改性瓜爾膠/乳清蛋白/蘆丁復合膜的制備、表征及其對雙孢菇貯藏品質的影響

劉海鵬，李 玲，韓佳利，姜 鑫，馮 磊，王 佳

（山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255049）

近年來，基于石油基膜相關材料對環境的挑戰，學術界和工業界對開發可降解的生物基膜給予了相當大的關注，不可降解的石油基材料的廣泛使用不僅造成環境污染，還會加劇全球變暖問題[1-2]。由此，推動人們將關注的重點轉移到嚴格利用可再生、可生物降解和無毒的生物材料等方面的研究上。

目前，生物基復合膜已成功應用于多種食品的包裝中，如肉制品[3-4]、果蔬[5-6]、食用菌[7]等，可以有效地改善或保持食品品質，并且延長其貨架期。其中，通過瓜爾膠與納米合金粒子或與多糖等混合制備而成的可食用薄膜的研究已有報道，如向瓜爾膠中添加Ag-Cu納米粒子可制備出具有抗菌性能的膜材料，還可在一定程度上改善膜熱性能[8]，另外，將殼聚糖與瓜爾膠復合成膜后再添加納米晶纖維素可有效增強膜的氣體阻隔性能[9]。也有通過直接對瓜爾膠改性進而改善膜性質的研究，如Raj等[10]利用微波輔助二聚酸在綠色條件下對瓜爾膠進行疏水改性，然后將縮合產物與聚乙烯醇混合并澆注成膜，可有效改善膜的疏水性。

單體改性膜的功能較為單一，往往需要復合其他材料以完善膜的綜合性能[9]。乳清蛋白具有良好的成膜性能及阻隔水蒸氣的能力，但是純乳清蛋白膜柔韌性較差，單體狀態下無法滿足膜材要求，將乳清蛋白與瓜爾膠結合可以實現優勢互補，得到柔韌性好、拉伸強度（tensile strength，TS）大、阻氣性良好的復合材料，并且其成膜性優良、安全、無毒、可降解。

蘆丁，又名蕓香苷，是一種天然的黃酮類苷，具有廣泛的藥理特性，如抗腫瘤、抗氧化、抗突變等[11]，另外，黃酮類化合物大都具有抗氧化和清除自由基的能力，如通過外源施用蘆丁可降低水稻中總活性氧及自由基含量[12]。而雙孢菇的采后衰老變質現象同樣也是由氧化損傷及脂質過氧化導致的，因此，本研究制備不同濃度的改性瓜爾膠/乳清蛋白復合膜以及添加蘆丁的生物活性膜，探究最適的改性瓜爾膠與乳清蛋白的比例，生物活性膜的機械性能、阻隔性能以及對雙孢菇保鮮效果的影響。研究通過將活性物質蘆丁負載到生物膜基質中，打破以往噴施、水浸的策略，探索其新穎有效的應用性，拓寬雙孢菇的保鮮技術及生物活性膜的應用手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓜爾膠（黏度5000～5500 cP）、(3-氯丙基)三乙氧基硅烷（3-chloropropyltriethoxysilane，CPTES）（純度≥98%）、蘆丁（質量分數≥97%）、鄰苯二酚、三氯乙酸上海易恩化學技術有限公司；乳清蛋白（質量分數80%）、沒食子酸 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、氫氧化鈉 煙臺遠東精細化工有限責任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）南京都萊生物技術有限公司；愈創木酚 上海韶遠試劑有限公司；福林-酚 上海麥克林生化科技股份有限公司；2-硫代巴比妥酸 上海九鼎化學科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。本研究中所使用的試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DHG-9245A恒溫恒濕箱 上海一恒科學儀器有限公司；Q2000差示掃描量熱儀 美國TA公司；CLASSIC 216壓差法氣體滲透儀 濟南蘭光機電技術有限公司；DTG-60H差熱-熱重同時測定裝置、UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Nicolet-5700傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀 美國熱電尼高力儀器公司；WJGS-009多晶X射線衍射儀 德國Bruker AXS公司；Quanta250場發射環境掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）FEI香港有限公司；GL-20GH冷凍離心機上海安亭科學儀器廠；TA-XT質構儀 北京微訊超技儀器技術有限公司；DDS-307A數顯電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；SCY-2A O2/CO2測定儀 上海鑫瑞儀器公司；NR60CP色差計 廣東三恩時智能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復合膜的制備及表征

1.3.1.1 復合膜的制備

膜液的制備：稱取3 g瓜爾膠并將其添加到多個規格為500 mL的燒杯中，加入適量水不斷攪拌使其水化。首先向燒杯中添加30%（基于瓜爾膠的質量）的CPTES，不斷攪拌使其混合均勻，進而分別向其中添加0、0.6、1.8、3.0 g乳清蛋白以及45%（基于瓜爾膠與乳清蛋白的總質量）的甘油，定容至300 mL。將上述膜液分別命名為G′、G′/W-1、G′/W-2和G′/W-3，制備好的膜液置于80 ℃的恒溫水浴鍋攪拌1 h，靜置除泡備用。

本部分主要對R&D投入與產出所選用的變量作穩健性檢驗，以支撐研究結果的可靠性和穩健性。考慮到企業R&D投入有較強的可逆性，管理層能夠比較容易地操縱當期的R&D研發投入，造成研究結果的失衡。因此，筆者嘗試采用企業技術人員數量作為替代指標來進一步分析。因為技術人員數量是企業R&D研發投入與科技專利產出的另一重要因素，且核心技術人員的離職容易造成核心技術的泄露，所以技術人員的聘任是比較穩定，是不易操控的R&D研發投入產出指標。為此，本文手工搜集了2010—2014年財務報告中的技術人員數量，數據來源于巨潮網，并構建如下模型進行考察:

管理體系文件數量龐大、涉及面廣，且修訂頻繁，有一些操作性的作業指導書如儀器設備操作規程等，還要放置于作業現場，用于指導實驗操作。現行有效的文件版本不易被有關人員快速、便捷地獲取，致使得不到所需要的文件或繼續使用已作廢的文件。在文件的發布方式、分發方法、更新控制方法等方面均存在一些需要改進的地方。

篩選出上述制備的膜中機械性能和阻隔性能表現優良的復合配比的膜液，添加1%蘆丁（基于瓜爾膠與乳清蛋白的總質量），按上述同樣的操作，并將其命名為G′/W-R，靜置除泡備用。

式中：F表示膜斷裂時的最大壓力/N；d表示膜的厚度/mm；W表示膜的寬度/mm；L表示膜延伸后的長度/mm；L0表示膜裁剪的初始長度/mm。

針對此類業務，無論是采用一般計稅還是簡易計稅，納稅人都可以自行選擇是否采用差額計稅方法 （也就說可以采取通常采取的進項稅額抵扣制）。

1.3.1.2 SEM觀察

1.3.2.9 過氧化物酶（peroxidase，POD）活力測定

數據識別更加精準:經匯醫慧影測試，經過深度學習的人工智能系統，讀片準確率可達到90%以上。英特爾至強服務器可將深度網絡模型優化并將數據集進一步加強，進一步幫助提高識別準確率。

1.3.2.5 質量損失率測定

采用FTIR儀對改性膜進行測定，波數范圍選擇4000～500 cm-1，分辨率設定為4 cm-1。

1.3.1.4 熱力學分析

這些短語以前就有，只是被人們賦予了具有時代色彩的內涵，讓人耳目一新。新的詞義，使得漢語的許多舊詞語煥發出了前所未有的活力。

樣品通過裁剪后，稱量1 mg置于密封的鋁鍋中，利用差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，D S C）進行檢測。設置N2條件，測試溫度范圍20～200 ℃，升溫速率設置10 ℃/min。

1.3.1.5 機械性能測定

膜厚度測定：采用測厚儀對膜厚度（d）進行測定，隨機選取6 個位置測量，結果取平均值，并將小數位數精確到千分位。

TS及斷裂伸長率（elongation at break，EAB）測定：首先將膜裁剪成20 mm×50 mm的試樣，膜拉伸速率設置為3 mm/s，測試間距設置為30 mm，利用質構儀測定TS、EAB。每組膜平行測定3 次，結果取平均值。TS和EAB分別按公式（1）和（2）計算：

膜的制備：量取100 mL膜液并將其傾倒于方形模具板（12 cm×12 cm×1.8 cm）上，在45 ℃、相對濕度（relative humidity，RH）40%的恒溫恒濕箱中干燥10 h，干燥后將膜取出，放置在25 ℃、RH 50%的干燥器中平衡2 d左右，以備后續指標測定。

1.3.1.6 阻隔性能測定

水蒸氣透過率（water vapor permeability，WVP）測定：在干燥器中配制好K2SO4飽和溶液，稱取6 g CaCl2于稱量瓶中，用膜將稱量瓶瓶口進行覆蓋，稱量并記錄稱量瓶、CaCl2及復合膜的質量（記為初始質量m0），將密封好的稱量瓶放入干燥皿中，密封，置于溫度25 ℃、RH 50%的環境中，每24 h測量1 次數據，稱量并記錄此時密封好的稱量瓶的質量（m），共測試7 d，WVP按式（3）計算：

式中：?m為密封好的稱量瓶測試后、前的質量差/g；d為復合膜的厚度/cm；S為稱量瓶瓶口面積/cm2；t為時間/s；P為復合膜的內外水蒸氣壓差/Pa。

通常膜的厚度會影響其機械性能，而機械性能的強弱又會影響膜在包裝應用中的可行性[27]。由表1可知，G′/W-2表現出優良的抗拉性及延伸性，同時在此基礎上制備的G′/W-R膜表現亦不俗，這種優良的表現通過SEM及DSC表征也可證實，具備良好的相容性、致密性及熱穩定性的膜，同樣也具有良好的機械性能，通過比較G′/W-2、G′/W-R膜與對照G′膜的TS也可證明。通常，具有良好TS的復合膜往往延伸性能較差，這與許多研究人員的實驗結論[30]一致。有趣的是，在本實驗中，將乳清蛋白與改性瓜爾膠的比例控制在合適的范圍，并在此條件下添加活性物質蘆丁制備G′/W-R膜，其表現出良好的TS（38.46 MPa）及延展性能（30.40%），因而具有良好的應用前景。

1.3.1.7 抗氧化性能測定

1.3.2.3 硬度測定

套管氣伴生的過程，直接影響原油的物性和流動狀態，套壓的變化對于油井的供液能力、地層的生產壓差都將發生一定的作用。

式中：A0為對照組吸光度（以添加等量蒸餾水作為對照）；A1為樣品膜的吸光度。

1.3.2 復合膜對雙孢菇貯藏品質的影響

將挑選好的雙孢菇分為3 組，每組均勻分6 份，置于容器（半徑8 cm、高度18 cm）中并用制備的膜進行頂端密封：分別為G′/W-R組、G′/W-2組及對照組（未覆膜處理）。將容器置于溫度（4±1）℃、RH（80±5）%的環境下貯藏12 d，每2 d進行一次取樣，并對雙孢菇的品質參數和生理活性等相關指標進行測定分析。

2.融入EOP后原高職公共英語教學生態失調現象引發的影響研究。高職公共英語融入EOP后，由于教學內容的改變，勢必會引起其教學生態中的各因子不再平衡，這種失調現象會引發各種不良影響，分析其不良影響可能帶來的后果，提出消除不良影響的必要性。

1.3.2.1 感官評價

用10 分評分法對雙孢菇的開傘、黏度、異味等特性進行評價，＜4 分表示極差；4～5 分表示差；6～7 分表示可接受；8～9 分表示良好；10 分則表示優秀[14]。經過培訓的10 名實驗室小組成員被邀請參與對其進行公正地客觀評價。

1.3.2.2 褐變指數（browning index，BI）測定

參照Wang Xiaomin等[15]的方法進行BI的測定，實驗前先用標準的陶瓷案板對色差計進行標定（L*＝94.41、a*＝-1.08、b*＝2.13），測定并記錄菇皮的相關參數，每組處理均重復測定3 次。

DPPH自由基清除能力參考Shekari等[13]的方法測定。將0.2 g膜樣品加入到5 mL、40 mg/L的DPPH自由基甲醇溶液中，攪拌混合，避光存儲1 h，測定517 nm處的吸光度。DPPH自由基清除率通過式（4）計算：

根據聯合國糧農組織最新統計，中國大蒜出口約占世界大蒜貿易量的90%，在國際市場上具有較強的競爭力[1]。大蒜的使用價值使得人們越來越重視大蒜的種植；但是，由于大蒜不規則的外形，使得蒜農很難實現大蒜的種植要求。我國大蒜的播種還是以人工為主，主要采用鋤頭或者犁開淺溝、人工點播蒜種和覆土等播種方式，雖然這種方式有利于大蒜的生長，但是勞動強度大、效率低，需要耗費大量的工時，生產成本大大提高，達不到農民的合理收益[2-4]。

使用質構儀配備探針（P/75）測定雙孢菇的硬度。實驗前處理速率為3.0 mm/s，實驗中處理速率為2.0 mm/s，實驗后處理速率為3.0 mm/s，測定深度5.0 mm。在上述條件下完成實驗測定。

1.3.2.4 呼吸強度測定

每次固定時間，采用O2/CO2測定儀測定6 h內包裝環境中CO2濃度的增加量，并借此計算雙孢菇的呼吸強度，計算如式（5）所示：

式中：r（CO2）為呼吸強度/（mL/（kg·h））；V為包裝環境中氣體的自由體積/mL；m為雙孢菇的質量/kg；t0為初始時刻/h；t為測定時刻/h；yt0（CO2）為t0時刻容器中CO2的體積分數/%；yt0（CO2）為t時刻容器中CO2的體積分數/%。

1.3.1.3 FTIR分析

采用稱質量法測定雙孢菇在貯藏保鮮期間的質量損失率，計算如式（6）所示：

式中：W為質量損失率/%；m0為雙孢菇的初始質量/g；mt為雙孢菇在時間t時的質量/g。

1.3.2.6 過氧化氫水平測定

按照Xu Dongying等[16]的方法并略作改進。將5 g雙孢菇樣品加入5 mL預冷丙酮，冰浴研磨成漿，以4 ℃、10000 r/min離心15 min。取1 mL上清液加入0.1 mL、體積分數10%四氯化鈦鹽酸和0.2 mL氫氧化銨中，以4 ℃、10000 r/min離心15 min，將得到的沉淀用冷丙酮反復洗滌幾次以去除色素。向洗滌后的沉淀中加入3 mL 2 mol/L硫酸，等待完全溶解后在412 nm處通過吸光度法測定H2O2的含量，結果以10-3mol/kg計。

1.3.2.7 超氧陰離子自由基產生速率測定

將1 g的雙孢菇樣品加入4 mL 5 mmol/L的磷酸緩沖液（pH 7.85），冰浴研磨成漿。以4 ℃、12000 r/min離心10 min得到上清液備用。反應體系包括1 mL上清液、1 mL 0.5 mol/L磷酸緩沖液和1 mL 0.1 mol/L鹽酸羥胺，混勻，常溫孵育20 min，隨后加入1mL 0.17 mol/L對氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol/Lα-萘胺再次孵育30 min，在530 nm處測定其吸光度，超氧陰離子自由基產生速率以10-3mol/（min·kg）計。

1.3.2.8 丙二醛（methylenedianiline，MDA）含量測定

MDA含量的測定按照Ni Xiaoyu等[17]描述的方法并略作修改。取雙孢菇樣品0.8 g，加入4 mL 10%三氯乙酸，冰浴研磨至勻漿，以4 ℃、4000 r/min離心15 min，取1.2 mL上清液與1.2 mL 0.6% 2-硫代巴比妥酸溶液混合，沸水浴15 min，測定450、532、600 nm波長處的吸光度并計算MDA含量。

為了研究薄膜樣品的表面形態，將樣品裁剪成約1 cm2大小，對其進行噴金處理，并借助導電膠固定，在5 kV的加速電壓下對樣品進行測定。

按Zhou Fuhui等[18]描述的方法測定POD活力，略有修改。取2 g雙孢菇組織，加入8 mL 50 mmol/L磷酸鉀緩沖溶液（pH 7.3）（其中含有0.25 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮）冰浴研磨處理，將研磨溶液置于4 ℃、12000 r/min離心20 min，分離得到上清液。反應液為4.5 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）、0.4 mL愈創木酚、0.2 mL過氧化氫、1.0 mL提取上清液，在470 nm處記錄吸光度，酶活力以U/g計。

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1.3.2.10 SOD活力測定

取1 g雙孢菇組織，加入4 mL磷酸鹽緩沖液冰浴研磨處理，4 ℃、12000 r/min離心15 min。采用試劑盒測定雙孢菇組織中的SOD活力，結果以U/g表示。

1.3.2.11 過氧化氫酶（catalase，CAT）活力測定

用Liu Jun等[19]的方法測定雙孢菇中CAT的活力。稱取雙孢菇樣品0.5 g，加入3 mL pH 7.1磷酸緩沖液冰浴研磨至勻漿，4 ℃、10000 r/min離心15 min得到上清液。向0.1 mL上清液中加入1 mL pH 7.1 Tris-HCI、1.5 mL蒸餾水、0.4 mL 200 μmol/L H2O2，記錄240 nm處吸光度的變化，結果以U/g表示。

獨立學院是本科辦學層次，高職高專是專科辦學層次，二者辦學規格截然不同。許多獨立學院法學專業在人才培養中將辦學規格與高職高專混同，這是十分錯誤的。獨立學院法學本科教育與高職高專的法律教育相比，知識基礎要求必須達到普通本科的文化層次，理論體系也應達到一定的廣度和深度，以使學生的專業能力有足夠的理論支撐。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 25軟件進行數據統計，采用鄧肯多重比較進行顯著性分析（P＜0.05），采用Origin 2021作圖，所有結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 不同類型復合膜SEM分析

通過SEM觀察樣品膜的微觀形貌可以發現，G′/W-2膜（圖1C）表面最為平整光滑，且沒有明顯的孔洞，相容性最佳，而G′膜（圖1A）表面雖然也較為光滑平整，但是綜合性能不佳，反觀G′/W-1膜（圖1B）與G′/W-3膜（圖1D），復合膜表面粗糙，不夠平整或存在微小孔洞，影響膜的延展性，造成G′/W-1膜出現這種現象的原因可能是當少量的乳清蛋白加入到大量的瓜爾膠溶液時，由于瓜爾膠高度黏稠且持水性好，可阻礙溶液中的水分與乳清蛋白的接觸，少部分乳清蛋白顆粒未均勻分散，故而在膜表面輕微析出部分白色顆粒；而G′/W-3膜由于過高的乳清蛋白比例添加使其在膜表面析出，從而使得瓜爾膠與乳清蛋白兩者間相容性表現較差。從G′/W-R膜（圖1E）中可以清晰地觀察到致密、無裂痕的表面，有極少部分蘆丁顆粒溶析在膜表面，一方面是蘆丁溶解度低的原因；另一方面，當過量的蘆丁顆粒混溶分散在膜中時，分散不均會導致出現部分蘆丁顆粒聚集的現象，如Zhang Shuangling等[20]利用蘆丁和玉米醇溶淀粉制備納米淀粉包合物（RN），發現向膜中添加高含量RN時也特別容易形成RN聚集體，亦會造成聚集現象，其他類似的情況也常有出現[21]。SEM結果表明，生物活性物質蘆丁較為成功地與改性瓜爾膠/乳清蛋白復合膜混溶，通過氫鍵、疏水作用力以及分子間的共價交聯使三者緊密結合，共同維持活性膜的穩定狀態[22]。

圖1 G′膜（A）、G′/W-1膜（B）、G′/W-2膜（C）、G′/W-3膜（D）及G′/W-R膜（E）的SEM圖Fig.1 SEM images of G′ (A),G′/W-1 (B),G′/W-2 (C),G′/W-3 (D) and G′/W-R films (E)

2.2 不同類型復合膜FTIR分析

從圖2可以看出，各復合膜間呈現出一系列的紅外特征圖譜，波數在3326 cm-1左右的吸收峰與羥基基團數量和位置有關，由羥基的伸縮振動引起，它與N—H伸縮振動合并在同一區域[22-23]；在1640～1540 cm-1附近的吸收峰是N—H伸縮振動引起的[24]；800～1200 cm-1之間出現的峰值代表聚合物主鏈高度耦合的C—C—O、C—OH和C—O—C拉伸模式[23]。羥基酰胺I帶對蛋白質二級結構的變化較為敏感，隨著乳清蛋白濃度的增加，分子間發生非共價相互作用[25-26]，1645 cm-1位置的峰強度降低，蛋白酰胺I帶振動減弱，這有利于乳清蛋白和改性瓜爾膠間的交聯。通過添加蘆丁使得1041 cm-1左右的吸收峰強度降低，這很可能是由于蘆丁和膜基材之間的相互作用（氫鍵、疏水相互作用）導致的[27]。

1.3 測試項目與方法 樣品測試分析由國土資源部合肥礦產資源監督檢測中心完成，測試項目包括As、Cd、Cr、Cu、Ni、Hg、Pb和Zn元素。各分析方法的檢出限、精密度和準確度滿足《多目標區域地球化學調查規范(1：250000)》(DZ/T 0258—2014)要求。其中As和Hg用王水溶解后，采用原子熒光光譜法分析；Cd、Cu和Ni用HCl-HNO3-HF-HClO4溶解后，Cd采用電感耦合等離子質譜法分析，Cu和Ni采用電感耦合等離子體發射光譜法分析；Cr、Pb和Zn用粉末壓片法處理后，采用X熒光光譜法分析；pH采用電位法測試。

圖2 G′膜、G′/W-1膜、G′/W-2膜、G′/W-3膜、G′/W-R膜的FTIR圖Fig.2 FTIR of G′,G′/W-1,G′/W-2,G′/W-3 and G′/W-R films

2.3 不同類型復合膜DSC分析

DSC可反映試樣與參考物之間的能量差隨溫度變化的情況[28]。由圖3可知，每組樣品吸熱峰峰高對應熔化溫度均只出現一個，這反映出復合膜內分子有序結構在受到熱力學作用時被破壞的情況。由于鏈式結構（例如蛋白質的二級結構）分子間和分子內的作用力受到破壞，隨著溫度的升高，有序相結構逐漸被破壞，有機物質融化[29]。G′、G′/W-1、G′/W-2、G′/W-3和G′/W-R吸熱峰的溫度分別為135.91、138.60、147.85、140.01 ℃和148.93 ℃。復合膜吸熱峰隨溫度的變化說明改性瓜爾膠和乳清蛋白在成膜的過程中發生了分子間的相互作用，這使得兩者結合地更為緊密，復合膜熱穩定性增強。G′/W-2的吸熱峰值最高，其熱穩定性也最好，向膜中添加蘆丁后，膜的熱穩定性能得到進一步提升，這可能是由于蘆丁的加入有力地維系了膜基材之間的穩定結構，這一點也可在SEM及FTIR分析中得到驗證。

圖3 G′膜、G′/W-1膜、G′/W-2膜、G′/W-3膜及G′/W-R膜的DSC圖Fig.3 DSC curves of G′,G′/W-1,G′/W-2,G′/W-3 and G′/W-R films

2.4 不同類型復合膜機械性能及屏障性能分析

氧氣透過率（oxygen permeation rate，OP）測定：利用CLASSIC 216壓差法氣體滲透儀測定膜的OP。首先將膜裁剪成大小合適的圓片并置于測試區，封閉抽真空，當達到規定的真空度后，充入一定壓力的O2進行測定，在溫度23 ℃的條件下，完整記錄實驗測試數據。

表1 膜的力學性能及阻隔性能Table 1 Mechanical and barrier properties of the films

WVP是食品保鮮包裝的一個重要參數，可用于評估食品保鮮膜控制食品與外部環境之間水分傳輸的狀態[31]。膜的WVP和OP結果如表1所示，G′膜的WVP和OP分別為2.54×10-12（g·cm/（cm2·s·Pa））和1.78×10-11（cm3·cm/（cm2·s·Pa）），乳清蛋白含量的增多會導致薄膜WVP明顯升高，這可能是由于復合膜中存在極性基團導致其更易吸附水蒸氣[32]。在改性瓜爾膠/乳清蛋白復合膜中加入生物活性物質蘆丁可以顯著改善水蒸氣在復合膜中的吸附和擴散。OP也是評估所制備的生物活性膜在食品保鮮包裝方面可適用性的重要參數之一，乳清蛋白含量的增加并不會導致OP顯著增加，但添加蘆丁后，生物活性膜的OP遠低于G′膜。添加蘆丁后，生物活性膜的WVP和OP的降低可能是由于改性瓜爾膠、乳清蛋白和蘆丁的官能團之間形成了強分子相互作用，膜表面均勻性和致密性增強[33]。

2.5 不同類型復合膜抗氧化性分析

DPPH自由基清除率的測定常用于評估樣品所具備的抗氧化能力，其中各類膜的DPPH自由基清除率結果如圖4所示，復合膜具有一定的抗氧化性能，能在保鮮過程中起到好的貯藏效果。G′近乎沒有抗氧化能力，G′/W-1、G′/W-2、G′/W-3膜等顯現出一定的抗氧化能力，原因是乳清蛋白自身結構特性就具備一定的抗氧化能力[34]，而通過負載蘆丁，G′/W-R膜的DPPH自由基清除率顯著提高（P＜0.05），原因是蘆丁的存在起到了抗氧化效果，其自由基清除率在90.5%以上，可極大地延長雙孢菇的保鮮貯藏期限。此功效由于多酚化合物分子內部含有芳香環和羥基，形成了穩定的苯氧自由基來淬滅自由基[35]，同時也說明活性膜中蘆丁的化學性質穩定，G′/W-R膜可以有效保持其抗氧化活性。

課程考核以思辨能力考核為主，即通過適當增加主觀題來考察學生對解題思路和方法的掌握程度，提倡采用開放式答案，鼓勵學生結合自己的專業來闡述觀點。此外，學習是動態發展的，不能僅憑期末考試一錘定音，因此，要準確反映學生真實的學習效果，需構建以過程性評價為基準的多元化綜合評價體系。

圖4 G′膜、G′/W-1膜、G′/W-2膜、G′/W-3膜、G′/W-R膜的抗氧化性Fig.4 Antioxidant capacity of G′,G′/W-1,G′/W-2,G′/W-3 and G′/W-R films

2.6 感官評價

對雙孢菇的開傘、黏度及異味情況進行感官評價，是評估其新鮮程度的直接手段。從圖5A可以看出，隨著貯藏時間的延長，開傘程度逐漸增加，尤其體現在8～12 d時，菇體已經老化，對照組表現更為明顯，而G′/W-2及G′/W-R覆膜保鮮的雙孢菇表現較好。黏度與異味的存在也可直觀表征雙孢菇的新鮮程度，從圖5B、C可以看出，雙孢菇的黏度在貯藏中后期發生較大的變化，經過對比發現，對照組的雙孢菇黏性表現極差，顯著低于其他處理組（P＜0.05），原因在于在貯藏中后期，雙孢菇硬度降低，細胞壁材料（如β-葡聚糖、纖維素等）損失，而這些往往是由于酶促反應導致的[36]，此時菇體極易遭受微生物侵染，進而產生異味，在貯藏后期這一表現愈發明顯。從圖5D可以看出，G′/W-R由于添加蘆丁，可有效降低雙孢菇的生理代謝活動，減少微生物侵染及酶的活性代謝[37]，可更為持久地延長雙孢菇的新鮮度。

圖5 不同處理雙孢菇的感官評價及表面色澤Fig.5 Sensory evaluation and surface color of A.bisporus with different treatments

2.7 不同類型復合膜對雙孢菇BI、硬度、呼吸及質量損失率變化的影響

雙孢菇在采收后逐漸褐變，同時營養價值下降[38]。為進一步研究復合膜對采后雙孢菇保鮮的影響，測定雙孢菇BI的變化。由圖6A可知，整個貯藏期間雙孢菇菇皮的BI值出現總體上升趨勢，貯藏結束時，對照組菇皮BI值升高至32.5%，而G′/W-2、G′/W-R處理組菇皮BI值分別升高至30%和22%，且始終低于對照組。添加蘆丁的保鮮膜處理雙孢菇的BI值經過12 d后變化最小且最低，說明該膜的保鮮效果最佳。由此可知，G′/W-R膜可以延緩雙孢菇褐變，有利于維持白度。

圖6 不同處理條件下雙孢菇菇皮BI（A）、呼吸強度（B）、硬度（C）、質量損失率（D）變化情況Fig.6 Changes in BI (A),respiratory intensity (B),hardness (C),and mass loss rate (D) of A.bisporus skin under different treatment conditions

呼吸強度與硬度以及質量損失均有所關聯，呼吸越強，代謝越旺盛，雙孢菇中水分及營養損失越快，硬度降低，質量下降。因此，果蔬保鮮中最主要的目的是抑制采后呼吸，平衡代謝循環[34,39]。整個貯藏期間的呼吸強度在前6 d有所提升，而隨后又開始下降（圖6B），其中第6天時，G′/W-R處理組呼吸峰值僅為2.8×103mL/（kg·h）。顯然，對照組處理的雙孢菇呼吸強度最強，并且在2～12 d過程中顯著高于其余兩組（P＜0.05），而這主要是由于包裝膜優異的阻氣性能使得貯藏環境中CO2濃度升高，形成微氣調環境，有效抑制了雙孢菇的呼吸作用，呼吸作用降低，雙孢菇組織內部的新陳代謝也隨之降低，也可以減緩雙孢菇硬度的降低（圖6C），有效延長貯藏期。與此同時，與對照組相比，覆膜包裝處理的雙孢菇，其質量損失率更低（圖6D），整體質量損失率僅為對照組的25%，這是由于包裝材料可有效阻隔水蒸氣的擴散導致的，因此在貯存期間水分散失更少，更有利于維持好雙孢菇的生理狀態[40]。

這節課的主題是“WHAT MAKES A GOOD QUESTION？”（怎樣能提出一個好問題？）。問題一出，同行的老師禁不住悄悄問：“這是歷史課嗎？”這時，老師假設情境：假如你遇到一位多年前來自中國的移民，你想問他些什么問題？什么樣的問題是一個好問題？老師要求每個學生寫出五個問題。寫完后，兩三人一組交流，再進行班級交流，學生踴躍舉手發言。至此，我們才反應過來，原來這位老師是把歷史知識當成了問題探究的素材，我們不禁暗自叫好。

2.8 不同類型復合膜對雙孢菇H2O2水平、超氧陰離子自由基產生速率及MDA含量的影響

如圖7A所示，在整個貯藏期間，3 個組的H2O2水平均呈現出增加的趨勢，但是對照組的H2O2水平顯著高于G′/W-R組（P＜0.05），在貯藏第12天時，對照組H2O2水平增加了105%，G′/W-2組H2O2水平增加了130%，而G′/W-R組H2O2水平僅增加了55%。圖7B顯示，3 個處理組的雙孢菇在貯藏期間產生速率總體上表現為上升趨勢，對照組與G′/W-2組相比，其產生超氧陰離子自由基的速率更高，相對G′/W-R組處理表現得更為顯著(P＜0.05)。圖7C顯示，在雙孢菇的整個貯藏期間MDA含量與H2O2水平表現出類似的趨勢，G′/W-R組處理的雙孢菇中MDA水平顯著低于對照組處理及G′/W-2組處理（P＜0.05），貯藏末期G′/W-R組MDA含量為1.72×10-3mol/kg，G′/W-2組MDA含量為1.93×10-3mol/kg，對照組MDA含量為2.68×10-3mol/kg。

圖7 不同處理對雙孢菇H2O2水平（A）、超氧陰離子自由基產生速率（B）、MDA含量（C）的影響Fig.7 Effects of different treatments on H2O2 level (A),superoxide anion radical production rate (B),and MDA content (C) in A.bisporus

需氧生物體內的氧分子作為電子受體在物質代謝過程中被還原，少部分氧分子被單一電子還原形成超氧陰離子自由基，而部分超氧陰離子自由基又可轉化為H2O2，使得生物體組織內部的功能及結構受到損傷。G′/W-R組對H2O2及超氧陰離子自由基的抑制效果顯著高于對照組，而G′/W-2處理效果次之，表明覆膜包裝可以在一定程度上起到抗氧化作用。MDA是膜脂過氧化過程的關鍵產物之一，可體現雙孢菇自由基損傷的程度。由圖7可以明顯看出，G′/W-R處理所起到的保鮮效果更好，MDA水平顯著低于其余兩組處理（P＜0.05），說明添加蘆丁的復合膜對雙孢菇進行覆膜保鮮處理可有效抑制雙孢菇組織中MDA的累積，提高雙孢菇的抗性，有效延緩雙孢菇衰老。

2.9 不同類型復合膜對雙孢菇POD、SOD及CAT活性的影響

POD活性的增加可防止活性氧的過度積累，降低H2O2對細胞膜系統的損害[41]。如圖8A所示，所有處理組的雙孢菇在前6 d POD活性均呈上升趨勢，隨后又有所降低。在6～12 d，G′/W-R組雙孢菇的POD活性顯著高于其余兩組（P＜0.05），在貯藏末期，G′/W-R組的POD活力比對照組高50%左右。與其他生物一樣，蘑菇本身也擁有一套抗氧化系統，其中SOD作為一級防御，可將超氧陰離子自由基轉化為H2O2，然后被CAT清除，以達到應對生物或非生物脅迫的目的[42-43]。如圖8B所示，在整個貯藏期間，所有處理組的雙孢菇在前8 d SOD活性均有所增加，隨后又逐漸下降。在4～12 d的貯存期中，G′/W-R組的SOD活性顯著高于其余兩組（P＜0.05），在貯藏末期（12 d），G′/W-R組的雙孢菇SOD水平比G′/W-2組高16.5%，比對照組水平高34.4%。CAT是一種酶類清除劑，可促使H2O2分解為分子氧和水，有效清除植體內的H2O2，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一[42]。圖8C顯示3 組蘑菇在前8 d的貯存過程中CAT活性均有所增加，在8～12 d活性下降。除前4 d以外，G′/W-R處理組的雙孢菇CAT活性顯著高于對照組（P＜0.05），在4～8 d時間段中，G′/W-R處理組顯著高于G′/W-2處理組（P＜0.05），在貯藏末期，G′/W-R處理的雙孢菇CAT活力比對照組高24.8%。

圖8 不同處理對雙孢菇POD（A）、SOD（B）、CAT（C）活力的影響Fig.8 Effects of different treatments on activities of POD (A),SOD (B),and CAT (C) in A.bisporus

在本研究中，應用G′/W-R膜對雙孢菇進行覆膜保鮮，經過與其他兩組實驗的對比發現，G′/W-R的保鮮效果更為出眾，蘆丁的參與提高了SOD、POD及CAT的生物活性，通過酶促反應降低活性氧水平，達到一種動態平衡狀態，維持雙孢菇的正常生理活動。這與Ostrakhovitch等[44]篩選比較不同自由基抑制劑的過程中發現，生物類黃酮蘆丁在有效抑制氧自由基過量產生的內在機理是相一致的。

3 結論

本研究以改性瓜爾膠作為膜基材，通過添加不同量的乳清蛋白，成功制備出一種性能優良的復合膜。通過SEM、FTIR及DSC等手段對膜進行表征，以探究最適的改性瓜爾膠與乳清蛋白的比例，另外，通過力學性能和水、氣阻隔性的測定來驗證膜的物理屏障性能，通過DPPH自由基清除率評估各復合膜的抗氧化能力，最后在最佳膜液配比下，將蘆丁添加到膜液中，制備成G′/W-R膜，并將其應用于雙孢菇保鮮實驗，探究其保鮮效果。

研究認為，復合膜的各組分之間表現出良好的相容性，其中G′/W-2膜抗拉強度及EAB明顯高于G′/W-1和G′/W-3復合膜，熱穩定性最好，此外，該膜的透水透氣性能適中。添加蘆丁后制備的生物活性膜G′/W-R的TS、EAB、WVP及OP阻隔性能均得到有效改善。通過SEM和FTIR分析發現，改性瓜爾膠、乳清蛋白和蘆丁之間存在強的分子相互作用，各膜組分之間具有良好的相容性。與對照G′膜相比，這種相互作用降低了膜的WVP、OP。將所制備的活性膜應用于雙孢菇保鮮實驗中發現，與對照組及G′/W-2組相比，G′/W-R組的處理可有效延緩菇體褐變，保持高硬度，同時還能抑制呼吸，延緩質量損失，這其中致密的膜材料起到了調節包裝內氣體條件的作用，有效阻隔了包裝內氧氣跟水蒸氣的進出，同時蘆丁作為一種黃酮類化合物，具有清除自由基和防止自由基積累的能力，有效抑制H2O2、超氧陰離子自由基及MDA水平，利于維持細胞膜的完整性和穩定性。外源蘆丁的存在也可維持較高的類黃酮含量，終止自由基鏈反應，有效提高POD、SOD及CAT的活性，提高雙孢菇的抗氧化能力，抵御非生物脅迫傷害。綜上，改性瓜爾膠/乳清蛋白/蘆丁復合膜表現優良，具有良好的機械性能及阻隔效果，在雙孢菇保鮮包裝領域中表現出不凡的優勢，具有廣闊的應用前景。