七葉皂苷鈉調控SIRT1/NF-κB 信號通路對帕金森病大鼠的神經保護作用 Δ

周慧敏，陳 靜，歐詒丹，王御林，鐘純正 （儋州市人民醫院神經內科，海南 儋州 571700）

帕金森病是由黑質多巴胺神經元丟失引起的神經退行性疾病，其主要特征包括震顫麻痹、認知異常、學習記憶能力下降[1]。α 突觸核蛋白（α-synuclein，α-Syn）的積累和小膠質細胞的過度激活是帕金森病發生的重要病理因素，神經炎癥反應是其關鍵環節[2]。沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）在炎癥、細胞代謝及凋亡等過程中發揮調節作用，并對減輕帕金森病病理改變具有積極作用[3]。SIRT1可減輕核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號激活引發的神經元損傷及神經炎癥，減少帕金森病模型動物多巴胺能神經元死亡[4―5]。由此本課題組推測，SIRT1/NF-κB信號通路可能是帕金森病治療的潛在靶點。

七葉皂苷鈉是一種腦血管擴張藥，具有清除自由基、消炎去腫、改善微循環、保護血管壁等藥理作用，可下調NF-κB蛋白及促炎因子的表達，減少腦缺血再灌注損傷大鼠的神經元凋亡[6]；臨床上，其可聯合氯吡格雷治療急性缺血性腦卒中以改善患者的神經功能[7]。基于現有證據，本課題組推測七葉皂苷鈉可能通過調控SIRT1/NF-κB信號通路發揮神經保護作用，故本研究以帕金森病大鼠為對象開展了相關實驗，旨在為七葉皂苷鈉的臨床應用及帕金森病的藥物治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

DW-2000D 型腦立體定位儀、NIB 400 型顯微鏡、DRW-200Bc型酶標儀、GelView 1500型凝膠成像系統均購自濟南慶元醫療器械有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

注射用七葉皂苷鈉（批號20220117，規格5 mg）購自山東綠葉制藥有限公司；EX527 原料藥（SIRT1 抑制劑，純度99.85%），多巴胺（dopamine，DA）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-18、IL-10 酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒和BCA 試劑盒（批號分別為KM29401、KM25041、KM12095、KM49530、KM30632、KM59200）均購自西安凱萌生物技術有限公司；6-羥基多巴胺對照品（純度≥98%）、阿撲嗎啡原料藥（純度≥99.45%）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、SP 免疫組織化學試劑盒、蛋白裂解液、ECL 試劑（批號分別為TM39171、TM20491、TM24905、TM25901、TM53950、TM43985）均購自云南淘謎生物科技有限公司；兔源酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、α-Syn 一抗，鼠源SIRT1、磷酸化NF-κB p65（phosphorylated NF-κB p65，p-NF-κB p65）、NF-κB p65、β-肌動蛋白（β-actin）一抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗、羊抗兔IgG二抗（批號分別 為 DN59101、DN53902、DN42950、DN17593、DN54920、DN58191、DN27581、DN28159）均購自西安迪諾生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠，10 周齡，體重339～351 g，購自武漢市萬千佳興生物科技有限公司，動物生產許可證號為SCXK（鄂）2021-0011。所有大鼠均飼養于溫度22～24 ℃、相對濕度50%～60%、光照周期12 h 的環境中，自由取食和飲水。本研究經本院倫理委員會批準，批準編號為儋醫2022LS038。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

參考文獻方法[8]建立帕金森病大鼠模型：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液（2 mL/kg）麻醉后，固定于腦立體定位儀上，剃毛消毒，暴露顱骨，并定位腦紋狀體（前囟后1 mm，中線左3 mm，硬膜下5 mm），用微量注射器于腦紋狀體內注入1 μg/μL 的6-羥基多巴胺溶液（用生理鹽水配制）8 μL，縫合。2 周后，腹腔注射0.5 mg/mL的阿撲嗎啡溶液（用生理鹽水配制）5 mg/kg 誘導旋轉，若大鼠30 min內轉圈超過210次則判定為帕金森病模型建立成功。將建模成功的48 只帕金森病大鼠按照隨機數表法分為模型組，七葉皂苷鈉低、高劑量組，七葉皂苷鈉+EX527組，每組12只。另取12只健康大鼠作為假手術組（手術過程同模型大鼠，用微量注射器于腦紋狀體內注入等體積生理鹽水）。

建模結束后，七葉皂苷鈉低、高劑量組大鼠分別腹腔注射七葉皂苷鈉1.8、3.6 mg/kg（將七葉皂苷鈉用生理鹽水溶解，分別得質量濃度為0.18、0.36 mg/mL 的混懸液，注射體積為10 mL/kg[9]）；七葉皂苷鈉+EX527組大鼠同時腹腔注射七葉皂苷鈉3.6 mg/kg 和EX527 5 mg/kg（將EX527用生理鹽水溶解，得質量濃度為0.5 mg/mL的混懸液，兩藥的注射體積均為10 mL/kg[10]）；假手術組和模型組大鼠腹腔注射生理鹽水10 mL/kg。各組大鼠每天注射1次，持續21 d。

2.2 大鼠運動功能檢測

末次給藥結束24 h后，各組大鼠腹腔注射阿撲嗎啡5 mg/kg 誘導旋轉，并于10 min 后記錄其在30 min 內的旋轉圈數，用以評估大鼠的運動功能[11]。

2.3 大鼠認知功能檢測

旋轉實驗結束后，采用Morris水迷宮實驗檢測各組大鼠的認知功能：往直徑2 m 的水池（平分4 個象限）中注水，注水高度為30 cm。在第1 象限放入平臺并沒入水面下2 cm。將各組大鼠自每個象限正中面壁放下，訓練其找到平臺；5 d后撤去平臺，將各組大鼠再次自每個象限正中面壁放下，記錄其找到平臺所用時間（即逃避潛伏期）及在目標象限（即第1象限）停留時間。

2.4 樣品采集及大鼠黑質區、海馬組織CA1 區神經元形態檢測

認知功能檢測實驗結束后，各組大鼠吸入乙醚麻醉，于頸主動脈采血3 mL，以3 400 r/min離心14 min后，分離上層血清，于－80 ℃下保存，備用。將大鼠斷頭處死，分離每組6只大鼠的黑質紋狀體適量并分成2份，其中一份剪碎后研磨，所得勻漿以6 000 r/min離心21 min后，吸取上清液，于－80 ℃下保存，備用；另一份經液氮速凍后，再于－80 ℃下保存，備用。

分離每組剩余6 只大鼠的黑質區和海馬組織CA1區，經清洗后進行常規固定、脫水、石蠟包埋、切片；每組隨機選擇黑質區和海馬組織CA1 區切片各3 張，水化后，按HE 染色試劑盒說明書步驟染色后，常規脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察黑質區和海馬組織CA1 區的神經元形態。

2.5 大鼠黑質紋狀體中DA含量及黑質區TH、α-Syn蛋白表達水平檢測

取“2.4”項下各組大鼠的黑質紋狀體勻漿上清液樣品，解凍后，按ELISA試劑盒說明書方法操作，使用酶標儀檢測其中DA 含量；取“2.4”項下各組大鼠黑質區切片，水化后，加入TH、α-Syn一抗（稀釋比例均為1∶150），按SP免疫組織化學試劑盒說明書方法進行免疫組織化學染色后，常規脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察TH、α-Syn蛋白著色情況，以Image J軟件分析兩者陽性細胞（呈棕色或深棕色）的光密度，用以表示各組大鼠黑質區TH、α-Syn 蛋白的表達水平，結果以假手術組為標準進行歸一化處理。

2.6 大鼠血清中炎癥因子水平檢測

取“2.4”項下各組大鼠的血清樣品，解凍后，按ELISA試劑盒說明書方法操作，以酶標儀檢測血清中促炎因子IL-6、IL-18及抗炎因子IL-10水平。

2.7 大鼠黑質紋狀體中SIRT1/NF-κB信號通路相關蛋白表達水平檢測

取“2.4”項下各組大鼠凍存的黑質紋狀體樣品，研碎后，以蛋白裂解液裂解，采用BCA 法測定其總蛋白濃度。取各組大鼠蛋白樣品適量，經加熱變性、電泳分離后轉膜，以脫脂奶封閉1 h；洗膜后，加入SIRT1、p-NFκB p65、NF-κB p65、β-actin一抗（稀釋比例分別為1∶1 100、1∶1 200、1∶1 200、1∶1 500），4 °C下孵育過夜；洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例均為1∶2 200），室溫下孵育2 h；以ECL試劑顯影后，于凝膠成像系統下成像。以β-actin為內參，采用Image J 軟件分析各組大鼠黑質紋狀體中SIRT1、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白的相對表達量，再以p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白的相對表達量之比（p-NF-κB p65/NF-κB p65）表示NF-κB p65 蛋白磷酸化水平。

2.8 統計學方法

使用SPSS 26.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 大鼠運動和認知功能的檢測結果

與假手術組比較，模型組大鼠旋轉圈數、逃避潛伏期均顯著增加或延長，目標象限停留時間顯著縮短（P＜0.05）；與模型組比較，七葉皂苷鈉低、高劑量組大鼠旋轉圈數、逃避潛伏期均顯著減少或縮短，目標象限停留時間均顯著延長，且高劑量組的變化較低劑量組明顯（P＜0.05）；與七葉皂苷鈉高劑量組比較，七葉皂苷鈉+EX527組大鼠旋轉圈數、逃避潛伏期均顯著增加或延長，目標象限停留時間顯著縮短（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠旋轉圈數、逃避潛伏期、目標象限停留時間的比較（±s，n＝12）

表1 各組大鼠旋轉圈數、逃避潛伏期、目標象限停留時間的比較（±s，n＝12）

a：與假手術組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與七葉皂苷鈉低劑量組比較，P＜0.05；d：與七葉皂苷鈉高劑量組比較，P＜0.05。

組別假手術組模型組七葉皂苷鈉低劑量組七葉皂苷鈉高劑量組七葉皂苷鈉+EX527組旋轉圈數0 252.75±34.25a 152.08±20.92b 73.58±0.42bc 248.83±32.17d逃避潛伏期/s 12.08±2.92 57.67±6.33a 42.58±5.42b 28.92±5.08bc 56.75±7.25d目標象限停留時間/s 42.92±4.08 15.75±1.75a 24.75±2.25b 34.08±4.92bc 16.07±1.83d

3.2 大鼠黑質區和海馬組織CA1區神經元形態的檢測結果

假手術組大鼠黑質區和海馬組織CA1 區神經元排列規整且形態結構完整；模型組大鼠黑質區和海馬組織CA1 區神經元損傷嚴重，細胞膜皺縮，細胞核發生不規則形變且染色質固縮，細胞排列散亂且體積明顯縮小，神經元數量明顯變少；相較于模型組，七葉皂苷鈉低、高劑量組大鼠黑質區和海馬組織CA1 區神經元的損傷程度均減輕；相較于七葉皂苷鈉高劑量組，七葉皂苷鈉+EX527 組大鼠黑質區和海馬組織CA1 區神經元損傷嚴重。結果見圖1、圖2。

黑色箭頭：典型的損傷神經元。圖1 各組大鼠黑質區神經元形態的顯微圖（HE染色）

3.3 大鼠黑質紋狀體中DA含量及黑質區TH、α-Syn蛋白表達水平的檢測結果

與假手術組比較，模型組大鼠黑質紋狀體中DA 含量及黑質區TH蛋白表達水平均顯著降低，黑質區α-Syn蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，七葉皂苷鈉低、高劑量組大鼠黑質紋狀體中DA 含量及黑質區TH 蛋白表達水平均顯著升高，黑質區α-Syn 蛋白表達水平均顯著降低，且高劑量組的變化較低劑量組明顯（P＜0.05）；與七葉皂苷鈉高劑量組比較，七葉皂苷鈉+EX527 組大鼠黑質紋狀體中DA 含量及黑質區TH 蛋白表達水平均顯著降低，黑質區α-Syn蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。結果見表2、圖3、圖4。

黑色箭頭：TH陽性細胞。圖3 各組大鼠黑質區TH蛋白表達的顯微圖（免疫組織化學染色）

表2 各組大鼠黑質紋狀體中DA 含量及黑質區TH、α-Syn蛋白表達水平的比較（±s，n＝6）

表2 各組大鼠黑質紋狀體中DA 含量及黑質區TH、α-Syn蛋白表達水平的比較（±s，n＝6）

a：與假手術組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與七葉皂苷鈉低劑量組比較，P＜0.05；d：與七葉皂苷鈉高劑量組比較，P＜0.05。

組別假手術組模型組七葉皂苷鈉低劑量組七葉皂苷鈉高劑量組七葉皂苷鈉+EX527組DA含量/（μg/g）52.48±11.21 9.76±1.83a 24.25±7.04b 34.43±9.09bc 10.07±1.95d TH蛋白表達水平1 0.44±0.04a 0.65±0.06b 0.85±0.11bc 0.47±0.08d α-Syn蛋白表達水平1 2.39±0.24a 1.78±0.15b 1.28±0.13bc 2.41±0.22d

3.4 大鼠血清中炎癥因子水平的檢測結果

與假手術組比較，模型組大鼠血清中促炎因子IL-6、IL-18 水平均顯著升高，抗炎因子IL-10 水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，七葉皂苷鈉低、高劑量組大鼠血清中促炎因子IL-6、IL-18 水平均顯著降低，抗炎因子IL-10 水平均顯著升高，且高劑量組的變化較低劑量組明顯（P＜0.05）；與七葉皂苷鈉高劑量組比較，七葉皂苷鈉+EX527 組大鼠血清中促炎因子IL-6、IL-18 水平均顯著升高，抗炎因子IL-10水平顯著降低（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-6、IL-18、IL-10 水平的比較（±s，n＝12，pg/mL）

表3 各組大鼠血清中IL-6、IL-18、IL-10 水平的比較（±s，n＝12，pg/mL）

組別假手術組模型組七葉皂苷鈉低劑量組七葉皂苷鈉高劑量組七葉皂苷鈉+EX527組IL-6 21.98±6.43 48.41±10.75a 37.89±8.74b 28.23±7.81bc 47.73±11.02d IL-18 15.62±4.14 75.17±9.32a 52.94±7.53b 31.85±4.97bc 72.73±10.28d IL-10 77.86±14.74 40.74±12.25a 52.95±12.51b 65.83±14.93bc 42.12±12.36d

a：與假手術組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與七葉皂苷鈉低劑量組比較，P＜0.05；d：與七葉皂苷鈉高劑量組比較，P＜0.05。

3.5 大鼠黑質紋狀體中SIRT1/NF-κB信號通路相關蛋白表達水平的檢測結果

與假手術組比較，模型組大鼠黑質紋狀體中SIRT1蛋白表達水平顯著降低，p-NF-κB p65/NF-κB p65 顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，七葉皂苷鈉低、高劑量組大鼠黑質紋狀體中SIRT1蛋白表達水平均顯著升高，p-NF-κB p65/NF-κB p65 均顯著降低，且高劑量組的變化較低劑量組明顯（P＜0.05）；與七葉皂苷鈉高劑量組比較，七葉皂苷鈉+EX527 組大鼠黑質紋狀體中SIRT1蛋白表達水平顯著降低，p-NF-κB p65/NF-κB p65 顯著升高（P＜0.05）。結果見圖5、表4。

Ⅰ：假手術組；Ⅱ：模型組；Ⅲ：七葉皂苷鈉低劑量組；Ⅳ：七葉皂苷鈉高劑量組；Ⅴ：七葉皂苷鈉+EX527組。圖5 各組大鼠黑質紋狀體中SIRT1、p-NF-κB p65、NFκB p65蛋白表達電泳圖

表4 各組大鼠黑質紋狀體中SIRT1/NF-κB 信號通路相關蛋白表達水平的比較（±s，n＝6）

表4 各組大鼠黑質紋狀體中SIRT1/NF-κB 信號通路相關蛋白表達水平的比較（±s，n＝6）

a：與假手術組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與七葉皂苷鈉低劑量組比較，P＜0.05；d：與七葉皂苷鈉高劑量組比較，P＜0.05。

組別假手術組模型組七葉皂苷鈉低劑量組七葉皂苷鈉高劑量組七葉皂苷鈉+EX527組SIRT1/β-actin 1.27±0.24 0.42±0.08a 0.68±0.09b 1.12±0.21bc 0.44±0.05d p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.19±0.04 0.97±0.12a 0.44±0.07b 0.27±0.05bc 0.95±0.17d

4 討論

帕金森病不僅極大影響了患者的身心健康，還給其家庭帶來了沉重的負擔，故探究帕金森病的發生機制，尋找有效的防治手段具有重要意義。研究發現，膠質細胞激活、免疫細胞浸潤、α-Syn積累和神經炎癥是帕金森病發生及患者病情進展的重要病理因素，抑制α-Syn積累、調控免疫反應、阻止炎癥信號激活是防治帕金森病的潛在策略[12]。本研究采用6-羥基多巴胺注射法構建了帕金森病大鼠模型，結果顯示，模型組大鼠黑質區和海馬組織CA1 區神經元損傷嚴重，細胞膜皺縮，細胞核發生不規則形變且染色質固縮，細胞排列散亂且體積明顯縮小，神經元數量明顯減少，黑質區α-Syn蛋白表達水平和血清中促炎因子IL-6、IL-18 水平均顯著升高，黑質紋狀體中DA含量、黑質區TH蛋白表達水平和血清中抗炎因子IL-10 水平均顯著降低，提示模型組大鼠出現了神經炎癥反應，可能與其黑質紋狀體中DA 含量及黑質區TH蛋白表達降低，進而促使α-Syn蛋白大量生成并在黑質區集聚，造成大腦黑質區及海馬組織CA1區神經元大量丟失有關。運動及認知功能檢測結果顯示，模型組大鼠旋轉圈數、逃避潛伏期均顯著增加或延長，目標象限停留時間顯著縮短，提示帕金森病大鼠運動及認知功能受損。

七葉皂苷鈉是具有明顯抗炎功效的天然皂苷類成分，可通過抑制神經元凋亡來減輕蛛網膜下腔出血小鼠的腦損傷[13]；可通過減少腦組織中促炎因子釋放來減輕局灶性腦缺血再灌注大鼠的神經元凋亡，從而顯著改善其神經功能缺損[14]。本研究以不同劑量七葉皂苷鈉干預帕金森病大鼠，結果顯示，七葉皂苷鈉可顯著降低帕金森病大鼠血清中促炎因子IL-6、IL-18 水平，升高抗炎因子IL-10 水平，表明該成分可減輕帕金森病大鼠神經炎癥，且高劑量七葉皂苷鈉的作用較低劑量更強。另外本研究結果還顯示，七葉皂苷鈉可減輕帕金森病大鼠黑質區和海馬組織CA1區神經元的病理損傷，減少或縮短其旋轉圈數、逃避潛伏期、黑質區α-Syn蛋白表達水平，顯著延長或升高目標象限停留時間、黑質紋狀體中DA含量、黑質區TH蛋白表達水平，表明該成分可改善帕金森病大鼠的運動及認知功能障礙，具有明顯的神經保護作用，且高劑量七葉皂苷鈉的作用更強，初步揭示了七葉皂苷鈉在帕金森病臨床治療中的應用潛力。

SIRT1/NF-κB 信號通路可通過調控神經炎癥來介導腦出血、帕金森病的發生和進展，促進SIRT1 蛋白表達可抑制NF-κB信號激活及其p65亞單位的磷酸化，阻礙促炎因子的釋放，減輕神經炎癥反應，從而緩解腦出血引發的腦損傷；同時，促進SIRT1 蛋白表達還可促進黑質區TH 蛋白的表達，維持多巴胺能神經元的完整性和功能的正常性，對帕金森病大鼠運動功能異常有改善作用[15]。本研究結果顯示，七葉皂苷鈉可使帕金森病大鼠黑質紋狀體中p-NF-κB p65/NF-κB p65 顯著降低，SIRT1 蛋白表達水平顯著升高，且高劑量七葉皂苷鈉的作用更強，提示七葉皂苷鈉的神經保護作用可能與調控SIRT1/NF-κB 信號通路有關。本研究在七葉皂苷鈉高劑量的基礎上，加用了SIRT1 抑制劑EX527，結果顯示，EX527 可逆轉高劑量七葉皂苷鈉對帕金森病大鼠上述指標的改善作用，表明七葉皂苷鈉可通過上調SIRT1蛋白表達來抑制NF-κB信號激活，從而減輕帕金森病大鼠的神經炎癥反應，最終發揮神經保護作用。

綜上所述，七葉皂苷鈉可通過上調SIRT1蛋白表達來抑制NF-κB信號激活，從而抑制帕金森病大鼠的神經炎癥，改善其運動及認知功能，最終起到神經保護作用。本研究為帕金森病提供了新的潛在治療藥物，對其臨床治療方法的改善及發展具有一定的參考價值，但七葉皂苷鈉能否通過其他信號通路發揮對帕金森病大鼠的神經保護作用，有待后續研究。