深度燒傷痂脂肪干細胞源性外泌體蛋白組學差異的初步研究

巴雅力嘎,巴特,李全,高雷,李芳,曹勝軍

(1.內蒙古科技大學包頭醫學院,內蒙古 包頭 014060;2.內蒙古醫科大學第三附屬醫院燒傷外科·內蒙古燒傷醫學研究所,內蒙古 包頭 014010)

外泌體是由細胞分泌產生直徑30～150 nm的小囊泡,內含各種RNA、DNA、蛋白質等,可介導細胞間信息傳遞及調控細胞功能活動[1-2]。同一個體不同細胞來源乃至不同病理生理狀態下,外泌體所含蛋白質組及其執行的生物學功能不盡相同[3-4]。蛋白質組學是研究不同蛋白質之間相互作用及其在生物體內發揮功能的有效手段,可為疾病的診斷與治療提供一定的理論依據[5]。

創面修復與瘢痕防治是燒傷外科學重點和難點。脂肪干細胞源性外泌體(adipose stem cell exosomes,ADSC-Exos)具有促進創面愈合、重塑及減輕瘢痕過度增生的作用[5-7],但關于ADSC-Exos 的蛋白組學研究鮮有報道。本研究以深度燒傷痂與正常皮下脂肪組織來源ADSC-Exos為研究對象,應用非標記定量蛋白質譜(label free quantification,LFQ)技術研究ADSC-Exos 蛋白質組表達水平差異,篩選標志蛋白并對其進行分析。

1 試劑與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗主要儀器及試劑 顆粒物粒度分析儀(NanoSight NS300,英國馬爾文公司);生物型透射電子顯微鏡(Tecnai G2 SpiritBiotwin,美國FEI公司);智能型高效離心機(AvantiJXN-30,美國貝克曼庫爾特公司);質譜儀(timsTOF Pro,美國布魯克公司);液相色譜儀(UltiMate 3000 RSLCnano,丹麥泰爾茂費舍爾公司);0.15%Ⅰ型膠原酶(美國Gibco公司);胎牛血清(美國Gibco 公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Sigma公司);成骨、成脂培養基(中國 Cyagen Biosciences Inc.公司);碳支持膜(中國中鏡科儀公司);10%胎牛血清(美國Gibco公司);0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司);兔抗人CD64(日本SAB公司);兔抗人CD81單克隆抗體(日本Epitomics公司); DMEM/F12基礎培養基(美國Hyclone公司)等。

1.1.2 取材對象 實驗組選取Ⅲ度燒傷且<10%體表面積的痂下脂肪組織,患者年齡36～54歲;對照組選取整形外科患者,取腹部抽脂術中廢棄的皮下脂肪組織,年齡38～52歲。兩種來源的脂肪組織肉眼觀察呈淡黃色,質地均勻、光滑、富有彈性,無明顯液化、碳化、硬結。手術過程中的脂肪組織均選取肉眼觀察健康的脂肪組織,對獲取脂肪干細胞(adipose stem cell,ADSC)進行分離與傳代,對初代ADSC-Exos進行蛋白組學分析。兩組患者年齡差異無統計學意義(P>0.05)。

1.1.3 統計學分析 樣本定量結果取log2,采用雙樣本雙尾T檢驗的方法計算P值。 以P<0.05且差異表達量變化>1.5或<0.67分別作為顯著上調及下調的閾值。

1.2 實驗方法

1.2.1 ADSC的分離、傳代及鑒定 將實驗組和對照組脂肪使用含雙抗的磷酸鹽緩沖液沖洗,除去多余組織,將脂肪組織剪碎,加入I型膠原酶消化外基質,使用濾網將溶解的脂肪組織從緩沖液中分離,在4 ℃條件下300×g離心除去其余夾雜細胞,棄去上清液及脂滴,獲得初代ADSC[8]。將獲得的細胞染色,光鏡下進行觀察,拍照記錄。采用Western blot法將培養基中初代細胞離心后收集蛋白質,將得到的蛋白質電泳分離,轉移至膜上,測定CD29、CD34、CD105表達水平。使用成骨、成脂培養基誘導 ADSC向成骨、成脂細胞分化,染色結果為鑒定ADSC提供參考[8]。

1.2.2 ADSC-Exos的分離與鑒定 取ADSC,用胎牛血清培養基培養,待細胞融合后用胎牛血清反復清洗,將培養基更換為不含胎牛血清培養基繼續培養36～48 h,收集培養基上清液,采用差速離心法4 000×g離心40 min除去細胞碎片及較大囊泡,獲得外泌體濃縮液。將外泌體濃縮液移至濃度30%蔗糖/重水密度墊上,離心管100 000×g 離心2 h,收集底部外泌體[8]。取20 μL外泌體懸液滴至電子顯微鏡銅網狀柵中等待,負染、固定,晾干后拍照觀察。使用去離子水溶液倒入20 μL外泌體濃縮液稀釋至1 000 μL,上樣,用Nanosight顆粒粒度分析儀檢測ADSC-Exos的粒徑和濃度,評估性質和質量。Western blot法測定 ADSC-Exos 表面標志物 CD81、CD64 表達水平[8]。

1.2.3 利用LFQ技術檢測ADSC-Exos蛋白組學 (1)樣品處理:向ADSC-Exos中加入裂解液充分混勻,進行組織勻漿離心,取上清。沉淀蛋白。將蛋白沉淀復溶,加入二硫蘇糖醇孵育,加入碘乙酰胺進行烷基化反應。利用 Bradford 法測定蛋白濃度。向還原、烷基化樣品中加入100 mmol/L Tris-HCl 溶液,將 Urea 濃度稀釋至 <2 mol/L,以酶與蛋白 1∶50質量比加入胰蛋白酶,37 ℃孵育振蕩酶切。第2天加入三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA )終止酶切,取上清進行脫鹽,抽干-20 ℃凍存待用。(2)質譜檢測:樣品進樣與分離通過質譜儀在線液相色譜儀進行。肽段樣品通過自動進樣器吸入,結合至補集柱(trap column,TC),洗脫至分析柱進行分離。利用兩個流動相建立分析梯度60 min。肽段進入質譜進行數據依賴采集模式(data dependent acquisition,DDA)掃描。(3)數據分析:質譜數據通過MaxQuant (V1.6.6) 軟件進行檢索,數據庫檢索算法為Andromeda,使用Uniprot中Human的蛋白質組參考數據庫[9]。

2 結果

2.1 ADSC 的分離、培養與鑒定

兩組患者初代ADSC體積較小,呈多形性,細胞形態分散。第2代ADSC保持較小的細胞體積和多形性,形態更為均勻、黏附性和增殖能力進一步增強。第3代ADSC細胞體積和形態更加統一,細胞的黏附性和增殖能力進一步增加光鏡下呈纖維樣、漩渦狀或放射狀生長,偶見多角形、紡錘形。細胞穩定表達ADSC 表面標志物CD29、CD105,未表達CD34(造血系分子標志物)。成骨誘導的細胞進行茜素紅染色,鏡下見成骨細胞特征性紅色密集的鈣結節。成脂誘導的細胞胞漿內有大量透亮、折光性好的脂滴,油紅O染色呈紅色。見圖1。

2.2 ADSC-Exos分離與鑒定

透射電鏡下可見分布較集中的外泌體,分散良好,直徑30～150 nm,大小均一,呈雙膜性結構的圓形或類圓形,中央較邊緣電子密度稍低。Western blot檢測顯示,ADSC-Exos穩定表達表面標志物CD63、CD81。 NanoSight納米顆粒跟蹤分析表明,外泌體均勻對稱分布,純度較高,大部分直徑30～150 nm,符合外泌體正常的粒徑范圍。見圖2。

2.3 ADSC-Exos差異蛋白分析

基于LFQ技術,實驗組/對照組差異倍數>1.5或<0.67,通過MaxQuant (V1.6.6)軟件篩選出表達差異蛋白184個,篩選上調蛋白前10位絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、轉化生長因子β-1(transforming growth factor beta-1,TGF-β1)、細胞凋亡調節因子BAX(apoptosis regulator BAX,BAX)、熱休克蛋白HSP 90α(heat shock protein 90-alpha,HSP 90α)、微管蛋白α-1B鏈(tubulin alpha-1B chain,Tα-1B)、腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白2(adenovirus E1B 19kDa interacting protein 2,AEIP2)、鈣調素3(calmodulin-3,Clam3)、熱休克蛋白HSP 90β(heat shock protein 90-beta,HSP 90β)、蛋白激酶Cβ型(protein kinase C beta type,PKCβ),下調蛋白前10位激肽源B1(kallikrein B1,KLKB1)、激肽源1(kininogen 1,KNG1)、補體C3(complement C3,C3)、補體C1q C鏈(complement C1q C chain,C1q C)、補體C1q B鏈(complement C1qB chain,C1qB)、補體C5(complement C5,C5)、補體C1q A鏈(complement C1q A chain,C1q A)、補體C4B(complement C4B,C4B)、補體C4A(complement C4A,C4A)、補體C9(complement C9,C9)進行分析。見表1。

表1 不同來源ADSC-Exos蛋白表達水平差異

3 討論

間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)作為一類多能非造血成體干細胞,骨髓、肌肉、肺、肝、胰腺、脂肪等組織中均可分離培養,來源廣泛,具有向多種細胞分化、免疫調節、自我更新、抗炎及創面修復的能力[10-11]。ADSC隸屬于MSC,易于獲取且具有較強的遷移能力,可快速集聚于受傷部位,并能夠分化為真皮成纖維細胞、內皮細胞和角質形成細胞等,因此在創傷修復、組織工程、皮膚及器官移植等研究領域具有較廣泛的應用潛力[12-13]。但ADSC保存及運輸較困難,移植異體ADSC易誘發較強的排斥反應、并存在潛在致瘤風險、倫理學等問題,其在燒、創傷患者救治中的臨床應用受限[1,12]。胞吐是細胞執行生物學功能的重要途徑,外泌體是細胞胞吐后的重要成分[14-15],且外泌體在無活體細胞的情況下仍可發揮與母細胞相似的生理功能[5-6]。因此,ADSC-Exos無免疫原性,與母細胞功能高度同源且特異性較強,在內環境中較穩定,并易于量化、保存方便,可彌補ADSC臨床應用的缺陷[16-17]。本研究利用高速離心法分離出直徑30～150nm細胞外泌體,分別通過電鏡觀察、Western blot、納米顆粒跟蹤分析儀證實其為ADSC-Exos,證明實驗獲取的外泌體具有一定的穩定性和可靠性。

蛋白組學研究可為ADSC-Exos在燒、創傷中實現創面愈合、瘢痕過度增生及其它分子機制提供重要參考。本研究對不同來源外泌體行蛋白質組學分析,篩選出表達差異蛋白184個,分析其功能主要集中在參與創面修復、減輕瘢痕過度增生、抗炎及機體免疫作用等方面。MAPK3與MAPK1可調節磷酸化下游靶點蛋白,是重要的細胞分化、增殖誘導信號分子[18-19];HSP90AA1可激活相關信號通路抑制皮膚細胞凋亡[20-22],可能與促進局部創面修復密切相關。細胞凋亡調節因子BAX為促凋亡基因激活物,BNIP2為抗凋亡基因激活物,兩者通過級聯反應致調節細胞凋亡[23-24],可能與創面修復和減輕創面過度增生相關。PRKCB表達與炎癥、感染及細胞自噬相互聯系[25-26],KLKB1與KNG1下調可減少血管擴張[27]。另外,補體家族蛋白與機體感染免疫均有一定聯系,以上蛋白下調可有效減少機體局部炎癥反應,改善局部微環境,在抗炎及調節機體免疫反應中發揮重要作用[28]。

外泌體蛋白組學研究近年來逐漸成為生命科學和臨床醫學的熱點領域。本研究通過對不同來源 ADSC-Exos 的蛋白組學進行差異分析,初步篩選了表達水平差異蛋白,發現差異蛋白不僅參與創面修復及減輕瘢痕過度增生等作用,在抗炎、免疫、抗感染方面也有積極作用,為靶向治療藥物研發提供了有效的理論依據,但具體分子機制還需要進一步實驗來闡明。