巴伐奇寧調節PI3K/AKT/mTOR信號通路對結直腸癌細胞惡性進展的影響

李偉,江陶,馮雪莉,程吉兵,唐玲

(川北醫學院附屬醫院,1.藥劑科;2.骨科;3.檢驗科,四川 南充 637000)

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是在臨床上常見的一種消化系統惡性腫瘤,包括結腸癌和直腸癌[1]。目前認為,其發生的分子基礎主要是原癌基因和抑癌基因表達水平的失衡[2]。有研究[3-4]報道,CRC發病數量達到193萬例以上,占這一年確診惡性腫瘤的9.7%,且其發病率排名第三,致死率排名第二,對CRC患者的生命造成嚴重威脅,因此尋找其發病機制進行具體研究至關重要[5]。補骨脂是一種中草藥,而巴伐奇寧(bavachinin,BVC)是從補骨脂中提取出的一種活性黃烷酮類物質,研究[6]發現,BVC具有抗血管生成、抗炎等多種功能。Zhao等[7]研究發現,BVC可以誘導結腸腫瘤中細胞的凋亡。已有研究[8]發現,磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路在多種腫瘤的發生發展過程中具有重要作用。在胃癌中,激活PI3K/AKT/mTOR信號通路,會促進胃癌的進展[9]。因此,本研究基于PI3K/AKT/mTOR信號通路探究BVC對結直腸癌細胞惡性進展的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

人結直腸癌細胞系SW480細胞購自北京伊塔生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI 1640培養基(上海富雨生物科技有限公司,貨號:FY-PLS1368);BVC(艾美捷科技有限公司,貨號:MBS3608190);Ly294002(江蘇凱基生物技術股份有限公司,貨號:KGR0049);740Y-P(武漢博歐特生物科技有限公司,貨號:orb762808);胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司,貨號:X1020-10);96孔板(上海信帆生物科技有限公司,貨號:XF-P3139);細胞計數試劑盒8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)(艾美捷科技有限公司,貨號:BY-Q50356);PBS(武漢益普生物科技有限公司,貨號:PB180521);AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海復申生物科技有限公司,貨號:556547);6孔板(上海研謹生物科技有限公司,貨號:J-SYA0352);基質膠(Matrigel)(上海研卉生物科技有限公司,貨號:354234);Transwell(上海代軒生物科技有限公司,貨號:3422);結晶紫(北京伊塔生物科技有限公司,貨號:YT8810);蛋白裂解液(上海研謹生物科技有限公司,貨號:RIPA20110527);總蛋白提取試劑盒(上海晶風生物科技有限公司,貨號:31013-50T);BCA試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,貨號:PA115-01];PVDF膜(愛必信(上海)生物科技有限公司,貨號:abs932);脫脂奶粉(上海聯碩生物科技有限公司,貨號:N/A-433);PI3K(貨號:ab302958)、AKT(貨號:ab278565)、mTOR(貨號:ab109268)、GAPDH(貨號:ab181602)抗體購自Abcam;CO2的細胞培養箱(Eppendorf艾本德中國,型號:000000002);酶標儀(美谷分子儀器(上海)有限公司,型號:SpectraMax iD3);流式細胞儀(賽默飛世爾科技,型號:A24858);倒置顯微鏡(Labcan Scientific,型號:DMi1);凝膠成像儀(上海金鵬分析儀器有限公司,型號:2020031203)。

1.3 細胞培養與分組

1.3.1 細胞培養 將SW480細胞接種在RPMI 1640培養基(含10%胎牛血清)中,在溫度37 ℃,5% CO2的細胞培養箱中進行培養,定期對培養液進行更換(間隔2～3 d),觀察細胞的顏色以及生長狀態,并據此收集細胞進行傳代以及后續實驗研究。

1.3.2 細胞分組 將細胞在RPMI1640培養基(15%胎牛血清)中正常培養,未做任何處理的SW480細胞作為對照組,用10 μmol/L濃度BVC處理的培養基培養的SW480細胞為低劑量巴伐奇寧組(L-BVC組),用20 μmol/L濃度BVC處理的培養基培養的SW480細胞為中劑量巴伐奇寧組(M-BVC組),用40 μmol/L濃度BVC處理的培養基培養的SW480細胞為高劑量巴伐奇寧組(H-BVC組),用濃度為25 μmol/L PI3K抑制劑Ly294002處理的培養基培養的SW480細胞作為Ly294002組,用濃度為30 μmol/L BVC和10 μmol/L PI3K激活劑740Y-P共同處理的培養基培養的SW480細胞作為H-BVC+740Y-P組。

1.4 CCK-8試劑盒檢測SW480細胞活性

收集1.3.2中各組培養至對數生長期的SW480細胞,用胰蛋白酶進行消化后接種在96孔板中,并加入CCK-8溶液,置于細胞培養箱(37 ℃,5% CO2)中進行培養,48 h后,用酶標儀對各組細胞的吸光值(OD450 nm值)進行檢測。

1.5 流式細胞術檢測SW480細胞凋亡

收集1.3.2中各組培養至對數生長期的SW480細胞,加入胰蛋白酶消化,消化后用預冷的PBS清洗,離心取沉淀,加入結合緩沖液對沉淀中的細胞濃度進行一定的調整,加入AnnexinV-FITC和PI,避光孵育10 min,用流式細胞儀對細胞凋亡情況進行檢測。

1.6 劃痕實驗檢測SW480細胞遷移能力

收集1.3.2中各組培養至對數生長期的SW480細胞,將其分別接種于6孔板中培養,培養24 h后使用槍頭的尖端輕輕劃動6孔板,繼續培養,24 h后取出。分別在倒置顯微鏡下觀察0 h和24 h的劃痕,并觀察細胞遷移情況,計算劃痕愈合率(%)。

1.7 Transwell法檢測SW480細胞侵襲能力

先取少量的經過4 ℃融化的基質膠(Matrigel)加入Transwell中進行預包被。收集1.3.2中各組培養的SW480細胞用培養基(不含血清)進行重懸,再加入Transwell上室中(已包被基質膠),在Transwell下室加入培養基(含10%胎牛血清),置于細胞培養箱(37 ℃,5% CO2)中培養24 h,多聚甲醛固定30 min,0.1%結晶紫染色,在顯微鏡下觀察并拍照計算侵襲細胞數。

1.8 Western blot檢測細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白表達情況

收集1.3.2中各組培養至對數生長期的SW480細胞,加入蛋白裂解液在冰上進行30 min裂解,裂解后離心取上清,對各組細胞提取總蛋白(總蛋白提取試劑盒),測定蛋白總量(BCA試劑盒)。將得到的蛋白質提取物利用SDS-PAGE凝膠電泳進行分離,轉移到PVDF膜上,冰上反應1 h,清洗,5%的脫脂奶粉封閉30 min,清洗,分別加入(PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和GAPDH)抗體,4 ℃過夜;加入二抗,室溫孵育2 h。用凝膠成像儀對蛋白表達情況進行觀察。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 BVC對SW480細胞增殖的影響

與對照組比較,L-BVC組、M-BVC組、H-BVC組、Ly294002組的OD值均降低,且隨著BVC劑量的增加,OD值逐漸降低(P<0.05);與H-BVC組比較,H-BVC+740Y-P組的OD值顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 BVC對SW480細胞增殖的影響

2.2 BVC對SW480細胞凋亡的影響

與對照組比較,L-BVC組、M-BVC組、H-BVC組、Ly294002組的細胞凋亡率均升高,且隨著BVC劑量的增加,細胞凋亡率逐漸升高(P<0.05);與H-BVC組比較,H-BVC+740Y-P組的細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖1及表2。

表2 BVC對SW480細胞凋亡的影響

2.3 BVC對SW480細胞遷移的影響

與對照組比較,L-BVC組、M-BVC組、H-BVC組、Ly294002組的劃痕愈合率降低,且隨著BVC劑量的增加,劃痕愈合率逐漸降低(P<0.05);與H-BVC組比較,H-BVC+740Y-P組的劃痕愈合率顯著升高(P<0.05)。見圖2和表3。

表3 BVC對SW480細胞遷移的影響

2.4 BVC對SW480細胞侵襲的影響

與對照組比較,L-BVC組、M-BVC組、H-BVC組、Ly294002組的侵襲細胞數減少,且隨著BVC劑量的增加,侵襲細胞數逐漸減少(P<0.05);與H-BVC組比較,H-BVC+740Y-P組的侵襲細胞數顯著增加(P<0.05)。見圖3及表4。

表4 BVC對SW480細胞侵襲的影響

2.5 BVC對SW480細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

與對照組比較,L-BVC組、M-BVC組、H-BVC組、Ly294002組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR /mTOR比值均降低,且隨著BVC劑量的增加,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值逐漸降低(P<0.05);與H-BVC組比較,H-BVC+740Y-P組的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值顯著升高(P<0.05)。見圖4及表5。

表5 各組SW480細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白水平

3 討論

目前,CRC的發病率呈現不斷增加的趨勢,給患者家庭及醫療衛生系統帶來了沉重的負擔[10-11]。臨床上常用的治療方式是以手術切除為主,靶向治療以及化療為輔,以此來提高患者的生存期[12]。隨著社會的發展,手術技術不斷提高以及化療等輔助治療方面也在不斷進步,CRC患者的5年生存率也由原來的50%提高至65%,但仍未達到預期效果,需要進一步深入研究[13]。CRC發生發展的分子機制還不明確,因此,需要深入研究其發生發展涉及的相關機制,為CRC的早期診斷以及治療提供理論依據。BVC是從中草藥中提取得到的一種物質,已有相關研究發現,BVC也可誘導非小細胞肺癌中細胞的凋亡[14-15]。本研究中,使用不同濃度的BVC處理SW480細胞,發現BVC可以逐漸降低SW480細胞的OD值、劃痕愈合率、侵襲細胞數,升高細胞凋亡率,表明BVC可以促進SW480細胞的凋亡,抑制細胞的增殖、遷移和侵襲。

PI3K是存在于胞質內的磷脂酰肌醇激酶,容易被一些刺激所激活,AKT是一種絲氨酸激酶,在細胞的生物學過程中發揮作用[16]。PI3K的激活會引起PI3K磷酸化的發生,AKT是PI3K的活化受體,會被磷酸化的PI3K招募并轉運細胞膜上,AKT在多種酶的作用下,進行磷酸化,并參與細胞的調節,mTOR是PI3K/AKT的下游靶點,會被磷酸化的AKT激活,從而參與細胞生長的調控[17]。Fattahi等[18]研究發現,激活的PI3K會促使AKT的磷酸化,AKT磷酸化后進一步激活mTOR的磷酸化,從而參與腫瘤的發展。Han等[19]研究發現,激活PI3K/AKT/mTOR信號通路,可影響細胞自噬、凋亡以及相關炎癥因子的表達。Deng等[20]研究發現,利用一定的藥物對PI3K/AKT/mTOR信號通路進行抑制,會促進食道癌細胞的自噬及凋亡。本研究發現,與對照組相比,BVC處理后SW480細胞的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值均顯著降低,表明BVC可以激活PI3K,促進其磷酸化,進而促進AKT、mTOR磷酸化的發生,其作用與PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑Ly294002保持一致。隨后進一步用PI3K/AKT/mTOR信號通路激活劑740Y-P進行回補實驗,結果發現,H-BVC+740Y-P組OD值、劃痕愈合率、侵襲細胞數顯著升高,細胞凋亡率顯著降低,同時740Y-P的加入也促進了PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的磷酸化。由此推測BVC對結直腸癌細胞惡性進展的抑制可能與PI3K/AKT/mTOR信號通路被抑制有關。

綜上,BVC對結直腸癌細胞惡性進展的抑制可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路實現的。