基于非靶向代謝組學的信陽毛尖茶加工過程非揮發物代謝輪廓分析

孔亞帥，陳凌芝，成 恩，朱 堯，王晶晶，王 曉，王子浩，陳 義，尹 鵬,*，郭桂義,,*

（1.信陽農林學院茶學院，河南省豫南茶樹資源綜合開發重點實驗室，河南 信陽 464000；2.信陽市文新茶葉有限責任公司，河南 信陽 464000）

綠茶是我國六大茶類之一，因其滋味鮮爽和香氣濃郁而廣受消費者的喜愛。綠茶中含有豐富的茶多酚、咖啡堿、茶氨酸、黃酮、茶多糖等天然成分，這些成分不僅構成茶葉豐富的滋味口感，還具有抗癌、抗氧化、保護神經系統、降低血壓等藥理活性[1-2]。綠茶的基本工藝主要包括殺青、揉捻和干燥。根據綠茶加工工藝，可以把綠茶分為炒青綠茶、烘青綠茶、曬青綠茶和蒸青綠茶[3]。茶樹鮮葉原料的優劣是決定綠茶品質的基礎，茶樹品種、生產季節、氣候條件、生長環境、原料等級都會影響制茶鮮葉原料內含物質的構成，從而間接影響所制綠茶的風味和功效[4-6]；加工技術是決定茶葉品質的關鍵，Gui Anhui等[7]基于代謝組學分析了蒸青綠茶加工過程中非揮發性代謝物的變化，發現非揮發性代謝物的變化主要發生在蒸汽殺青階段，其次是做形和干燥階段；蒸汽殺青導致大部分氨基酸及其肽、酚酸、有機酸、核苷酸及其衍生物以及一些黃酮類化合物的水平顯著增加，而大多數脂質和一些黃酮類化合物的水平顯著降低。Li Jia等[8]通過非靶向脂質組學研究綠茶脂質及其代謝的變化，發現殺青階段脂質發生了顯著的變化，這主要與葉綠素分解、磷脂酸還原和糖脂降解有關，此反應可能有助于綠茶色澤和香氣的形成。在綠茶的加工過程中，兒茶素、游離氨基酸、黃酮苷、糖、生物堿和脂質等化合物會發生水解、異構、氧化等一系列生化反應，有利于綠茶滋味品質形成[9-11]。

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后的一種新興科學技術，一般來說，研究的對象是相對分子質量在1000以下的小分子化合物，研究手段涵蓋了核磁共振技術、氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用技術和液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯用技術。對于非揮發性代謝物分析，高效精準的LC-MS技術被廣泛應用，根據研究對象和目的不同，可以將代謝產物分析分為靶向代謝組學分析和非靶向代謝組學分析，非靶向代謝組學分析能夠全面反映所研究對象的整體代謝輪廓[12-13]。目前非靶向代謝組學被廣泛應用到茶葉的研究中，為全面深入地了解茶葉提供了有力幫助。Cui Jilai等[14]利用頂空固相微萃取法結合GC-MS技術對信陽毛尖茶加工過程樣品進行定性和定量分析，探究信陽毛尖茶加工過程中關鍵香氣物質基礎和變化規律，發現殺青工序是形成信陽毛尖茶香氣的最重要的過程。Yin Peng等[15]采用頂空固相微萃取法結合GC-MS技術對比春秋兩季信陽毛尖茶的主要非揮發性代謝物和關鍵氣味物質，發現春季信陽毛尖茶氨基酸含量顯著高于秋季，而咖啡堿含量則相反；信陽毛尖茶關鍵香氣成分也表現為春季含量顯著高于秋季。組學技術在信陽毛尖茶揮發性成分上應用較多，也可以應用于信陽毛尖茶的產地溯源、海拔以及不同加工工藝對信陽毛尖茶非揮發性代謝物化學輪廓的影響等方面[16-17]。

信陽毛尖茶具有“細圓緊直多白毫，香高味濃湯色綠”的品質特征，屬于名優炒青綠茶的代表產品，優越的地理位置、適宜生態環境以及優良的茶樹品種和獨特的加工技藝決定了其獨特的風味和功效[3,18-19]。本研究以信陽毛尖茶為對象，利用非靶向代謝組學技術結合多元統計分析對信陽毛尖茶加工過程中的非揮發性代謝物進行研究，以探明信陽毛尖茶加工過程中的關鍵代謝物，為進一步完善信陽毛尖茶品質形成機理及其調控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品選取信陽群體種為原料，以一芽一葉為采摘標準，于信陽市浉河區遇鑒有機茶葉專業合作社（113.9°E、31.9°N）加工完成。采摘日期為2021年4月8日，當天采摘的鮮葉當天制作完畢。如圖1所示，其加工工藝為鮮葉→攤放（室溫，4～6 h）→滾筒殺青（前200 ℃、后120 ℃，120 s）→揉捻（室溫，40 min）→排把（85 ℃，15 min）→理條（115 ℃，6 min）→干燥（80 ℃，18 min）。每個階段的加工樣品冷卻后立即用液氮保存，然后運送到實驗室進行冷凍干燥，鋁箔袋密封后置于-40 ℃低溫保存。

圖1 信陽毛尖茶加工流程與工藝參數Fig.1 Flow chart and process parameters of Xinyang Maojian tea processing

水（ddH2O）屈臣氏集團（香港）有限公司；甲醇和乙腈（質譜級）德國CNW公司；乙酸銨（質譜級）美國Sigma-Aldrich公司；乙酸（質譜級）美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設備

6CST-80D滾筒殺青機、6CR-45茶葉揉捻機、6CCGK-7D茶葉排把炒干機 信陽一鼎茶葉科技有限公司；6CL-80/16D茶葉理條機 衢州市華麟機械有限公司；CS-6CHZ-9長盛牌烘焙機 泉州長盛茶業機械有限公司；Vanquish超高液相色譜儀、Q Exactive HFX高分辨質譜儀、Heraeus Fresco17離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；BSA124S-CW電子分析天平德國Sartorius公司；JXFSTPRP-24研磨儀 上海凈信科技有限公司；PS-60AL超聲儀 深圳市雷德邦電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 代謝物提取

稱取20 mg茶葉樣品，加入1000 μL甲醇水提取液（3∶1，V/V，含同位素標記內標混合物），研磨儀35 Hz研磨處理4 min，超聲5 min（冰水浴），重復3 次；將在-40 ℃環境靜置1 h的樣品以4 ℃、12000 r/min轉速離心15 min；取上清于進樣瓶中上機檢測；所有樣品另取等量上清混合成質量控制樣品上機檢測。

1.3.2 LC-MS/MS分析

本研究使用Vanquish超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離。自動進樣器溫度為4 ℃；進樣量為3 μL；流動相A含5 mmol/L乙酸銨和5 mmol/L乙酸的水溶液；流動相B為乙腈。梯度洗脫程序：0～0.7 min，99% A、1% B；0.7～9.5 min，99%～1% A、1%～99% B；9.5～11.8 min，1% A、99% B；11.8～12.0 min，1%～99% A、99%～1% B；12.0～14.8 min，99% A、1% B。

Thermo Q Exactive HFX質譜儀在正離子模式下進行一級、二級質譜數據采集。詳細參數如下：鞘氣流速30 arb，輔助氣體流速10 arb，毛細管溫度350 ℃，全掃分辨率60000，二級質譜分辨率7500，碰撞能量10/30/60 eV，噴霧電壓4.0 kV。

1.4 數據處理與統計分析

原始數據經ProteoWizard軟件轉成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包（內核為XCMS）進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，然后與BiotreeDB（V 2.1）自建二級質譜數據庫匹配進行物質注釋，算法打分的Cutoff值設為0.3。

β-多樣性分析基于Bray-Curtis距離計算方法計算，利用主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）以及R語言vegan包的層級聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）進行可視化，同時使用PERMANOVA檢驗樣品間分組的可靠性（R2和P值，前者代表了該因素對分組的解釋程度，后者是對統計學意義的評估）。基于R語言ggplot2以及ggrepel包進行所鑒定全部化合物差異性分析，利用火山圖進行差異化合物展示。通過R語言ropls包做正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）進行樣本組間差異化合物的篩選，篩選出來的差異化合物使用R語言ComplexHeatmap包實現熱圖可視化，直觀地反映信陽毛尖茶加工過程中化合物相對含量的變化規律。

2 結果與分析

2.1 信陽毛尖茶加工過程中整體非揮發性代謝物輪廓分析

在正離子模式下共檢測并比對數據庫鑒定到1000 種代謝物，為更好地了解信陽毛尖茶在加工過程中代謝物的變化，基于Bray-Curtis算法對正離子模式下采集到的代謝物進行PCoA和HCA，如圖2所示，每個節點代表一個樣品，顏色由深到淺表示信陽毛尖茶加工工藝流程，節點的大小代表不同分組；信陽毛尖茶加工過程樣品以殺青工藝為界限分為兩組，一組為殺青前（Cluster-1，酶促反應階段），包括茶鮮葉樣品和攤放后樣品；另一組為殺青后（Cluster-2，非酶促反應階段），包括殺青后樣品、揉捻后樣品、排把后樣品、理條后樣品以及干燥后樣品。根據無監督下分組結果，經R語言vegan包PERMANOVA驗證（R2＝33.6%，P＜0.01），證明分組結果合理，兩組樣品有顯著性差異。

圖2 信陽毛尖茶加工過程非揮發性代謝物PCoA（a）和HCA（b）Fig.2 Principal coordinate analysis (a) and hierarchical clustering analysis (b) of non-volatile metabolites during Xinyang Maojian tea processing

2.2 信陽毛尖茶加工過程中非揮發性代謝物變化規律

針對檢測鑒定到的1000 種代謝物，分析它們在信陽毛尖茶加工過程中的變化規律，得到代謝物的火山圖（圖3）。圖中節點的大小代表了OPLS-DA結果變量重要性投影分析值（variable importance in projection，VIP）的大小，藍色節點、紅色節點和灰色節點分別代表殺青后相對含量顯著上升（P＜0.05且差異倍數（fold change，FC≥2））、顯著下降（P＜0.05且FC≤0.5）以及無顯著變化的化合物。信陽毛尖茶加工過程中殺青工序導致147 個化合物發生顯著變化（101 個顯著上升，46 個顯著下降）；攤放、揉捻、排把、理條、干燥工序分別導致16（4 個顯著上升，12 個顯著下降）、13（均顯著下降）、16（均顯著上升）、2（均顯著上升）、8 個（2 個顯著上升，6 個顯著下降）化合物發生顯著變化；相較于信陽毛尖茶加工過程中的其他工序，非揮發性代謝物的變化主要發生在殺青工序中，這表明殺青對于高品質綠茶的形成至關重要。

圖3 信陽毛尖茶加工過程組間火山圖Fig.3 Intergroup volcano plots of Xinyang Maojian tea during processing

2.3 信陽毛尖茶殺青前后差異化合物分析

根據信陽毛尖茶加工過程整體化合物PCoA和HCA結合加工過程各工序間代謝物變化規律，將信陽毛尖茶加工過程樣品分為兩大組（Cluster-1和Cluster-2）。為了更加準確地反映兩組樣品間非揮發性代謝物的差異，依據VIP＞1.5且P＜0.05，共篩選出53 種差異化合物（表1），這些差異化合物在信陽毛尖茶加工過程中相對含量的變化規律如圖4所示，其中包括6 種氨基酸及其衍生物類化合物、6 種黃酮苷類化合物、5 種類黃酮化合物、10 種脂類化合物、3 種有機酸及其衍生物類化合物、8 種嘌呤核苷酸類化合物、4 種甾體及其衍生物類化合物、2 種萜類化合物、4 種雜環類化合物以及5 種其他類化合物。

表1 差異化合物信息Table 1 Information of differential compounds

圖4 兩組間差異化合物熱圖Fig.4 Heatmap of differential compounds between two groups

2.3.1 氨基酸及其衍生物

氨基酸是綠茶重要的品質化學成分，在綠茶加工過程中會發生一系列的生化反應，不僅參與茶葉滋味的形成，也能夠影響茶葉香氣的形成。從圖4可以看出，L-谷氨酸（ID：50）的相對含量在殺青后顯著降低；L-酪氨酸（ID：212）和L-苯丙氨酸（ID：43）在殺青后其相對含量顯著上升；另外還有3 個氨基酸衍生物包括甜菜堿（ID：7）、β-尿嘧啶-3-丙氨酸（ID：353）和葡萄糖半乳糖苷羥基賴氨酸（ID：45）的相對含量在在殺青后也顯著上升。前期研究表明在殺青后L-焦谷氨酸和一些氨基酸糖苷的含量顯著上升，本研究中L-谷氨酸相對含量的顯著下降可能與此有關[10]。茶葉中的苯丙氨酸可以通過氧化脫氨和脫羧轉化為具有玫瑰花香味的香氣成分苯乙醛和苯乙醇，殺青后L-苯丙氨酸的積累可能為后續綠茶香氣的形成提供前體物質[20]。

2.3.2 黃酮糖苷類化合物

黃酮類化合物是決定綠茶湯色和滋味的重要組分，在茶葉中主要以糖苷的形式存在，根據構成黃酮苷的糖類區分有單糖苷、雙糖苷、三糖苷和酰化糖苷，具有抗氧化、抗炎等功效[21-23]。如圖5所示，本研究篩選出的6 個黃酮糖苷類差異化合物均為黃酮氧糖苷，包括3 個酰化黃酮糖苷、1 個山柰酚三糖苷、1 個槲皮素單糖苷以及1 個甲基化槲皮素糖醛酸苷。目前關于茶葉中的黃酮碳糖苷的數據不多，可能是黃酮碳糖苷比氧糖苷更穩定[24]。結合圖4可知，甲基化槲皮素糖醛酸苷（ID：866）和山柰酚三糖苷（ID：239）在殺青后其相對含量顯著下降；而槲皮素沒食子酰糖苷（ID：525）、楊梅素沒食子酰糖苷（ID：449）和山柰酚咖啡酰糖苷（ID：1049）以及槲皮素單糖苷（ID：1127）的相對含量在殺青后有明顯上升的趨勢。本研究黃酮糖苷的變化規律與前人的研究的結果相對一致[7]，可能是由于黃酮和黃酮醇苷在高溫加工過程發生異構、水解和部分氧化聚合的結果。黃酮和黃酮醇苷有助于茶的澀味和茶湯顏色，其含量的變化會影響綠茶的品質[11]。

圖5 6 個黃酮糖苷類差異化合物結構Fig.5 Structures of six different flavonoid glycosides

2.3.3 類黃酮化合物

類黃酮化合物是一種具有2-苯基苯并吡喃（C6—C3—C6）結構且對茶湯滋味有重要影響的化合物，主要包括黃酮類、黃酮醇類、黃烷酮類、黃烷醇類、花青素類以及生物類黃酮和部分兒茶素氧化產物茶黃素等，具有抗腫瘤、抗氧化、消炎、預防心血管疾病等健康功效[25-26]。篩選出2 個黃烷-3-醇類，包括EGC（ID：110）和ECG（ID：173），二者的相對含量在殺青后都顯著上升；表兒茶素-(4β-＞8)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯（ID：1059）在殺青后相對含量也有明顯增加；另外1 個黃酮醇類化合物山柰酚（ID：17）和1 個簡單茶黃素（ID：314）的相對含量在殺青后卻呈現顯著下降的趨勢。有研究發現在蒸青綠茶和炒青綠茶加工過程中兒茶素保持相對穩定[7,10]，本實驗研究結果與前期研究存在差異的原因可能是由于兒茶素類化合物在熱處理過程中同時存在異構化反應，部分兒茶素的變化影響了信陽毛尖茶的苦澀口感[27]。

2.3.4 脂類化合物

脂質是茶葉的重要成分之一，約占干茶質量的8%，與茶葉的感官品質有關，而且脂質降解被認為是茶香氣形成的主要途徑之一[28-29]。10 個脂類差異化合物中有1 個脂肪酰類（ID：806），其在綠茶殺青后相對含量呈顯著上升的趨勢；2 個甘油酯類分別是甘油二酯（ID：919）和單甘油酯（ID：970），二者相對含量在殺青后均顯著下降；其他7 個為甘油磷脂類化合物，包括2 個溶血磷脂酰膽堿（ID：833和ID：879）、1 個溶血磷脂酰乙醇胺（ID：127）、1 個磷脂酰甘油（ID：1033），相對含量均在殺青后顯著上升，另外1 個磷脂酸（ID：1028）、1 個溶血磷脂酸（ID：1032）、1 個磷脂酰膽堿（ID：783）的相對含量在殺青后顯著下降。在綠茶加工過程中脂質類物質顯著變化，特別是在殺青階段，應該是與磷脂類化合物糖脂的降解有關，這可能有助于茶葉色澤和香氣的形成[8,30]。

2.3.5 嘌呤核苷酸類化合物

嘌呤核苷酸類化合物在茶葉中普遍被認為是合成嘌呤生物堿的前體物質，對茶葉的風味和功效具有重要作用[31]；而且一些嘌呤核苷及其衍生物因其結構易改造具有抗癌、抗病毒、降血壓等功效，多用作抗病毒類藥物[32-33]。本研究中篩選出的8 個嘌呤核苷酸類化合物包括腺嘌呤核苷（ID：11）、磷酸腺苷（ID：65）、鳥嘌呤（ID：27）、鳥嘌呤核苷（ID：24）、環腺苷酸（ID：70）、環磷鳥苷（ID：117）以及2 個腺苷酸衍生物（ID：89和ID：638）。這些嘌呤核苷酸類化合物在信陽毛尖茶殺青后其相對含量均顯著增加，可能對信陽毛尖茶抗腫瘤、抗病毒等生理活性有重要貢獻。有研究表明呈味核苷酸雖然自身的鮮味微弱，但它們對鮮味及甜味有增效作用，對酸味、苦味、腥味和焦味等不良風味有消除或抑制作用，也參與了綠茶風味的形成[34-35]。

2.3.6 有機酸及其衍生物

茶葉中的有機酸約占其干物質量的3%，對茶湯的酸味、鮮味、甜味等都有貢獻，同時也具有抗炎、抗氧化等活性，是一類對茶葉品質至關重要的化合物[36-38]。篩選出的3 個有機酸類差異化合物分別是VB5（ID：126）、咖啡酰蘋果酸（ID：1125）和三羥基苯甲酸（ID：651），其中VB5在殺青后其相對含量顯著上升，而咖啡酰蘋果酸和三羥基苯甲酸變化趨勢與之相反。VB5的相對含量隨著綠茶加工過程的進行而升高，其抗炎和抗腫瘤等活性對綠茶的活性也有潛在貢獻[39]。

2.4 差異化合物京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路分析

對信陽毛尖茶加工過程殺青前后樣品差異化合物的KEGG注釋結果進行KEGG通路富集分析[40]。如圖6所示，圖中每一個點表示一個KEGG通路，點的大小代表該通路富集差異化合物的數量，點的顏色代表富集顯著性，橫坐標為富集因子，縱坐標軸為通路名稱。20 條代謝通路分別為丙烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，嘌呤代謝，磷脂酰肌醇信號系統，苯丙素的生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，泛酸鹽和輔酶A生物合成，代謝途徑，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，甘油磷脂代謝，甘油脂代謝，芥子油苷生物合成，類黃酮生物合成，黃酮和黃酮醇的生物合成，油菜素甾醇生物合成，莽草酸途徑衍生生物堿的生物合成，鳥氨酸、賴氨酸和煙酸衍生生物堿的生物合成，β-丙氨酸代謝，氨酰基-tRNA生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。差異化合物數量較多的富集代謝途徑是代謝途徑（18 個，78.26%）、嘌呤代謝（5 個，21.74%）以及氨酰基-tRNA生物合成（3 個，13.04%）、甘油磷脂代謝（3 個，13.04%）、苯丙氨酸代謝（3 個，13.04%）。

圖6 兩組間差異化合物KEGG富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of differential compounds between two groups

3 討論

殺青工藝被認為是綠茶品質形成的關鍵工序[41]。研究表明，炒青綠茶的加工過程中相比較于揉捻和干燥工序，非揮發性代謝物的變化主要發生在殺青工序中[9]，這與本研究的結果一致。殺青過程由于高溫濕熱作用，蛋白質大量水解，促進了部分氨基酸的積累，但同時氨基酸又會發生氧化和糖基化反應，導致一些氨基酸衍生物的生成，比如L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和雙糖羥基賴氨酸相對含量的增加。綠茶加工過程中黃酮糖苷總量會有所下降，但變化不顯著，可能是由于高溫殺青的原因[42]。因此，結合本研究所得結果，黃酮多糖苷在高溫殺青條件下可水解為黃酮二糖苷或者單糖苷，黃酮糖苷之間的相互轉化處于動態平衡；而部分黃酮糖苷經高溫殺青和一些酚酸類化合物發生酰化反應可能是綠茶加工過程黃酮糖苷總量輕微下降的主要原因。酰化黃酮糖苷可能是影響綠茶滋味或功效的潛在化合物，但目前對其研究較少[43]。大部分溶血磷脂類化合物相對含量的上升以及磷脂類化合物相對含量的下降可能與殺青高溫條件下的二者間的轉化有關[9]。另有研究表明，磷脂酰類化合物在加熱下可降解，形成一些醛酮類的芳香物質，從而表明磷脂降解與綠茶香氣的形成密切相關[29]。本研究中，咖啡堿、可可堿以及茶葉堿等茶葉中主要的嘌呤生物堿的相對含量在殺青后并未發生顯著變化，可能與它們的化學結構穩定性有關，在綠茶加工過程中變化不明顯，而大量的嘌呤核苷類化合物在綠茶殺青后相對含量呈顯著上升的趨勢，表明殺青工藝是提高大多數核苷酸及其衍生物水平的關鍵，前期的研究中也證實了這一點[7,10]。KEGG代謝通路富集分析發現，信陽毛尖茶加工過程中甘油磷脂、氨基酸以及嘌呤核苷酸類物質代謝水平具有顯著差異（P＜0.05），說明與這些物質相關的代謝通路對信陽毛尖茶的滋味品質有著重要影響。

4 結論

本研究基于非靶向代謝組學的方法對信陽毛尖茶加工過程中非揮發性代謝物進行了系統的分析，在正離子模式下共檢測并比對數據庫鑒定到1000 種化合物，這些化合物的變化主要發生在殺青步驟中，共有147 種代謝物發生顯著變化，殺青對信陽毛尖茶加工過程非揮發性代謝物的影響大于其他工序。多元統計分析結果顯示信陽毛尖茶整個加工過程可以分為兩個階段，即殺青前（酶促反應階段）和殺青后（非酶促反應階段），兩組之間共篩選出53 個差異化合物，包括氨基酸、兒茶素、黃酮糖苷、脂質、嘌呤核苷、有機酸等；其中酰化黃酮糖苷、溶血磷脂酰類、嘌呤核苷類化合物在殺青后相對含量顯著提升，可能是信陽毛尖茶加工過程中的標志化合物，這進一步挖掘了影響信陽毛尖茶品質和功效的主要代謝物。非靶向代謝組學分析技術更加全面細致地揭示了信陽毛尖茶加工過程中代謝物整體特征，進一步加深了對信陽毛尖茶品質和風味成分的了解，在將來的工作中有必要對代謝組學分析出的差異化合物進行更深一步的定量分析，探究其與品質和風味的相關性，為深刻揭示信陽毛尖茶風味和品質形成機制提供依據和參考。