羧甲基殼聚糖誘導羅倫隱球酵母對葡萄柚果實細胞壁代謝的影響

杜嶸宇，黃二賓，吳化雨，王 芳,2，鄧 佳,3,*

（1.西南林業大學林學院，云南 昆明 650224；2.西南地區生物多樣性保育國家林業局重點實驗室，云南 昆明 650224；3.西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224）

葡萄柚（Citrus paradisi），蕓香科柑橘屬果實，又名西柚，為世界四大柑橘類群之一。葡萄柚果實富含維生素，具有很高的營養價值，由于其果肉多汁，常用于鮮食和果汁加工[1-2]。近年來隨著其經濟價值的不斷提高，如何有效延長采后葡萄柚果實的貯藏期成為了研究的焦點。果實后熟軟化一直是影響果實貯藏的關鍵性問題。果實質地的軟化不僅會直接影響到果實的口感、外觀品質，更易使其受到病原侵染發生病害從而縮短其貯藏期[3-4]。目前對采后果實軟化過程的研究發現，果實軟化的主要原因是果膠、半纖維素、纖維素等構成果實細胞壁的主要物質在細胞壁降解酶的作用下被水解，引起細胞壁結構的破壞和細胞間連接減少，導致細胞間黏合力下降，從而致使軟化發生[5]。研究發現，外源草酸處理采后李果實能有效維持果實內細胞壁多糖含量，使果實保持較高的硬度[6]。Wang Shiyao等[7]發現乙烯吸收劑處理對采后藍莓果實軟化有明顯抑制作用。蘆玉佳等[8]研究發現，外源果糖處理采后杏果實也能有效抑制果實貯藏期間細胞壁代謝酶的活性，從而延緩果實貯藏期間的軟化進程。

目前，生物防治以其綠色、健康的優點，近年來成為了研究的熱點。拮抗酵母能夠有效保持貯藏期間果實的品質，提高采后果實的抗性[9-12]。研究表明，在培養基中添加多糖類物質，可以有效提高拮抗酵母的生防能力。王蕓[13]研究發現，添加0.5%β-葡聚糖誘導培養隱球酵母處理采后蘋果，可提高果實內多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等抗性相關酶的活性，顯著提高酵母防治蘋果青霉病的生防效力，并未對蘋果的貯藏品質造成任何不良影響。黃伊寧[14]證實，添加N-乙酰氨基葡萄糖培養海洋紅冬孢酵母對梨果實擴展青霉表現出了更好的拮抗效果。顧寧[15]同樣證實，殼聚糖誘導培養的膠紅酵母對草莓灰霉病的抑制效果明顯。羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMCS）是殼聚糖的衍生物，屬于多糖物質，其具有無毒、易溶于水且抗菌的特性，CMCS處理能有效維持采后果實貯藏品質，增強果實抗病性，從而延長果實的貨架期，常被用作果品采后保鮮劑[16-20]。課題組前期研究同樣發現，添加CMCS誘導培養羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）（CMCS-C.laurentii）對采后葡萄柚果實青、綠霉病生防效力有明顯的促進作用，維持果實貯藏品質[21]。

細胞壁是植物抵御大多數病菌侵染的第一道重要結構屏障，細胞壁的強度與植物抗病密切相關[22]。添加多糖物質培養酵母處理可增強采后果實抗病能力，除誘導提高果實抗性防御酶活性外，誘導培養酵母對果實細胞壁代謝的報道較少。因此，本研究依據此前研究結果，以葡萄柚果實為實驗材料，研究CMCS誘導培養羅倫隱球酵母對采后葡萄柚果實細胞壁組分含量、細胞壁降解酶活性和細胞壁微觀結構的影響，以期明確CMCS誘導培養羅倫隱球酵母處理對葡萄柚果實細胞代謝的影響，為探究多糖誘導提高酵母對果實采后病害防治效力機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料：‘里約紅’葡萄柚，采購于佳沃（青島）果業有限公司。挑選出圓潤飽滿、大小一致、成熟度一致、無機械損傷且無病蟲害的果實，用純水洗凈晾干后，再用2%次氯酸鈉（NaClO）溶液浸泡2 min，置于經過消毒處理的塑料筐中晾干后室溫條件（25 ℃、相對濕度85%～95%）下保存備用。

羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentiiATCC18803），購買于廣東微生物研究所。采用YM液體培養基進行培養，置于28 ℃、200 r/min搖床振蕩培養24 h，濃度為1×107CFU/mL（血球計數板計數），備用。

CMCS（羧基化度≥80%）大連美侖生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

CP214電子天平 蘇州賽恩斯儀器有限公司；手持GY-2硬度計 艾德堡儀器有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；HH-B11-BS-II恒溫培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；TS-2102C恒溫搖床 上海天呈實驗儀器制造有限公司；70型離子交換純水器 上海南華醫療器械廠；AF103商用制冰機 美國斯科茨曼公司；UV6100紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；MIKRO 220R冷凍型臺式高速離心機 廣州市華粵行儀器有限公司；DK-98-IIA恒溫不銹鋼水浴鍋 蕭山永發電器有限公司；702型超低溫冰箱 美國賽默飛世爾科技公司；GZX-GF101電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫療器械有限公司；H-7650型生物透射電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 CMCS誘導羅倫隱球酵母（CMCS-C.laurentii）懸浮液的制備

將培養好的C.laurentii酵母懸浮液接種于含0.5 g/100 mL CMCS的NYDB液體培養基中，接種量為2%，裝液量為100/500 mL，置于28 ℃、200 r/min的搖床上培養24 h，濃度為1×107cells/mL（血球計數板計數），待用。

1.3.2 果實處理

本實驗設2 個處理，對照組（CK）：用無菌水浸泡果實3 min；處理組（CMCS-C.laurentii）：用CMCS誘導培養羅倫隱球酵母（1×107cells/mL）懸浮液浸泡果實3 min。每組處理60 個果實，上述處理浸泡、自然晾干后套袋，分裝于經過消毒處理的塑料筐內，置于室溫條件（25 ℃、相對濕度85%～95%）貯藏75 d。每15 d取樣，每次取10 個果實進行相關指標的測定，重復3 次，共取樣6 次。

1.3.3 葡萄柚果實細胞壁代謝相關指標測定

1.3.3.1 硬度與質量損失率的測定

果實硬度使用手持GY-2硬度儀測量；果實質量損失率使用CP214電子天平測定。

1.3.3.2 貯藏期間果實細胞壁多糖物質含量測定

細胞壁多糖的提取參照蘆玉佳[8]和鄧佳[4]等的方法，分步提取細胞壁水溶性果膠（water-soluble pectin，WSP）、離子型果膠（ion bound pectin，ISP）、共價結合型果膠（covalent bound pectin，CSP）（分別用去離子水、50 mmol/L乙二胺四乙酸溶液和50 mmol/L Na2CO3溶液抽提）、緊密型半纖維素（24% KOH-soluble fraction，24KSF）和松散型半纖維素（4% KOH-soluble fraction，4KSF）（分別用24%和4% KOH溶液抽提）。果膠多糖含量采用咔唑法測定，半纖維素多糖含量采用蒽酮法測定，結果均以mg/g表示。以上細胞壁物質含量測定3 次重復，取平均值。

1.3.3.3 貯藏期間果實細胞壁降解酶活力測定

酶液提取及測定參考Deng Yun等[23]的方法，果膠甲酯酶（pectin pectylhydrolase，PE）活力測定采用NaOH滴定法、纖維素酶（cellulase，CX）和多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）活力測定采用DNS比色法，以葡萄糖為標樣作標準曲線。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-arabinofuranosidase，α-L-Af）活力測定采用比色法。上述所有酶活力的測定均重復3 次，結果取平均值。

1.3.3.4 果實細胞壁結構透射電子顯微鏡觀察

分別于處理后第0、15、30天取葡萄柚果實囊衣采用生物透射電子顯微鏡進行細胞壁超微結構觀測參照劉峰娟[24]和Li Yaling[25]等的方法。分別于采收當天、貯藏第15天和貯藏第30天取對照、CMCS-C.laurentii處理組葡萄柚果實囊衣樣作為樣品。將葡萄柚果肉囊衣切為1 mm×1 mm大小的方形樣品，用2.5%戊二醛固定液（0.1 mol/L磷酸緩沖液，pH 7.2）浸泡12 h，置于4 ℃下充分固定。使用磷酸緩沖液反復漂洗浸泡后的果肉組織，漂洗3 次，每次漂洗15 min。再用含有1%鋨酸固定液固定2 h后，用磷酸緩沖液再次漂洗3 次，每次15 min。分別用體積分數為30%、50%、70%、80%、90%和純丙酮梯度脫水，每個階段洗脫20 min。使用環氧丙烷滲透，環氧樹脂包埋。在37 ℃下聚合12 h，60 ℃條件下聚合48 h。將樣品切成60 nm的超薄切片后用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，對樣片觀察并拍照。

1.4 數據處理與分析

使用Excel 2010進行數據統計，使用SPSS 20.0軟件對數據進行單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05表示差異顯著，并使用Origin 2019進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 CMCS、C.laurentii不同處理對果實硬度的影響

由圖1可知，4 個處理組采后葡萄柚果實硬度均呈下降趨勢。貯藏期間，CMCS-C.laurentii處理可有效維持果實硬度，效果顯著優于其他處理組（P＜0.05），C.laurentii與CK處理無顯著差異。貯藏結束時，CMCS和CMCS-C.laurentii處理組果實的硬度顯著高于CK組（P＜0.05），分別較CK高出35.37%和70.73%，此外，CMCS-C.laurentii處理對果實硬度的維持效果顯著優于CMCS單獨處理（P＜0.05）。在此基礎上，對CMCS-C.laurentii和CK處理組的細胞壁代謝相關物質及酶活力、細胞超微結構進行測定分析。

圖1 CMCS、C.laurentii不同處理對果實硬度的影響Fig.1 Effects of CMCS and/or C.laurentii treatments on fruit firmness

2.2 CMCS-C.laurentii處理對果實質量損失率的影響

如圖2所示，與CK樣品相比，CMCS-C.laurentii處理組果實在貯藏過程中的質量損失率顯著降低（P＜0.05）。貯藏75 d后，CK組果實的質量損失率達到24.72%，而處理組果實質量損失率僅為22.12%。

圖2 CMCS-C.laurentii處理對果實質量損失率的影響Fig.2 Effect of CMCS-C.laurentii treatment on fruit mass loss percentage

2.3 貯藏期間果實細胞壁多糖含量測定結果分析

如圖3A所示，葡萄柚果實在貯藏前期WSP含量變化并不明顯，貯藏30 d時果實的WSP含量大幅度升高，并在之后的貯藏階段維持較高水平。貯藏中后期（30～75 d），CMCS-C.laurentii處理明顯抑制果實WSP上升，其含量顯著低于CK組（P＜0.05）。貯藏第30、45天時，CMCS-C.laurentii處理組的WSP含量僅為CK組果實的47.65%和47.47%。

圖3 CMCS-C.laurentii處理對葡萄柚果實中的WSP（A）、ISP（B）、CSP（C）、4KSF（D）、24KSF（E）含量的影響Fig.3 Effect of CMCS-C.laurentii treatment on the contents of WSP (A),ISP (B),CSP (C),4KSF (D) and 24KSF (E) in grapefruits

如圖3B所示，貯藏期間葡萄柚果實ISP含量整體波動上升。貯藏初期ISP含量穩定維持在較低水平，第30天時ISP含量急劇增加，第45天略有下降，其后隨著貯藏時間的延長，果實中ISP的含量持續升高，于第75天達最大值。CMCS-C.laurentii處理抑制果實的ISP含量上升，貯藏75 d時，該處理組果實的ISP含量較CK組果實降低26.22%。

由圖3C可知，隨貯藏時間的延長，葡萄柚果實CSP的含量逐漸下降。CK組果實CSP在貯藏中后期（30～75d）持續急劇下降，貯藏75 d時僅為貯藏初期含量的7.70%。CMCS-C.laurentii處理可以較好地維持果實CSP含量。

貯藏期間，葡萄柚果實的4KSF含量變化幅度較小（圖3D）。CMCS-C.laurentii處理組果實4KSF含量明顯低于CK組，兩者差異顯著（P＜0.05）。如圖3E所示，葡萄柚果實24KSF含量在貯藏期間呈下降變化趨勢，CMCS-C.laurentii處理抑制了果實中24KSF組分物質的降解，有效維持了處理組果實中24KSF含量（P＜0.05）。

2.4 CMCS-C.laurentii處理對果實細胞壁代謝酶活力的影響

采后葡萄柚果實PE活力呈現升高的趨勢，在貯藏30 d出現峰值（圖4A）。CMCS-C.laurentii處理抑制了采后葡萄柚果實PE活力上升，特別在貯藏初期（15～30 d）的抑制效果較顯著（P＜0.05）。在貯藏第30天，處理組果實PE活力僅為CK組果實的64.10%。

圖4 CMCS-C.laurentii處理對葡萄柚果實PE（A）、PG（B）、CX（C）、α-L-Af（D）、β-Gal（E）活力的影響Fig.4 Effect of CMCS-C.laurentii treatment on the activities of PE (A),PG (B),CX (C),α-L-Af (D) and β-Gal (E) in grapefruits

如圖4B所示，在貯藏過程中，葡萄柚果實PG活力逐漸上升，貯藏前中期增幅不大，但在貯藏后期（60～75 d）急劇上升，CMCS-C.laurentii處理可顯著抑制果實PG活力上升（P＜0.05）。貯藏75 d時處理組PG活力為6.42 U/g，僅為CK組的80.15%。

由圖4C可知，采后葡萄柚果實CX活力較高，隨貯藏時間延長，期間波動變化。CMCS-C.laurentii處理對葡萄柚果實CX活力有抑制作用，貯藏早期（15～30 d）、晚期（75 d），CK組果實CX活力抑制效果較顯著（P＜0.05），CX活力明顯低于CK組。

采后葡萄柚果實α-L-Af活力變化情況如圖4D所示，貯藏前期果實α-L-Af活力呈下降趨勢，在貯藏45 d達最低點，之后酶活力逐漸升高，于75 d達最高值。CMCS-C.laurentii處理對果實α-L-Af抑制作用明顯，在貯藏過程中，該處理果實α-L-Af活力始終維持較低水平，除第30天外，CMCS-C.laurentii處理葡萄柚果實α-L-Af活力均顯著低于CK組果實（P＜0.05）。

貯藏期間，葡萄柚果實β-Gal活力的變化趨勢與α-LAf相似（圖4E）。同樣，CMCS-C.laurentii處理明顯抑制了采后葡萄柚果實β-Gal活力的上升，整個貯藏期間，處理組果實β-Gal活力均顯著低于CK組。

2.5 貯藏期間果實細胞超微結構變化

如圖5A、B所示，采后當天葡萄柚果肉囊衣的細胞排列整齊，細胞壁結構清晰完整致密，細胞內液泡飽滿，質壁結合緊密，細胞壁中膠層結構致密光滑，細胞間隙明顯，此時果實硬度最高。圖5C～F為葡萄柚果實貯藏第15天時的細胞結構，此時CK組（圖5C、D）果實細胞間隙擴大，中膠層區域出現絲狀物質，細胞壁出現彎曲現象，結構沒有初始階段緊密；細胞內液泡收縮，液泡膜出現褶皺，有輕微質壁分離現象發生。CMCS-C.laurentii處理組葡萄柚果實細胞壁結構相對完整（圖5E、F），細胞間隙并無明顯擴大，中膠層清晰完好；細胞膜略有收縮，尚未出現質壁分離現象，細胞器形態正常。與CK組相比，CMCS-C.laurentii處理組果實細胞結構相對完整，其果實硬度也明顯高于CK組。圖5G～J為貯藏第30天葡萄柚果肉囊衣細胞超微結構，CMCS-C.laurentii處理組與CK組果肉囊衣細胞結構均發生不同程度的變化。此時，CK組（圖5G、H）果實的細胞超微結構變化更為顯著，細胞質壁分離現象更加明顯，細胞器有外泄情況出現，細胞壁降解情況嚴重，細胞邊界模糊。與CK組相比，處理組（圖5I、J）果實細胞壁中膠層也出現絲狀物質，細胞間隙略有增大，三角區域出現部分絮狀空隙；細胞膜略有收縮質壁分離現象仍不明顯，胞內結構相對完整，CMCS-C.laurentii處理組葡萄柚果肉囊衣細胞結構受損程度較輕，有效維持了葡萄柚果實硬度。

圖5 貯藏期間（第0、15、30天）CK組與CMCS-C.laurentii處理組葡萄柚果肉囊衣細胞超微結構Fig.5 Cell ultrastructure of grapefruit segment membrane from the control and CMCS-C.laurentii treatment groups during storage (day 0,15 and 30)

2.6 果實硬度、質量損失率、細胞壁降解酶活性以及細胞壁多糖物質含量變化的相關性分析

由表1可以看出，CK與CMCS-C.laurentii處理果實的硬度與質量損失率均呈極顯著負相關；細胞壁多糖物質含量（除4KSF）與果實硬度也具有顯著相關性，果實硬度與WSP、ISP和4KSF含量均呈現負相關，與CSP和24KSF含量呈正相關；PG活力與CSP含量均呈極顯著負相關。經CMCS-C.laurentii處理后PG活力與ISP含量呈現顯著正相關。相關性分析結果表明，在貯藏期間經CMCS-C.laurentii處理后，果實硬度及細胞壁代謝酶與果實細胞壁多糖物質的相關性系數發生變化，說明CMCS-C.laurentii處理對果實細胞壁代謝具有一定的調控作用。

表1 葡萄柚果實貯藏期間硬度與質量損失率及細胞壁多糖物質含量變化的相關性分析Table 1 Correlation analysis between fruit firmness and fruit mass loss percentage and cell wall polysaccharide contents of grapefruits during storage

3 討論

果實硬度是判斷果實品質的關鍵指標，也是決定果實貨架期長短的關鍵，果實采后軟化也加劇了運輸和處理過程中造成的損害，增加了貯藏病害發生的可能性[26]。目前針對果實采后貯藏的研究顯示，果實的軟化主要與細胞壁降解有關。植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質等結構多糖，木質素以及少量蛋白質和礦物質等構成[27]。導致采后果實內果膠類物質降解，主要是PG和PE相互作用的結果[28]。而CX、α-L-Af和β-Gal活性的變化是果實是否會進一步軟化的關鍵。

在果實采收時，果實內細胞壁結構緊密穩定，果實內主要以CSP和24KSF等難溶且結構緊密的細胞壁多糖為主，隨著貯藏期間細胞壁水解酶的作用，CSP和24KSF被解聚為更為松散WSP、ISP以及4KSF等細胞壁多糖物質[4,8]。因此，葡萄柚果實內WSP、ISP和4KSF等含量與果實硬度呈現負相關，而CSP和24KSF的含量則隨著果實的軟化而降低。

本研究結果表明，采用CMCS-C.laurentii酵母液對采后葡萄柚果實進行處理能顯著維持貯藏期間果實的質地。對貯藏期間葡萄柚果實內果膠、半纖維素物質的含量進行測定，發現CMCS-C.laurentii處理能延緩葡萄柚果實CSP組分降解，抑制WSP和ISP含量升高，同時，果實中緊密型半纖維素（24KSF）向松散型半纖維素（4KSF）降解轉化的過程也得到了抑制，這與此前鄧佳等[4,29]通過鈣處理采后葡萄柚果實的實驗結果一致。貯藏期葡萄柚果實細胞壁超微結構變化也表明，CMCS-C.laurentii處理可延緩果實細胞壁降解，細胞內部細胞器更加完整，細胞壁結構穩定，與果實硬度變化相一致。

實驗數據顯示，與CK組相比，CMCS-C.laurentii處理可顯著抑制不同貯藏時期內葡萄柚果實PE、PG、CX、α-L-Af和β-Gal等細胞壁降解酶的活性，有效減緩果膠和半纖維素等物質的降解，從而維持葡萄柚果實的硬度。這一結果與盧玉佳等[8]通過外源果糖處理杏果實的實驗結果一致，果糖處理能有效降低杏果實貯藏期間細胞壁代謝酶的活性，從而延緩果實軟化，更好地保持采后杏果實的硬度。另外，張琴等[6]通過外源草酸處理“蜂糖李”果實的實驗結果也發現，抑制果實細胞壁代謝酶的活性是延緩果實軟化的關鍵。

課題組前期研究發現，添加CMCS、羧甲基纖維素等外源多糖誘導培養羅倫隱球酵母能提高酵母的發酵速率、增殖速度和發酵產物（糖和有機酸）的積累，CMCS-C.laurentii處理相較單獨酵母處理，對柑橘果實貯藏期間質地品質的維持和抗病能力都要更優[21,30]。CMCS-C.laurentii處理能夠在果實表面形成多糖-酵母復合膜，抑制果實貯藏期間的水分散失和呼吸氧化[11]。多糖作為植物能量貯存和結構組成的主要物質，具有提供前體物質等功能，還作為信號分子涉及植物體內的代謝過程。外源果糖處理能有效抑制細胞壁水解酶活性，延緩杏果實軟化過程[8]。外源蔗糖處理蘆筍能通過調控基因來改變細胞壁成分，抑制果膠的降解，延緩蘆筍軟化衰老[31]。結合本實驗結果和實驗室前期研究結果可以推測，CMCS-C.laurentii中含有大量酵母發酵產物和CMCS，這些多糖類物質可以作為外源糖抑制果實細胞壁多糖的降解，從而達到抑制軟化的效果。

綜上，CMCS-C.laurentii處理可有效抑制葡萄柚果實內細胞壁降解酶（PG、PE、CX、α-L-Af和β-Gal）的活性，維持果實內CSP、24KSF的含量，降低果實內WSP、ISP以及4KSF的含量；結合細胞壁超微結構觀察發現，CMCS-C.laurentii處理可減緩采后葡萄柚果實細胞內部細胞器及細胞壁的降解，較好維持細胞完整性，延緩果實軟化。本研究結果為C.laurentii在葡萄柚果實采后貯藏保鮮領域的商業化應用提供了理論參考。