三七總皂苷對肛瘺術后大鼠創面愈合的影響及機制 Δ

王鑫民 ，劉亞坤 ，李 剛 ，劉 娟 ，徐會志 ，張靖杰 ，李民路 ，牛靜亞 ，張丙貴 ， （1.河北中醫藥大學研究生學院，石家莊 0000；.河北省第八人民醫院普外肛腸科，石家莊 000；.石家莊市中醫院肛腸科，石家莊 00011；.石家莊市藁城人民醫院普外肝膽科，石家莊 0160；.河北中醫藥大學中西醫結合臨床學院，石家莊 0000）

肛瘺可引發患者肛周疼痛、瘙癢、流膿等，難以治愈且復發率較高。目前，手術是肛瘺臨床治療的主要手段，但由于其是開放式操作，創面易被糞便污染而導致愈合困難，給患者造成極大的痛苦和生活上的不便，因此促使肛瘺患者術后創面盡快愈合非常重要。研究指出，影響肛瘺術后創面愈合的關鍵是改善創面血液運行和炎癥反應，促進血管形成并抑制炎癥可有效促使創面血液循環和表皮修復，加快肛瘺患者術后創面愈合速度[1―2]。缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）作為一種炎癥調控因子，可通過調控血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR2）信號通路來調節炎癥發生和血管形成過程，在創面愈合中發揮重要作用；此外，HIF-1α/VEGF/VEGFR2 信號通路受阻可導致糖尿病患者創面愈合延遲，而激活該信號通路則可通過發揮促血管生成、抗菌、抗氧化和抗炎等作用來加快糖尿病模型動物皮膚創面愈合[3―4]。由此本課題組推測，激活HIF-1α/VEGF/VEGFR2信號通路可能是改善肛瘺患者術后創面愈合的重要途徑。

三七總皂苷（Panax notoginsengsaponins，PNS）是中藥三七的主要活性成分，具有良好的抗炎作用，可促進成纖維細胞增殖和血管生成，提升人臍靜脈內皮細胞活力和成管能力，并可通過減少炎癥細胞浸潤、促炎因子釋放和促進新表皮形成來加快糖尿病性皮膚潰瘍模型動物的創面愈合[5―6]。考慮到HIF-1α是三七皂苷的潛在作用靶點之一[7]，本研究擬構建肛瘺術后大鼠模型，以PNS 和HIF-1α 抑制劑2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）為干預物，探究PNS對模型大鼠創面愈合的影響，并基于HIF-1α/VEGF/VEGFR2信號通路探討其潛在機制，旨在為尋找促進肛瘺患者術后創面愈合的新方法提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本文所用主要儀器包括SP-Max2300A2型全自動酶標儀（上海酶聯生物科技有限公司），AST560-580 型冷凍切片機（常州市郝思琳醫用儀器有限公司），HG13-XSP-BM-1C 型生物顯微鏡（北京北信創展自動化技術有限公司），TE62型全濕電轉印儀、EPS1001型電泳儀電源、SE400 型垂直電泳儀、LAS600 型凝膠成像分析系統（美國Amersham Pharmacia GE公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

PNS（即血塞通注射液，批號86905729000952，規格2 mL∶100 mg）購自云南植物藥業有限公司；2ME2 對照品（批號HB1684026，純度＞98%）購自上海惠誠生物科技有限公司；大鼠VEGF、血管生成素Ⅰ（angiopoietin-Ⅰ，Ang-Ⅰ）、Ang-Ⅱ、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-2 酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均購自上海研尊生物科技有限公司；兔源CD31、纖維連接蛋白（fibronectin，FN）、VEGF、VEGFR2、HIF-1α、膠原蛋白Ⅰ（collagen Ⅰ）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗和辣根過氧化物酶標記的小鼠抗兔IgG 二抗（批號分別為77699、44800、50661、9698、14179、91144、2118、5127）均購自美國CST公司；通用SP免疫組織化學試劑盒（批號SP0041）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗菌株和動物

大腸埃希菌[編號CMCC（B）44102]購自南京便診生物科技有限公司。SPF 級健康SD 大鼠，雄性，體重200～240 g，購自河北省實驗動物中心[動物生產許可證號SCXK（冀）2021-002]。所有大鼠均飼養于標準動物飼養籠內（每籠不超過5只），飼養條件如下：屏障環境，溫度21～25 ℃，相對濕度50%～60%，每12 h明暗交替。本研究方案經河北省第八人民醫院醫學倫理委員會批準，編號為（2021）科倫審第（24）號。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

參照文獻方法[8]建立大鼠肛瘺術后模型：取SD 大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，去除背部毛發并消毒備皮，剪一直徑為1 cm 的圓形創面，止血后滴加3×108cfu/mL的大腸埃希菌菌液（以無菌生理鹽水制備）0.1 mL，縫合創面；48 h后，拆除縫線，若創面有膿性分泌物即為造模成功。將造模成功的大鼠分為模型組、PNS低劑量組、PNS高劑量組、PNS高劑量+2ME2組，每組10只；另選10只正常SD大鼠，僅進行背部脫毛處理，作為對照組。PNS低、高劑量組大鼠分別于創面組織處肌內注射15、30 mg/cm2的PNS（取血塞通注射液，以生理鹽水稀釋，制成25、50 mg/mL的藥液，注射量均為0.6 mL/cm2，下同）[6]，同時腹腔注射10 mL/kg 的生理鹽水；PNS 高劑量+2ME2 組大鼠于創面組織處肌內注射30 mg/cm2的PNS，同時腹腔注射4 mg/kg 的2ME2（取2ME2，以生理鹽水稀釋，制成0.4 mg/mL的藥液，注射量為10 mL/kg）[7]；模型組、對照組大鼠于創面（或脫毛處）組織處肌內注射0.6 mL/cm2的生理鹽水，同時腹腔注射10 mL/kg 的生理鹽水。各組大鼠均于每天早上8：00－9：00給藥1次，持續3周。

2.2 大鼠創面愈合率檢測與標本采集

分別于造模成功時和末次給藥結束24 h 時觀察各組大鼠（除對照組外）的創面并拍照，使用Image J 軟件進行定量后再按下式計算創面愈合率：創面愈合率＝末次給藥結束24 h 時大鼠創面面積/造模成功時大鼠創面面積×100%。

采集各組大鼠尾靜脈血，于4 ℃下以500×g離心10 min，收集血清，于－20 ℃下保存，備用。隨后，大鼠經麻醉后斷頸處死，剪下其創面組織（對照組大鼠剪下背部脫毛處的皮膚組織，下同），其中一部分凍存于液氮中，備用；剩余部分經包埋后以液氮迅速冷凍，取出后切片，備用。

2.3 大鼠創面組織的微血管密度和collagen Ⅰ、FN 表達檢測

采用免疫組織化學法檢測。取“2.2”項下各組大鼠的創面組織切片，于預冷丙酮中固定10 min；取出，用水漂洗后以3%過氧化氫孵育5 min；加入CD31、collagen Ⅰ、FN一抗（稀釋比例分別為1∶200、1∶100、1∶150），于4 ℃下孵育13 h；經DAB 染色后，用水漂洗，封片，使用顯微鏡觀察并拍攝。使用Image J軟件定量分析創面組織中微血管[以單個CD31 陽性表達細胞（呈棕色或深棕色，下同）或多個CD31 陽性表達細胞聚成的細胞簇為1 個微血管]數量和視野切片面積，按下式計算微血管密度（microvascular density，MVD）：MVD＝微血管數量/視野切片面積；同時，使用Image J軟件定量分析創面組織中collagen Ⅰ、FN陽性表達細胞（呈棕色或深棕色）的光密度值，用以表示兩者的表達水平。

2.4 大鼠血清中血管生成相關因子、血清及創面組織中炎癥因子水平檢測

采用ELISA 法檢測。取“2.2”項下各組大鼠凍存的創面組織適量，剪碎，與RIPA 裂解液混合后，于冰水浴中高速研磨；所得勻漿液于4 ℃下以500×g離心10 min，收集上清液，以BCA 法測定蛋白濃度后，使用ELISA 法以酶標儀測定創面組織中炎癥因子（IL-6、IL-2）水平。取“2.2”項下各組大鼠的血清樣品，使用ELISA法以酶標儀測定血清中血管生成相關因子（VEGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ）和炎癥因子（IL-6、IL-2）水平。上述檢測均嚴格按照相應試劑盒說明書進行。

2.5 大鼠創面組織中HIF-1α/VEGF/VEGFR2 信號通路相關蛋白表達檢測

采用Western blot法檢測。取“2.4”項下各組大鼠剩余的創面組織適量，同法勻漿、離心、定量。取變性（沸水浴處理）蛋白適量，經電泳分離后以濕法轉膜，用5%脫脂奶粉封閉2.5 h；加入HIF-1α、VEGF、VEGFR2、GAPDH一抗（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶2 000、1∶2 500、1∶1 000），于搖床上孵育3 h（4 ℃）；洗膜3 次后，加入相應二抗（稀釋比例均為1∶1 000），在搖床上孵育2 h（室溫）；洗膜3次后，以化學發光法顯色，并使用凝膠成像分析系統成像。以Image J軟件定量分析各目的蛋白的條帶灰度值，按下式計算其相對表達量：目的蛋白相對表達量＝目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白（GAPDH）條帶灰度值。

2.6 統計學方法

使用GraphPad Prism 8.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 PNS對大鼠創面愈合率的影響

PNS低、高劑量組大鼠創面愈合率均較模型組顯著升高（P＜0.05），且PNS 高劑量組顯著高于低劑量組（P＜0.05）；PNS 高劑量+2ME2 組大鼠創面愈合率較PNS高劑量組顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠創面愈合率、MVD比較（±s，n＝10）

表1 各組大鼠創面愈合率、MVD比較（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與PNS低劑量組比較，P＜0.05；d：與PNS高劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組PNS低劑量組PNS高劑量組PNS高劑量+2ME2組創面愈合率/%－43.01±4.30 65.83±5.17b 83.92±5.84bc 46.13±4.52d MVD/（個/mm2）3.46±0.58 5.10±0.73a 9.21±0.92b 13.95±1.04bc 5.36±0.97d

3.2 PNS對大鼠創面組織MVD和collagen Ⅰ、FN表達的影響

模型組大鼠創面組織中微血管明顯，MVD 較對照組顯著升高（P＜0.05）；PNS 低、高劑量組大鼠創面組織中微血管明顯增加，MVD 均較模型組顯著升高（P＜0.05），且PNS 高劑量組顯著高于低劑量組（P＜0.05）；PNS 高劑量+2ME2 組大鼠創面組織MVD 較PNS 高劑量組顯著降低（P＜0.05）。結果見表1、圖1。

紅色箭頭：CD31陽性表達細胞或細胞簇。圖1 各組大鼠創面組織中微血管的顯微圖（免疫組織化學法）

模型組大鼠創面組織中collagen Ⅰ、FN陽性表達細胞增加，兩者表達水平均較對照組顯著升高（P＜0.05）；PNS 低、高劑量組大鼠創面組織中collagen Ⅰ、FN 陽性表達細胞均有所增加，兩者表達水平均較模型組顯著升高（P＜0.05），且PNS 高劑量組顯著高于低劑量組（P＜0.05）；PNS 高劑量+2ME2 組大鼠創面組織中collagenⅠ、FN陽性細胞均有所減少，兩者表達水平均較PNS高劑量組顯著降低（P＜0.05）。結果見圖2、表2。

紅色箭頭：collagen Ⅰ或FN陽性表達細胞。圖2 各組大鼠創面組織中collagen Ⅰ、FN表達的顯微圖（免疫組織化學法）

表2 各組大鼠創面組織中collagen Ⅰ、FN表達水平比較（±s，n＝10）

表2 各組大鼠創面組織中collagen Ⅰ、FN表達水平比較（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與PNS低劑量組比較，P＜0.05；d：與PNS高劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組PNS低劑量組PNS高劑量組PNS高劑量+2ME2組collagen Ⅰ6.02±0.75 7.81±0.81a 10.75±0.96b 13.49±0.97bc 8.22±0.81d FN 6.43±0.67 8.02±0.74a 10.98±0.83b 13.43±0.92bc 8.59±0.79d

3.3 PNS對大鼠血清中血管生成相關因子水平的影響

模型組大鼠血清中VEGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ水平均較對照組顯著降低（P＜0.05）；PNS 低、高劑量組大鼠血清中VEGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ水平均較模型組顯著升高（P＜0.05），且PNS 高劑量組顯著高于低劑量組（P＜0.05）；PNS高劑量+2ME2組大鼠血清中VEGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ水平均較PNS高劑量組顯著降低（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠血清中血管生成相關因子水平比較（±s，n＝10）

表3 各組大鼠血清中血管生成相關因子水平比較（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與PNS低劑量組比較，P＜0.05；d：與PNS高劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組PNS低劑量組PNS高劑量組PNS高劑量+2ME2組VEGF/（pg/mL）206.32±24.16 82.45±15.73a 140.38±17.32b 198.76±20.60bc 90.14±16.02d Ang-Ⅰ/（ng/mL）11.31±1.72 3.46±0.64a 7.05±0.76b 11.03±1.35bc 3.69±0.68d Ang-Ⅱ/（ng/L）1.29±0.20 0.51±0.11a 0.82±0.12b 1.21±0.14bc 0.56±0.10d

3.4 PNS對大鼠血清及創面組織中炎癥因子水平的影響

模型組大鼠血清及創面組織中IL-6、IL-2 水平均較對照組顯著升高（P＜0.05）；PNS 低、高劑量組大鼠血清及創面組織中IL-6、IL-2水平均較模型組顯著降低（P＜0.05），且PNS 高劑量組顯著低于低劑量組（P＜0.05）；PNS 高劑量+2ME2 組大鼠血清及創面組織中IL-6、IL-2水平均較PNS 高劑量組顯著升高（P＜0.05）。結果見表4。

表4 各組大鼠血清及創面組織中炎癥因子水平比較（±s，n＝10）

表4 各組大鼠血清及創面組織中炎癥因子水平比較（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與PNS低劑量組比較，P＜0.05；d：與PNS高劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組PNS低劑量組PNS高劑量組PNS高劑量+2ME2組血清IL-6/（pg/mL）22.46±6.54 84.73±13.20a 55.98±9.32b 25.76±7.61bc 80.15±10.61d IL-2/（pg/mL）76.59±15.53 168.43±22.21a 123.12±18.13b 81.75±16.40bc 161.94±20.12d創面組織IL-6/（ng/g）35.12±8.22 117.34±15.62a 78.15±12.20b 39.81±9.84bc 109.67±13.22d IL-2/（ng/g）118.23±13.25 213.39±21.63a 168.12±17.06b 124.78±15.31bc 206.24±18.67d

3.5 PNS 對大鼠創面組織中HIF-1α/VEGF/VEGFR2信號通路相關蛋白表達的影響

模型組大鼠創面組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白的表達水平雖較對照組稍有升高但差異均無統計學意義（P＞0.05）；PNS低、高劑量組大鼠創面組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白的表達水平均較模型組顯著升高（P＜0.05），且PNS 高劑量組顯著高于低劑量組（P＜0.05）；PNS 高劑量+2ME2 組大鼠創面組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 蛋白的表達水平均較PNS 高劑量組顯著降低（P＜0.05）。結果見圖3。

Ⅰ：對照組；Ⅱ：模型組；Ⅲ：PNS低劑量組；Ⅳ：PNS高劑量組；Ⅴ：PNS高劑量+2ME2組；a：與模型組比較，P＜0.05；b：與PNS低劑量組比較，P＜0.05；c：與PNS高劑量組比較，P＜0.05。圖3 各組大鼠創面組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白的表達水平比較

4 討論

隨著醫學技術的發展，促進肛瘺患者術后創面愈合的手段已呈多樣化，但部分患者的愈合效果仍然不佳，故尚需探尋更有效的創面愈合手段。血管形成和炎癥反應是影響患者術后創面愈合的關鍵，增強血管形成能力、減少創面組織炎癥刺激可有效促進皮膚發育修復，從而促使創面愈合[9―10]。PNS是可減少創面瘢痕形成并加速其愈合的候選藥物之一，可抑制成纖維細胞增殖，從而對小鼠皮膚創面愈合發揮有益作用；同時，PNS 也具有一定的抗炎、抗氧化作用[11―12]，可通過促進內皮細胞增殖、侵襲、遷移和血管生成來促進高血糖大鼠的創面愈合[13]。可見，PNS 可能是促使肛瘺患者術后創面愈合的潛在藥物。本研究通過大腸埃希菌液感染大鼠背部皮膚創面的方法構建肛瘺術后大鼠模型，結果顯示，模型大鼠創面愈合率為（43.01±4.30）%，創面組織MVD和collagen Ⅰ、FN 陽性表達水平均較對照組顯著升高，提示大鼠創面有部分愈合，表明大鼠肛瘺術后創面不做處理也可自然愈合，但愈合不完全；同時，模型大鼠血清及創面組織中促炎因子IL-6、IL-2 水平均較對照組顯著升高，同時血清中血管生成相關因子VEGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ水平均較對照組顯著降低，表明大鼠肛瘺術后炎癥水平升高且促血管生成相關因子表達水平降低，推測這可能是創面愈合不完全的主要原因。肛瘺術后大鼠經PNS干預后，其血清及創面組織中促炎因子IL-6、IL-2水平均較模型組顯著降低，血清中血管生成相關因子VEGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ水平均較模型組顯著升高，表明PNS 可在減少促炎因子生成的同時促進血管生成相關因子產生，進而抑制肛瘺術后大鼠炎癥反應；同時，PNS還可提升肛瘺術后大鼠的創面愈合率、創面組織MVD和collagen Ⅰ、FN 陽性表達水平，表明該成分可增強肛瘺術后大鼠創面膠原合成和血管生成，進而促進其創面愈合。

HIF-1α/VEGF/VEGFR2 信號通路在細胞凋亡和遷移、炎癥反應發生、血管形成、血液循環等方面有著廣泛的調節作用，上調HIF-1α、VEGF 的表達水平可起到促血管生成和抗炎的作用，進而減輕心肌缺血再灌注小鼠心肌炎癥損傷和心功能障礙[14]，激活HIF-1α/VEGF/VEGFR2 信號通路可通過下調炎癥因子、減弱氧化應激、促進血管生成、誘導再上皮化和抑制瘢痕形成來促進糖尿病性創面愈合[3―4，15]。本研究結果顯示，PNS可升高肛瘺術后大鼠創面組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白的表達水平，表明HIF-1α/VEGF/VEGFR2信號通路可能參與了PNS 促進創面愈合的過程；而PNS 聯合2ME2可升高肛瘺術后大鼠血清及創面組織中促炎因子IL-6、IL-2 水平，降低血清中血管生成相關因子VEGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ水平，表明2ME2 可減弱PNS 對大鼠促炎因子生成的抑制作用及對血管生成相關因子產生的促進作用；另外，PNS聯合2ME2可降低肛瘺術后大鼠創面愈合率，創面組織MVD和collagen Ⅰ、FN陽性表達水平以及HIF-1α、VEGF、VEGFR2 蛋白表達水平，表明2ME2可削弱PNS 對HIF-1α/VEGF/VEGFR2 信號通路的激活作用，減弱其對大鼠創面膠原合成和血管生成的增強作用，進而逆轉PNS 對肛瘺術后大鼠創面愈合的促進作用，揭示了PNS促進大鼠肛瘺術后創面愈合是通過激活HIF-1α/VEGF/VEGFR2信號通路實現的。

綜上所述，PNS可促進血管生成相關因子產生并抑制促炎因子生成，從而促進肛瘺術后大鼠創面愈合，上述作用與激活HIF-1α/VEGF/VEGFR2 信號通路有關。但PNS 的上述作用是否涉及其他信號通路尚有待后續深入探討。