谷氨酰胺轉氨酶對板栗粉面團理化特性的影響

李 濤，周 立，徐園杰，袁松凱，曹艷廣，郝建雄，劉俊果,*

（1.河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050000；2.石家莊市丸京干果有限公司，河北 石家莊 051230）

板栗，屬于殼斗科，是我國受歡迎的季節性堅果，在河北、山東等地廣泛種植。板栗品質優良，含有淀粉、蛋白質、胡蘿卜素、硫胺素、核黃素、抗壞血酸等豐富的營養物質[1]，其營養價值高，口感甘甜，具有巨大的經濟效益，被譽為“木本谷物”[2]。乳糜瀉（coeliac disease，CD）又稱麩質過敏癥，是指食用含有麩質蛋白（谷蛋白）的食物而引發的自身免疫性疾病，它可引起小腸黏膜結構改變，導致營養吸收受損、腹瀉和體質量減輕[3]。到目前為止，對CD患者的治療方法是嚴格遵循無麩質飲食[4]，一般可以安全食用谷蛋白含量低于20 mg/kg的食品[5]。世界范圍內大約有5%～10%的人口需要終生食用無麩質食品[6]。但是無麩質食物由于缺乏面筋網絡結構而存在品質和加工性能較差的問題。板栗作為一種無麩質且含有膳食纖維的食品，無法形成類似于小麥面團中的面筋網絡結構，從而導致其加工性能差。因此，為開發優質的板栗食品，有必要對板栗面團進行品質改良。

谷氨酰胺轉氨酶（glutamine transaminase，TG）是一種能催化蛋白質分子內和分子間發生共價交聯反應的酶[7]，負責與肽（酰基供體）結合的谷氨酰胺殘基γ-羧酰胺基和各種伯胺（酰基受體）之間酰基（或酰基部分）的轉移，包括蛋白質中賴氨酸殘基的ε-氨基[8]，從而改善蛋白質的結構和功能，改善食品的質構。TG在面團中可以促進谷氨酰胺和賴氨酸殘基的分子間或分子內交聯，形成高分子質量的面筋[9]。陳圓圓等[10]將TG用于改善黑小麥面團的理化特性，發現TG添加量為1.1%時改善效果最佳，添加量過多會導致蛋白質過度交聯，淀粉顆粒暴露，面團強度和穩定性下降。Huang Weining等[11]研究TG對燕麥面團流變學和熱機械特性的影響，結果表明TG對燕麥面團的吸水率、黏彈性和熱穩定性有明顯的影響，TG處理后游離氨基的數量減少，證實了TG催化蛋白質交聯的作用。尹賀偉等[12]研究了TG對青稞面團質構特性和流變特性的影響，結果表明TG的添加可以增加青稞面團的硬度、彈性等質構特性，提供青稞面團延伸所需要的黏結力，使青稞面團內部結構較為穩定，同時，TG的添加使青稞面團抵抗外界形變的能力變強，恢復力變好，青稞粉凝膠的強度降低。而TG對板栗的作用鮮見報道。

因此本實驗著重探討TG對板栗粉面團物理特性包括糊化特性、質構特性、流變學特性的影響，并從化學性質游離巰基含量的變化以及微觀結構的角度給予解釋，旨在為開發板栗食品、提高其食用品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗仁：遷西板栗 市售。

1.2 儀器與設備

HAAKE Mars 40型高級旋轉流變儀 賽默飛世爾科技有限公司；TA.XT plus型質構儀 廈門超技儀器設備有限公司；RVA-Tec Master型快速黏度分析儀 瑞典波通儀器公司；FD-1A-50型真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；QL-901型渦旋混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；752型紫外-可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；H-1650型離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；S-4800型高分辨率掃描電鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 板栗面團的制備

參考Gharst等[13]的方法并稍作修改。將板栗仁切片粗粉碎后進行冷凍干燥，干燥完全后取出充分研磨粉碎制得板栗粉。取3 g板栗粉中分別添加0、0.9、1.8、2.7、3.6 U/g（按板栗全粉質量計）TG，渦旋混勻制備成混合粉。緩慢加入板栗粉70%的40 ℃溫水，攪拌和面5 min，取出面團用保鮮膜包裹靜置60 min，待測。

1.3.2 板栗面團質構特性的測定

取靜置好的板栗面團搓成圓球狀，上質構儀對面團進行測試，每組樣品測試3 個面團。測定參數：探頭P/5，測前、測中、測后速率分別為2.0、1.0 mm/s和1.0 mm/s，壓縮形變比例為30%，觸發力為3 g，2 次壓縮時間間隔5.0 s，測定其硬度、彈性、咀嚼性和回復性等質構特性并進行評價。

1.3.3 板栗面團動態流變特性的測定

一是創立 “政產學研用媒”人才培養模式。特別是各高校、培訓單位等應根據旅游電子商務專業特性，采用“政產學研用媒”融合互動模式，開設特色課程，建立實訓教學體系，實施進階式的應用型人才培養模式改革。二是實踐培訓和理論教育兩手抓。扶貧先扶志，更要扶智。各高校、各級培訓機構應借助自身師資力量與實踐資源優勢，對鄉村旅游電商實踐培訓和理論教育兩手抓，構建“專家指導云”和“兼職教師信息庫”，逐步形成基礎知識培訓任務由鄉村兼職教師承擔、專業知識講座由高校教師講授的格局。根據不同鄉村產業、旅游電子商務發展的特點和要求，創新鄉村旅游電商人才本地培養和委托培養的途徑。

參考Han Hu等[14]的方法并稍作修改。取3 g靜置好的板栗面團搓圓后放到流變儀測試圓盤中間進行測定。測試探頭選取P 35/Ti，板間距設置為2 mm，刮掉多余樣品，在夾具邊緣涂少許甘油以防止面團邊緣的水分揮發。測試程序設置如下：頻率變化范圍為0.1～10.0 Hz，溫度為25 ℃，應變為0.1%。最終根據所測數據繪出板栗面團的儲能模量G′、損耗模量G″及損耗因子tanδ隨頻率變化的曲線圖。

1.3.4 板栗面團蠕變-恢復特性測定

樣品制備同1.3.1節。測試探頭選取P 35/Ti，板間距為2 mm，刮掉多余樣品，在夾具邊緣涂少許甘油以防止面團邊緣的水分揮發。測定程序設置恒定應力50 Pa，掃描時間150 s，之后移除應力觀察樣品在300 s內的應力恢復情況。

1.3.5 混合粉糊化特性的測定

參考GB/T 24853—2010《小麥、黑麥及其粉類和淀粉糊化特性測定 快速粘度儀法》，每份樣品精確稱取3 g至干燥潔凈樣品筒，精確加入25 mL去離子水，用塑料攪拌槳快速攪拌分散，將樣品筒放入快速黏度分析儀中檢測其成糊特性。

1.3.6 游離巰基的測定

參考Yang Yuling[15]和Beveridge[16]等的方法并稍作修改測游離巰基的含量。將按1.3.1節制備好的面團真空冷凍干燥36 h，研磨粉碎后取100 mg的凍干樣品粉末，加入10 mL的緩沖液（10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、8 mol/L尿素、5 mol/L鹽酸胍、1.5 g/100 mL EDTA），調節pH值至8.0，充分混合60 min，將200 μL 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)試劑（0.1 g/100 mL）與5 mL樣品溶液混合30 min，以5000 r/min離心10 min，使用紫外分光光度儀在412 nm處測定上清液的吸光度，以不加5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)的試劑為空白對照，按下式計算游離巰基含量：

式中：73.53為5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)試劑在pH 8.0時的摩爾消光系數/（L/（mol·cm））；A412nm為412 nm處的吸光度；D為稀釋因子，為5.02；ρ為樣品質量濃度/（mg/mL）。

1.3.7 掃描電子顯微鏡觀察

將按1.3.1節制備好的面團先放冰箱凍12 h，取出后真空冷凍干燥24 h，將凍干面團掰成小塊，斷面向上用導電膠固定在操作臺上，真空鍍金處理后置于掃描電鏡觀察艙內，觀察樣品斷面的表面結構。

1.4 數據統計與分析

實驗數據用Excel進行統計整理，用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 TG對板栗面團質構特性的影響

硬度、彈性、黏聚性、咀嚼性和回復性可以直觀體現板栗面團的質構特性。其中硬度是最直觀的指標，彈性可以反映面團壓縮后復原的程度及強弱，黏聚性可以反映面團分子間結合力的大小[17]，咀嚼性跟咀嚼時間和咀嚼次數相關，回復性可以反映面團形變后恢復的能力[18]。

如表1所示，隨著TG添加量的增加，板栗面團的硬度不斷增加，彈性、黏聚性、咀嚼性和回復性都呈現先升高后降低的趨勢。當TG添加量達到2.7 U/g時，板栗面團的彈性、黏聚性、咀嚼性和回復性都達到最大，可能是由于TG的加入使得板栗面團的淀粉面筋結構變的緊密，面團結構穩定后彈性相對增強，從而其咀嚼性和回復性都有顯著增加。當TG添加量達到3.6 U/g時，其彈性、黏聚性、咀嚼性和回復性都有降低的趨勢，可能由于面筋網絡過度緊密，板栗面團內部的淀粉和纖維暴露導致結構不連續或不均勻。

表1 TG添加量對板栗面團質構特性的影響Table 1 Effect of TG addition on the texture characteristics of chestnut dough

2.2 TG對板栗面團流變特性的影響

由圖1a和1b可知，不同TG添加量的板栗面團G′和G″均隨掃描頻率的增加而增大，即所有樣品的G′和G″均表現出頻率依賴性。隨頻率的增加，所有面團樣品的G′始終高于G″，表明面團具有固體類彈性性質[19]。隨TG添加量的增大，G′和G″均呈先升后降的趨勢，在TG添加量為2.7 U/g時板栗粉面團具有最高的G′和G″，這表明TG可明顯提高板栗粉面團黏彈性，可能是因為TG促進板栗粉面團中蛋白質分子交聯聚集，增強面團強度，改善面筋網絡結構，在一定程度上減小了板栗面團中纖維對蛋白質交聯的干擾作用，但當TG添加過量時會導致蛋白質過度交聯聚集，部分淀粉顆粒被迫暴露，不利于面筋網絡結構的穩定性和緊密性，黏彈性會有所下降。

圖1 不同TG添加量的板栗面團頻率掃描曲線Fig.1 Effect of TG addition on the rheological properties of chestnut dough

tanδ越大表明材料的黏性越大，tanδ越小表明樣品彈性越大，且可以反映面團整體彈性和強度的增加[20]。由圖1c可知，所有面團樣品均tanδ＜1，表明板栗面團表現出半固體偏彈性的性質。且隨頻率的增加，所有面團樣品的tanδ均先減小后趨于穩定，可能是在達到一定頻率后，面團中的蛋白交聯聚集形成緊密的面筋結構，逐漸減小纖維對面團強度的影響，從而使其黏彈性趨于穩定。與TG添加量0 U/g相比，添加量為2.7 U/g時tanδ值達到最小，說明此添加量下面團的彈性性質最優。因此選擇合適的TG的添加量可以增強板栗面團的穩定性。

2.3 TG對板栗面團蠕變-恢復特性的影響

面團作為一種具有黏彈性的復雜軟固體，在壓力恒定的條件下，內部的分子鏈發生鏈斷而產生一定的形變量發生蠕變，隨著恒定壓力的撤除，面團會發生瞬時彈性恢復及延遲彈性恢復。因此可通過動態流變儀的蠕變-恢復模式對其抗形變能力進行表征，同時也可被用來表征面團和面筋的黏彈性[21]。從圖2可以看出，在蠕變階段（0～150 s），面團的剪切應變都在不斷升高，在撤除剪切應力后面團的剪切應變值急劇下降后漸漸趨于穩定。與未添加TG的面團相比，TG的添加明顯降低了板栗面團的形變。其中未添加TG的板栗面團形變最大，而添加量為2.7 U/g時的面團形變最小。該結果表明TG添加量為2.7 U/g時板栗面團的抗形變能力最強。在恢復階段，TG添加量在2.7 U/g時板栗面團松弛形變后最接近初始狀態，表明此添加量下板栗面團具有最好的蠕變恢復能力，同時也表明此添加量下板栗面團內部的蛋白質分子交聯更加緊密。上述結果與頻率掃描結果相一致，即TG添加量在2.7 U/g左右時可以很好地改善板栗面團的內部結構。

圖2 不同TG添加量下板栗面團的蠕變-恢復特性曲線Fig.2 Effect of TG addition on the creep-recovery curve of chestnut dough

2.4 TG對板栗粉糊化特性的影響

淀粉糊化是指淀粉與水形成的懸浮液在加熱的過程中，淀粉的結晶區域膠束中的氫鍵不斷被破壞，膠束結構逐漸松散，縫隙逐漸擴大，水分子不斷浸入，導致淀粉顆粒發生不可逆的膨脹，最終淀粉懸浮液變成高黏度的糊漿形態[22]。

如表2所示，板栗和TG混合粉的峰值黏度、最低黏度和最終黏度隨著TG添加量的增加而增加。黏度的增加可能是因為TG的添加促進了蛋白質交聯緊密，導致面筋網絡結構外易糊化的淀粉量增加[23]。衰減值可以作為淀粉顆粒在糊化過程中穩定性和損傷程度的指標，其值越低表明淀粉顆粒耐剪切性越強[24]。表2中衰減值隨著TG添加量的增加先降低后增加，表明適量TG的加入可以保護淀粉顆粒的完整性，但過量的TG會限制水向淀粉顆粒的擴散，溫度升高導致淀粉顆粒崩解，抗剪切力會隨之減弱。表2中峰值時間和糊化溫度變化不明顯，但都比未添加TG時的大，可能是由于淀粉顆粒與蛋白質網絡結構連接緊密或被包埋其中，增加了淀粉結構的穩定性，淀粉糊化的速度減慢，從而達到峰值所需的時間略有增加[25]。

表2 TG添加量對板栗粉糊化特性的影響Table 2 Effect of TG addition on the gelatinization characteristics of chestnut powder

2.5 TG對板栗面團游離巰基含量的影響

巰基是蛋白質中最重要的功能性基團之一，同時也作為影響蛋白質三級結構的重要參數[26]。TG的活性位點由3 個氨基酸組成：半胱氨酸、天冬酰胺和組氨酸，酶活性位點中的這種催化三元體與多肽鏈中結合的谷氨酰胺相互作用形成酰基-酶復合物（也稱為酶-蛋白復合物）。酰基-酶復合物形成并釋放游離氨后，會發生轉酰胺化反應，通過與賴氨酸的ε-氨基結合形成共價異肽鍵，從而使多肽鏈中谷氨酰胺和賴氨酸殘基之間發生交聯[27]。半胱氨酸中含有巰基，在發生交聯反應之后，巰基之間的距離變近，易被氧化形成二硫鍵，二硫鍵使蛋白質結構更加穩固[28]。因此巰基含量的變化可以說明TG是否發生催化反應。由圖3可知，隨著TG添加量的增加，板栗面團中游離巰基的含量明顯下降，表明TG的加入使板栗面團中的蛋白質發生交聯聚集，進而使得游離在表面的巰基被包埋在蛋白質分子內部；另一方面表明，在TG的作用下，小分子蛋白交聯，形成了具有緊密網絡空間的大分子蛋白聚集體，水分子進入此網絡空間與肽鏈發生結合，使得肽鏈間的巰基發生裂解后轉化為二硫鍵，從而導致巰基含量減少[29]。Ahn等[30]在TG改性小麥、大麥和大豆面粉及其混合物的研究中指出，TG處理后的樣品巰基數量明顯減少，推測是因為在TG作用過程中，含硫氨基酸相互接近氧化形成了二硫鍵。

圖3 不同TG添加量對板栗面團游離巰基含量的影響Fig.3 Effect of TG addition on the content of free sulfhydryl groups in chestnut dough

2.6 TG對板栗面團微觀結構的影響

如圖4a所示，未添加TG的板栗面團有大量空洞且整體結構疏松，很少有成片的面筋膜，這是由于板栗粉存在較多纖維，導致面筋網絡結構無法形成，淀粉顆粒暴露。如圖4b所示，TG添加量在2.7 U/g條件下板栗面團的微觀結構顯示有成片的面筋膜且空洞較少，結構連續緊密且均勻，表明TG的添加使板栗面團中的蛋白質交聯聚集，纖維和淀粉顆粒與大分子蛋白質連接緊密或被面筋網絡包裹其中，面團穩定性增強。圖4c是TG添加量為3.6 U/g時的板栗面團微觀結構，此添加量下空洞相比于2.7 U/g時的多一點，可能原因是TG添加過多導致蛋白質過度交聯聚集，淀粉顆粒被迫外露，面團整體穩定性下降，加工性能變差。此結果與上述流變分析結果一致。王佳玉等[31]在研究不同TG添加量對全麥面團的微觀結構的影響時也得出相似的結論。綜上來看，當TG添加量在2.7 U/g附近時，板栗面團的微觀結構較為緊密均勻。

圖4 TG對板栗面團微觀結構的影響（×1000）Fig.4 Effect of TG on the microstructure of chestnut dough (×1000)

3 結論

本研究發現，TG的添加可以促進板栗面團蛋白質發生交聯，有利于改善板栗面團的內部結構。適量添加TG可以增加板栗面團的黏度、硬度、彈性等特性，同時增大了面團的彈性模量和黏性模量，增強了抗外界形變能力。在化學性質方面，TG的添加降低了板栗面團游離巰基的含量，側面說明TG可以促進蛋白質的交聯，使面筋網絡結構更加完整，但TG添加量過多會導致蛋白過度交聯，面團的綜合黏彈性下降，穩定性也下降。因此，合理控制適量TG的添加量對提高板栗面團結構穩定及加工性能至關重要。在本研究中，TG添加量為2.7 U/g時對板栗面團的理化性質和內部結構改善效果最明顯。本研究可為開發板栗粉食品提供一定的理論依據，同時也期望為無麩質食品的開發、加工及改良提供一定的參考。