RPE中表達降低,β-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-beta serine/threonine-protein kinase,AKT2)是miR-184的直接靶點,miR-184通過直接結合AKT2并抑制AKT2/哺乳動物雷帕霉素靶點(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路促進RPE分化,miR-184的表達不足促進非滲出性ARMD發展[30-31]。熱休克蛋白(HSP60和HSP70)在氧化應激狀態下快速表達,可修復未折疊或折疊錯誤的蛋白質,在非滲出性ARMD中發現氧化應激后HSP60和HSP70基因表達增加,進一步研究發現貝伐單抗和miR-184對HSP60基因表達的抑制作用相似,但在抑制HSP70表達方面,miR-184反而更有效[26,32]。由此可見,上調miR-184可通過HIF-1α/MMPs軸或AKT2/mTOR信號通路抑制與缺氧相關的血管生成信號,延緩非滲出性ARMD的發展。

2 miRNA在非滲出性ARMD脂質代謝中的作用

脂質代謝失調會引發RPE和Bruch膜內過量的脂質積累形成玻璃膜疣,促進非滲出性ARMD的發展[33]。視網膜的Bruch膜中富含脂質,尤其是磷脂和膽固醇,當膽固醇穩態出現失衡,脂質和脂蛋白出現氧化,則會直接損害細胞功能,誘發氧化應激[34-35]。載脂蛋白(apo)是調控脂質代謝和膽固醇代謝過程中重要的結構蛋白,apoB100是早期非滲出性ARMD的標志[36-37]。研究表明,Bruch膜中的脂蛋白與體循環的脂蛋白不同,其含有apoB100、apoE和apoA1,且富含酯化膽固醇,大小與極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein,VLDL)相似[36-38]。RPE處理脂質的主要方式是通過光感受器外段的吞噬和降解,分泌含有apoB100的脂蛋白消除脂質,同時,RPE還具有主動的膽固醇逆向轉運系統,多余的膽固醇通過ABC轉運蛋白裝載,最終被高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)清除,未被清除的膽固醇重新返回肝臟。當衰老導致HDL和RPE細胞功能下降,未被降解的膽固醇則被RPE細胞以VLDL樣脂蛋白的形式分泌到基底外側,儲存到Bruch膜中形成玻璃膜疣[38-40]。RPE細胞通過表達脂蛋白攝入、合成、分泌、膽固醇合成及反向膽固醇轉運所必需的成分在維持視網膜膽固醇穩態中發揮關鍵作用。已發現有多種miRNA參與調節脂質代謝,某些成熟miRNA的缺失可能會影響脂質代謝,導致RPE細胞死亡,繼而導致視覺功能喪失[41]。幾種常見的miRNA在非滲出性ARMD脂質代謝中的作用見圖2。

2.1miR-223和miR-34a及miR-122作用于脂蛋白調控脂質代謝涉及RPE功能障礙的脂質代謝失調是ARMD的發病基礎,非滲出性ARMD的標志是黃斑區玻璃膜疣的沉積和地圖樣萎縮,過量的脂質和蛋白質積聚在Bruch膜中,可引起氧化應激和炎癥[42]。HDL具有促進膽固醇排出、抗炎、抗氧化和抗糖尿病的特點,多數研究認為其在心血管疾病、阿爾茨海默癥、糖尿病和敗血癥中發揮保護性作用,但近年部分學者認為較高的HDL與ARMD風險增加相關[14,43]。研究顯示,HDL與ARMD的風險增加呈正相關,可能是食物和藥物的影響,也可能與HDL亞型有關[15-16]。此外,也有學者發現人RPE細胞分泌的Bruch膜脂蛋白樣高密度物質與從血漿中分離的HDL雖然密度和大小相似,但組成結構不同,而多數關于ARMD風險的研究依賴于血漿脂蛋白水平,但實際上眼局部合成和分泌的脂蛋白可能更重要,因此靶向HDL或Bruch膜脂蛋白樣高密度物質或許可以延緩非滲出性ARMD的發展[44-45]。研究發現,在玻璃體內注射β淀粉樣蛋白誘導發生RPE變性小鼠的RPE/脈絡膜中miR-223表達增加,而miR-223可直接抑制高密度脂蛋白受體(HDL-R)的清道夫受體來調節HDL攝取,還可通過抑制羥甲基戊二酰輔酶A還原酶1(HMG-CoA合酶1)和甲基甾醇單加氧酶1抑制膽固醇的生物合成[46-47]。但Zhang等[48]發現apoB/非高密度脂蛋白膽固醇比值是濕性ARMD的獨立危險因素。氧化應激引起的脂質過氧化是非滲出性ARMD的主要原因,氧化低密度脂蛋白(oxidized LDL,oxLDL)具有細胞毒性,是由LDL在促氧環境中通過修飾其脂質或蛋白質形成的,在玻璃膜疣中也發現oxLDL的存在,且在RPE下可見到oxLDL沉積[39]。LDL可以由VLDL轉變而來,視網膜富含LDL,其可被RPE和Müller細胞中的LDL受體(LDL-R)吸收,LDL-R受損可導致脂質積累和視網膜功能受損,促進非滲出性ARMD的發展[49]。在整個視網膜和非滲出性ARMD患者的黃斑區miR-34a表達明顯上調,隨著小鼠RPE和視網膜的衰老,miR-34a表達也顯著增加,RPE中的miR-34a過表達可能限制apoB100脂蛋白的分泌,導致RPE中脂質積累,誘導細胞功能障礙[50-51]。與miR-34a不同,miR-122是膽固醇和脂肪酸合成的關鍵調節因子,也是脂蛋白穩態的關鍵調節因子,miR-122缺乏會降低肝臟微量白蛋白表達,VLDL的產生和血漿脂質水平[52-53]。因此,靶向HDL可以延緩ARMD的發展,LDL-R受損可促進非滲出性ARMD的進展,miR-223可直接靶向HDL抑制膽固醇生成,延緩非滲出性ARMD的發展,而影響oxLDL的miRNA則促進非滲出性ARMD發展。

圖2 miRNA在非滲出性ARMD脂質代謝中的作用。

2.2miR-33a/b靶向ABCA1調節膽固醇轉運參與脂質代謝膽固醇是脂質中的一種,甾醇調節元件結合蛋白(SREBP)與多種miRNA協同促進脂質合成和攝取,miR-185被甾醇調節元件結合蛋白1c(SREBP1c)轉錄激活并負調節SREBP2表達,從而抑制膽固醇的生物合成和LDL的攝取,調節膽固醇穩態[54]。miR-33b位于17號染色體上SREBP1基因的內含子中,但miR-33b通過靶向ATP結合盒轉運蛋白(ABCA1)促進細胞內膽固醇、脂肪酸和其他脂質升高,參與膽固醇的外排[55]。ABCA1是RPE中主要的膽固醇轉運蛋白之一,也是一種與ARMD基因相關的膽固醇外排泵,ABCA1過表達可以增加膽固醇排出,減少脂質負荷,提高RPE存活率,從而降低非滲出性ARMD的發生風險[56-57]。RPE中ABCA1的表達隨著年齡的增長而逐漸下降,缺乏ABCA1的小鼠會出現膽固醇沉積、RPE和光感受器的變性和炎癥[58]。Storti等[58]在缺乏ABCA1的小鼠中也證實RPE中脂質蓄積、視網膜功能降低、視網膜炎癥和光感受器變性,表明ABCA1功能降低對非滲出性ARMD的致病作用。抑制miR-33a/b導致ABCA1水平顯著升高,抗miR-33a治療也可顯著增加血清總膽固醇中HDL-C的水平,抗miR-33a/b處理非人類靈長類動物的RPE/脈絡膜,其游離膽固醇和膽固醇顯著降低,膽固醇積累減少,RPE細胞中炎癥浸潤及RPE形態的病理改變均減少,靶向miR-33可能會減少膽固醇沉積并延緩非滲出性ARMD進展[59]。研究表明,RPE中ABCA1缺失會導致脂質積累和RPE萎縮,miR-33和miR-34a在衰老的RPE細胞中表達增加,通過拮抗ABCA1靶向的miR-33和miR-34a可減輕RPE或巨噬細胞引起的黃斑變性[51]。膽固醇和脂蛋白易沉積于RPE上形成玻璃膜疣;此外,RPE引起的炎癥促進免疫細胞浸潤,miR-33a/b的靶向治療可以促進RPE細胞中膽固醇的清除,減少RPE介導的炎癥反應,并減輕非滲出性ARMD的病理變化[38]。此外,miR-128和miR-148a可直接降低ABCA1表達,去除肝細胞、巨噬細胞和RPE細胞中多余的膽固醇[60]。總之,RPE中ABCA1的缺失會影響膽固醇排出,導致脂質積累和RPE萎縮,miR-33和miR-34a在衰老的RPE 細胞中表達增加,通過靶向miR-33和miR-34a上調ABCA1可促進RPE細胞中膽固醇的清除和炎癥減少,減輕RPE引起的黃斑變性。

2.3幾種miRNA通過調節巨噬細胞的膽固醇穩態參與脂質代謝巨噬細胞也參與非滲出性ARMD的發展,衰老巨噬細胞中相應的膽固醇排出能力降低與視網膜炎癥水平升高和ABCA1表達下調有關[47]。apoA1可以激活卵磷脂-膽固醇酰基轉移酶,將組織內多余的膽固醇轉運至肝臟進行代謝,ABCA1可通過apoA1將巨噬細胞內的膽固醇轉運至肝臟,并調節HDL的生成,從而控制膽固醇逆向轉運[57,61]。Goedeke等[61]發現過表達miR-27b可明顯降低ABCA1和線粒體甘油-3磷酸酰基轉移酶(GPAM)重組蛋白水平,降低肝臟膽固醇排出和HDL的生成;相反,抑制內源性miR-27b顯著增加細胞中ABCA1和GPAM重組蛋白的表達,膽固醇排出增加。因此,miR-27b能調節肝臟膽固醇排出和肝臟中HDL的生成。Nordestgaard等[14]發現ABCA1的遺傳變異與高濃度HDL有關,高濃度HDL相關的ABCA1氨基酸改變會增加非滲出性ARMD的發生風險。Kim等[62]也發現ATP結合轉運蛋白ABCA1和ABCG1在調節HDL的形成和巨噬細胞膽固醇排出中至關重要,5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR)可上調RPE中的ABCA1/ABCG1表達,減少apoE缺陷小鼠的Bruch膜脂質沉積。在巨噬細胞衰老過程中,miR-714上調膽固醇的生成,FDFT1作為衰老巨噬細胞和年輕巨噬細胞對膽固醇反應差異的關鍵miRNA,其通過提高膽固醇的表達誘導非滲出性ARMD的發生,miR-714-FDFT1通過調節衰老巨噬細胞的膽固醇穩態參與非滲出性ARMD形成[63]。總之,巨噬細胞中ABCA1的表達下降會影響膽固醇排出,引起脂質沉積,促進非滲出性ARMD發展。此外,高濃度HDL相關的ABCA1氨基酸改變也會增加非滲出性ARMD的發生風險。

3小結與展望

目前,關于非滲出性ARMD的發病機制研究眾多,氧化應激是影響玻璃膜疣的關鍵因素,本文總結了miR-125b、miR-626和miR-184通過靶向Nrf2、HIF-1α抑制缺氧相關的血管生成信號或減輕RPE氧化損傷影響非滲出性ARMD的發展。此外,在脂質代謝過程中,miR-33a、miR-33b、miR-27b和miR-34a等通過影響脂蛋白的攝取或調節RPE和巨噬細胞中ABCA1的表達調節膽固醇的排出,從而影響非滲出性ARMD的進程。既往已有較多研究證明miRNA對于非滲出性ARMD的發病機制及早期診斷具有重要作用,了解miRNA在非滲出性ARMD中的作用機制將為ARMD提供更好的靶向治療思路和預防方法。但非滲出性ARMD涉及的氧化應激和脂質代謝機制復雜,關于miRNA是否通過其他信號通路或靶點參與非滲出性ARMD的氧化應激過程和脂質代謝途徑有待進一步探究。此外,關于miRNA在非滲出性ARMD自噬、慢性炎癥、免疫等方面的研究仍需進一步探索。