Ywhab通過靶向Hsp90aa1抑制小鼠B細胞淋巴瘤38B9細胞生長*

魏子辰， 張 毅▲， 許 晗▲， 王 鑫， 谷 婷， 龐 磊， 趙明超， 郁多男△

（1揚州大學醫學院/江蘇省非編碼RNA基礎與臨床轉化重點實驗室，江蘇 揚州 225009；2揚州大學附屬醫院消化內科，江蘇 揚州 225003）

彌漫性大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lym‐phoma， DLBCL）屬于成熟B 細胞腫瘤［1］，是淋巴瘤最常見的亞型［2-3］。DLBCL 可根據基因表達模式分為生發中心B 細胞（germinal center B-cell， GCB）和活化B 細胞（activated B-cell， ABC）兩種亞型［2］。盡管目前已有很多研究［4-5］，但其具體發病機制還不清楚。

人Ywhab（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein beta）基因位于20號染色體上（20q13.12），其編碼蛋白14-3-3β 是14-3-3 家族的重要成員。研究表明，Ywhab 在膠質瘤、乳腺癌和結直腸癌中高表達且與患者預后呈負相關［6-7］。然而，目前Ywhab 在淋巴瘤尤其是DLBCL 中的作用尚未有研究報道。本文就Ywhab 在小鼠B 細胞淋巴瘤38B9細胞中的作用及其機制進行研究。

材料和方法

1 動物及細胞

SPF 級雄性BALB/c 小鼠，8～12 周齡，購自揚州大學比較醫學中心。小鼠B細胞淋巴瘤細胞株38B9受贈于美國賓夕法尼亞大學費城兒童醫院。

2 主要試劑和儀器

逆轉錄試劑盒（11110ES92）和實時熒光定量PCR 試劑盒（11199ES03）均購自上海翌圣生物科技有限公司；高糖DMEM 培養液（SH30243.01）、RPMI-1640培養液（SH30809.01）和胎牛血清（SH30084.03）均購自HyClone；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（P0027）購自上海碧云天生物公司；Trizol（15596018）購自Invitrogen；PCR 引物由安徽通用生物公司合成，序列見表1；14-3-3 alpha/beta Rabbit pAb（A1023）購自武漢愛博泰克生物科技公司；Hsp90α/β 抗體（F-8 sc-13119）購自Santa Cruz；山羊抗小鼠Ⅱ抗（G1214）和山羊抗兔Ⅱ抗（G1213）購自武漢賽維爾生物科技公司；CD19 磁珠（Cat#130-121-301）和LS Columns（Cat#130-042-401）購自Miltenyi；其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

實時熒光定量PCR儀購自ABI；細胞甩片機（Cy‐tospin 4）購自Thermo Fisher；熒光顯微鏡（Axioscope 5）購自Zeiss；通用型免疫熒光工具箱（KTD107-CN）購自Abbkine；免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）試劑盒（Lot#D1215X01）購自Absin。

3 主要方法

3.1 數據資料收集 使用GEO 數據庫（www.ncbi.nlm. nih. gov/geo）下載包含DLBCL 患者基因數據的GSE32918 和包含扁桃體樣本及DLBCL 患者基因數據的GSE56315。數據集選取條件：（1）所選數據集包含全基因組的表達mRNA 芯片數據；（2）所選數據超過3個樣本以上；（3）所選樣本均為石蠟組織切片。

3.2 細胞培養 38B9 細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，隔天換液。人293T 細胞接種于10%胎牛血清的DMEM培養液中培養，隔2～3天換液。

3.3 細胞磁珠分選 取C57BL/6J小鼠骨髓、腸系膜淋巴結和脾臟，制備細胞懸液，在冰上裂解紅細胞，然后使用小鼠CD19+磁珠純化提取小鼠B細胞。

3.4 核蛋白與胞漿蛋白分離 取2×106個38B9 細胞，PBS 清洗干凈后，4 ℃、2 000 r/min 離心10 min。使用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒向細胞沉淀加入胞漿蛋白抽提試劑A、B。4 ℃、12 000×g離心5 min，取上清至新EP 管中，即為抽提得到的胞漿蛋白。隨后加入細胞核蛋白抽提試劑，4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清至新EP 管中。取分離后的蛋白，采用Western blot 檢測14-3-3β 在胞核和胞漿中的表達情況。

3.5 細胞免疫熒光染色 取5×104個38B9 細胞，用4%多聚甲醛固定15 min 后，4 ℃、2 000 r/min 離心10 min，PBS 重懸后取100 μL 用于細胞甩片。使用通用型免疫熒光試劑盒，先后加入破膜液、封閉液，PBS洗3次，隨后加入14-3-3β 抗體，于濕盒內4 ℃孵育過夜，PBS 洗4 次。吸棄PBS，加入Ⅱ抗，避光室溫孵育1 h。吸棄Ⅱ抗，PBS 洗3次。吸棄PBS，加入DAPI避光孵育10 min，PBS 洗3 次。玻片晾干后封片，使用熒光顯微鏡觀察14-3-3β的表達和分布。

3.6 質粒構建 通過PCR 擴增目的基因Ywhab片段，限制性內切酶切割pBABE-Puro 載體和目的基因片段，使用瓊脂糖凝膠電泳分離后回收。運用T4 連接酶將載體和目的基因片段鏈接，質粒轉化后在含氨芐青霉素的LB 培養基上培養，以獲得陽性菌落。經過測序驗證正確后，對這些陽性菌落進行質粒抽提并進行逆轉錄病毒包裝。

3.7 細胞轉染與感染 （1）收集對數生長期的293T細胞并接種到10 cm 培養皿中。當細胞融合達到80%～90%時，通過Lipo6000轉染試劑將pBABE-Puro和pBABE-Ywhab 質粒轉染至細胞中，轉染后36、48和60 h 收集培養液。（2）將對數生長期的38B9 細胞，取2×105個接種于6孔板，每孔加入2 mL 逆轉錄病毒液和2 μL polybrene，30 ℃、2 000 r/min 離心2 h感染，后續補充2 mL 完全培養液，24 h 后換液。細胞生長狀態良好后加入1 mg/L嘌呤霉素進行篩選。

3.8 CCK-8 實驗檢測細胞活力 取對數生長期的38B9 細胞，以每孔2×104的密度接種于96 孔板，每組包含5個復孔，分別在第24、48和72 h進行檢測。檢測方法：每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，37 ℃孵育1 h，使用酶標儀檢測450 nm 波長下各孔吸光度（A）。細胞相對活力（%）=A實驗組/A對照組×100%。

3.9 RT-qPCR 檢測Ywhab 及凋亡相關基因的mRNA 表達水平 使用Trizol 試劑提取細胞總RNA，細胞加入Trizol 后，冰上靜置15 min，加入200 μL 氯仿并充分混勻，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。取最上層至新的無酶EP 管中，加入等體積異丙醇后混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液。使用DEPC 水配制75%乙醇清洗后以4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液并干燥10 min。用適量ddH2O溶解RNA 并檢測濃度及純度后，使用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，合成cDNA。使用合成cDNA 樣品配制RT-qPCR 反應體系。以GAPDH 作為內參照，用2?ΔΔCt法計算mRNA相對表達量，每個樣本重復3次。

3.10 Western blot 檢測14-3-3β 及凋亡相關蛋白的表達水平 取對數生長期的38B9 細胞及磁珠分選的B 細胞，離心收集細胞。用蛋白裂解液裂解細胞，渦旋儀裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清液至新的EP 管中。加入5× SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，95 ℃金屬浴加熱5 min。進行10% SDSPAGE，80 V 恒壓電泳120 min。切膠放入預冷的轉膜液中，200 mA 冰上轉至PVDF 膜90 min。結束后將PVDF 膜轉入含5%脫脂奶粉的1× TBST 中封閉90 min。孵Ⅰ抗4 ℃搖床過夜。回收Ⅰ抗，加入1×TBST 洗膜3 次。加入對應種屬Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育60 min，加入1× TBST 洗膜3 次。將發光液均勻滴加在PVDF膜上，放入機器顯影。

3.11 蛋白質Co-IP 和質譜檢測14-3-3β 的結合蛋白 根據抗體與蛋白的特異性親和作用，在38B9 細胞中通過14-3-3β 抗體特異性結合14-3-3β 蛋白，并且捕獲與14-3-3β 蛋白相互作用的其他蛋白或者生物大分子，使用Protein A/G 凝珠結合14-3-3β 抗體，從而捕獲以及富集目標蛋白，然后使用蛋白質譜方法分析14-3-3β可能結合的蛋白。

3.12 蛋白質分子對接 在PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org/）獲得蛋白結構，利用PyMOL軟件處理蛋白結構，然后將蛋白結構上傳，利用HDOCK 軟件（http：//hdock. phys. hust. edu. cn/）進行蛋白-蛋白對接，最后選擇對接最佳的組合，利用PyMOL 軟件作圖分析。

3.13 GEO 數據生物信息學分析 使用R 語言包Limma 消除批次效應以用于合并GSE32918 和GSE56315 測序數據，使用Survival 包進行單基因生存分析。利用Survminer 包將單基因納入多變量Cox分析中。為了評估模型的穩健性，將風險評分公式，其中X代表系數，Y代表基因表達水平］應用于每個樣本。隨后，根據風險評分的中位數將樣本分為高風險和低風險兩類。風險評分分布、患者生存狀態和基因表達熱圖被用于評估模型的準確性。此外，進行了單變量回歸分析，以確定模型的預測準確性。

4 統計學處理

所有的統計分析及作圖使用GraphPad Prism 8.0、Microsoft Excel 和Adobe Photoshop 軟件。結果以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 DLBCL 患者淋巴結與正常人淋巴結中Ywhab表達的比較

對GEO 數據集GSE32918 和GSE56315 進行分析，結果顯示，與正常人淋巴結石蠟組織樣本相比，DLBCL 患者淋巴結石蠟組織樣本中Ywhab 低表達（圖1A）。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，Ywhab低表達組患者生存率顯著低于高表達組（圖1B）。多因素COX 回歸模型表明，Ywhab 表達是DLBCL 患者生存的獨立危險因素（圖1C）；同時單因素風險回歸模型分析結果表明Ywhab表達是影響DLBCL患者生存的危險因素（圖1D）。根據以上數據進行風險評分，結果顯示高風險組較低風險組的死亡率高，生存時間短（P<0.05）（圖1E）。

Figure 1. Construction and validation of a risk model based on Ywhab gene associated with DLBCL prognostic features. A： expression of Ywhab in normal and DLBCL（ tumor） groups； B： Kaplan-Meier method and log-rank test were used to evaluate and com‐pare the survival rates of the patients with high and low Ywhab expression in the GSE32918 cohort； C： multivariate regres‐sion analysis was used to assess the association between risk scores and various clinical factors in the GSE32918 cohort； D：univariate regression analysis was used to assess the association between risk score and various clinical factors in the GSE32918 cohort； E： distribution of risk score， corresponding survival status， and expression level of Ywhab in the GSE32918 cohort.圖1 與DLBCL預后特征相關的Ywhab基因風險模型的構建和驗證

2 Ywhab在小鼠B細胞淋巴瘤38B9細胞中低表達

RT-qPCR 和Western blot 實驗結果顯示，Ywhab mRNA 及其蛋白14-3-3β 在小鼠B 細胞淋巴瘤38B9細胞中低表達，而在小鼠骨髓、淋巴結和脾臟正常B細胞中高表達，差異均有統計學意義（P<0.01），見圖2。

Figure 2. Low expression of Ywhab in mouse B-cell lymphoma 38B9 cells. A： the mRNA levels of Ywhab in 38B9 cells， and CD19+B cells from wild-type（ WT） mouse bone marrow（ BM）， lymph node（ LN） and spleen（ SP） were detected by RT-qPCR；B： the protein levels of 14-3-3β in 38B9 cells， and CD19+ B cells from WT mouse LN were detected by Western blot.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs 38B9 cells.圖2 Ywhab在小鼠B細胞淋巴瘤38B9細胞中低表達

3 14-3-3β蛋白在38B9細胞中的亞細胞定位

Western blot 實驗結果顯示，14-3-3β主要在38B9細胞的細胞漿中表達（圖3A）；免疫熒光染色結果與Western blot結果一致（圖3B）。

Figure 3. The 14-3-3β protein was predominantly located in the cytoplasm of 38B9 cells. A： Western blot； B： immunofluorescence staining（ green， 14-3-3β； blue， DAPI； scale bar=50 μm）.圖3 14-3-3β主要在38B9細胞的細胞漿中表達

4 Ywhab抑制38B9細胞的生長

RT-qPCR 和Western blot 實驗結果顯示，與pBABE-Puro 組相比，pBABE-Ywhab 組38B9 細胞中Ywhab 過表達6～10 倍（P<0.01），見圖4。細胞計數法和CCK-8 實驗結果顯示，與pBABE-Puro 組相比，pBABE-Ywhab 組38B9 細胞活力 在48 和72 h 受 到顯著抑制，見圖5A、B。同時，小鼠體內荷瘤實驗結果顯示，Ywhab過表達可以顯著抑制38B9 細胞在小鼠體內的生長（P<0.05），見圖5C、D。

Figure 4. Establishment of Ywhab-overexpressing 38B9 cell line. A： the mRNA level of Ywhab was detected by RT-qPCR； B： the protein level of 14-3-3β was detected by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs pBABE-Puro group.圖4 過表達Ywhab的38B9細胞系的構建

Figure 5. Overexpression of Ywhab suppressed the growth of 38B9 cells. A： cell counting； B： cell viability detected by CCK-8 as‐say； C： photograph of subcutaneous tumors from mice； D： weight of subcutaneous tumors from mice. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs pBABE-Puro group.圖5 Ywhab過表達抑制38B9細胞生長

5 Ywhab促進38B9細胞凋亡

RT-qPCR 實驗結果顯示，與pBABE-Puro 組相比，pBABE-Ywhab 組38B9 細胞中促凋亡蛋白Puma、Bax、Noxa、Casp6 和Casp7 的mRNA 水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），而抑凋亡蛋白Bcl2的mRNA 水平顯著降低（P<0.05），見圖6A；Western blot 實驗結果顯示，與pBABE-Puro 組相比，pBABE-Ywhab 組38B9 細胞中Puma 和Noxa 蛋白水平顯著升高（P<0.01），Bcl2蛋白水平顯著降低（P<0.05），見圖6B。

Figure 6. Overexpression of Ywhab promoted the apoptosis of 38B9 cells. A： the mRNA levels of apoptosis-related proteins were de‐tected by RT-qPCR； B： the protein levels of Puma， Noxa and Bcl2 were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs pBABE-Puro group.圖6 Ywhab過表達促進38B9細胞凋亡

6 14-3-3β 與Hsp90aa1 蛋白相互作用并抑制Hsp90aa1表達

Co-IP 結合質譜分析結果顯示，14-3-3β 能夠與Hsp90aa1 結合，見圖7A、B。對質譜結果進行GO 富集分析發現，前5 條通路中有3 條通路與Hsp90aa1相關，見圖7C。對Co-IP 結果進行了Western blot 驗證并結合分子對接，顯示14-3-3β 與Hsp90aa1 存在結合關系，見圖7D、E。Western blot 結果顯示，在38B9 細胞中過表達Ywhab顯著抑制Hsp90aa1 的蛋白表達（P<0.05），見圖7F。

Figure 7. 14-3-3β bound to Hsp90aa1 and reduced Hsp90aa1 protein level. A： Coomassie brilliant blue staining of proteins； B：mass spectrometry（MS） results； C： GO enrichment analysis of MS results； D： co-immunoprecipitation（ Co-IP） verifica‐tion； E： molecular docking results； F： the expression of Hsp90aa1 protein in Ywhab-overexpressing 38B9 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pBABE-Puro group.圖7 14-3-3β結合Hsp90aa1并抑制其表達

討 論

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma， NHL）是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，并且發病率和死亡率都位列前十［8］。DLBCL 約占全球成人NHL的30%～40%［9-10］。盡管化療藥物、單抗和細胞毒藥物單用或聯用治療顯著改善了DLBCL 患者的結局［11-12］，然而近40%的患者仍然會出現復發［13-14］。因此，探討DLBCL 新的生物標志物和潛在治療靶點對于改善目前治療的結果至關重要。

14-3-3 蛋白是一個普遍存在的高度保守的28～33 kD 酸性多肽分子家族，由Moore 和Perez 于1967年發現［15］，包含7 個家族成員（β、γ、ε、σ、ζ、τ 和η）［16］。14-3-3 參與所有真核細胞內的蛋白激酶信號通路和磷酸化依賴性蛋白-蛋白相互作用［17-19］，通過細胞周期調節多種細胞功能，包括DNA 損傷檢查點的啟動和維持、絲裂原活化蛋白激酶的活化、預防細胞凋亡、增殖和惡性轉化。很多研究表明，14-3-3β的表達增加與胃癌、胰腺癌、肺癌等癌癥發生發展相關［20-22］。然而，在血液系統腫瘤尤其是DLBCL 中的報道幾乎沒有。因此，本研究通過體內外實驗探究14-3-3β 對小鼠B 細胞淋巴瘤的可能作用機制，為臨床診斷和治療淋巴瘤提供理論與實驗基礎。

本研究使用公共數據庫研究顯示，Ywhab 在人正常淋巴結組織中高表達。基于GSE32918 數據集，使用生物信息學方法構建單因素回歸模型和多因素回歸模型，提示Ywhab 作為風險保護因素發揮作用并與預后密切相關。為了進一步研究Ywhab 對小鼠B細胞淋巴瘤發生發展的作用及可能的機制，我們構建了過表達Ywhab的38B9 細胞系。本研究使用的38B9 細胞系是由癌基因v-Abl（Abl1）轉化的小鼠前體B細胞［23］，但表達高水平MYC蛋白［24］，這一細胞系模型可以模擬人DLBCL 中MYC 高表達的特性［25］。實驗結果表明，Ywhab過表達能夠抑制38B9 細胞活力；RT-qPCR 和Western blot 實驗結果表明，Ywhab過表達能夠促進38B9 細胞凋亡。這說明Ywhab 對于小鼠B細胞淋巴瘤的發生和發展起到抑制作用。

Hsp90aa1 屬于熱休克蛋白家族成員，在很多腫瘤如頭頸部鱗狀細胞癌［26］、下咽鱗狀細胞癌［27］和乳腺癌［28］中表達增加，被認為是多種癌癥發展的促進劑［29］。研究表明，Hsp90aa1 通過JNK/P38 通路抑制細胞凋亡，促進腫瘤的發生［30］。此外，Hsp90aa1通常作為分子伴侶發揮作用［31］。本研究通過Co-IP、質譜結合生物信息學分析表明，14-3-3β 能夠與Hsp90aa1結合；Western blot 實驗結果表明，過表達Ywhab的38B9 細胞系中Hsp90aa1 蛋白表達水平顯著降低，從而促進凋亡相關蛋白如Puma、Noxa 等的表達，并且抑制抗凋亡蛋白Bcl2表達。

綜上所述，Ywhab 可以誘導小鼠B 細胞淋巴瘤38B9 細胞凋亡并發揮抗癌作用，其機制可能是通過與Hsp90aa1 結合抑制其表達，并促進凋亡途徑。但Ywhab是否通過其他的作用機制抑制B細胞淋巴瘤，以及在其他腫瘤中是否也發揮抑癌作用仍需加強相關研究。本研究為DLBCL 的診斷和治療提供更多的理論和實驗依據。