黃芪多糖對腹膜透析大鼠腹膜纖維化和血管生成的影響及機(jī)制 Δ

馮 雪，彭 斌，馮 立，朱雙益，胡 溪，熊 瑋，高 智 （武漢市中醫(yī)醫(yī)院腎病科，武漢 430014）

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）常用于終末期腎病的治療，全球有11%～15%的終末期腎病患者接受PD治療，在中國接受PD的人群也在逐年增多[1]。PD的前提是腹膜功能具有完整性，但是隨著PD 治療時間的延長，非生理性透析液長期使用，使得患者腹膜通透性隨之增加，腹膜超濾功能隨之衰竭，最終導(dǎo)致PD治療失敗。其中超濾功能衰竭是終末期腎病患者PD治療失敗的主要原因，而腹膜纖維化及腹膜血管新生在其發(fā)生過程中起著重要作用[2]。低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路參與器官組織纖維化及血管生成進(jìn)程，抑制HIF-1α/VEGF信號通路可以抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，從而抑制腎臟纖維化[3]。由此推測，HIF-1α/VEGF信號通路也可能參與腹膜纖維化進(jìn)程。

黃芪多糖（Astragaluspolysaccharide，APS）是黃芪的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等作用，可以減輕大鼠腎組織的炎癥反應(yīng)，改善腎組織纖維化程度[4]，但其具體機(jī)制尚不明確。有研究顯示，APS 可通過抑制HIF-1α、VEGF表達(dá)，減少肺小動脈膠原纖維沉積面積，改善低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓小鼠肺血管重構(gòu)[5]。基于此，本研究考察了APS對PD大鼠腹膜纖維化和血管生成的影響，并基于HIF-1α/VEGF 信號通路研究其作用機(jī)制，以期為PD的治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所使用的主要儀器包括TBA-2000FR 型全自動生化分析儀（日本Toshiba 公司）、BX51 型顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

APS對照品（批號R014309-100g，純度70%）購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；HIF-1α激動劑二甲基乙二酰氨基乙酸（DMOG，貨號HY-15893，純度99.77%）購自美國MCE公司；PD液（含2.5%葡萄糖）購自廣州百特醫(yī)療用品有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號20200115）購自北京索萊寶科技有限公司；血清肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒（批號分別為YS04392B、YS06475B）均購自上海雅吉生物科技有限公司；Masson 試劑盒（批號HR8326-EIM）購自北京百奧萊博科技有限公司；兔源α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單克隆抗體（批號19245）購自美國CST公司；兔源HIF-1α、VEGF單克隆抗體（批號分別為sc-13515、sc-7269）均購自美國Santa Cruz 公司；兔源層粘連蛋白（laminin，LN）單克隆抗體（批號LM-0821R）購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（又稱CD31）單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H＆L）二抗（批號分別為ab181602、ab182981、ab6702）均購自英國Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD雄性大鼠65只，體重200～250 g，購自湖北貝恩特生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（鄂）2021-0027。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～24 ℃，相對濕度50%～60%，正常光照，自由攝食飲水。本研究已獲得武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司動物倫理委員會審批，倫理批件號為HLK-202203213。

2 方法

2.1 分組、建模與給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，取12 只作為正常對照組（Control組），其他53只進(jìn)行造模處理：行5/6腎切除術(shù)，術(shù)后1 周檢測Scr 和BUN 水平顯著高于正常大鼠后，在大鼠右下腹靠近腹股溝中點(diǎn)處腹腔注射1.5%PD 液100 mL/（kg·d），構(gòu)建PD大鼠模型，以PD管沖洗通暢判定為PD 造模成功[6]。正常大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。造模期間，大鼠死亡5只。將48只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組（PD 組）、70 mg/kg APS 組（APS-L 組）、140 mg/kg APS 組（APS-H 組）、140 mg/kg APS+40 mg/kg DMOG 組（APS-H+DMOG 組）[7―8]，每組12 只。各給藥組大鼠腹腔注射PD液同時灌胃相應(yīng)劑量的APS及腹腔注射相應(yīng)劑量的DMOG，Control組和PD 組大鼠灌胃等體積生理鹽水。每天給藥1次，連續(xù)4周。

2.2 腹膜功能檢測

各組大鼠末次給藥后，腹腔注射4.25%葡萄糖PD液25 mL，取0、4 h大鼠尾靜脈血，測定血液中葡萄糖濃度。4 h后麻醉大鼠處死，抽吸腹腔液體計(jì)量，再打開腹腔，稱量干凈紗布質(zhì)量，再用紗布收集腹腔內(nèi)未抽凈的液體計(jì)量。按下式計(jì)算大鼠腹膜超濾量（peritoneal ultrafiltration，UF）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量（mass transfer of glucose，MTG）：UG＝（紗布吸水后的質(zhì)量－紗布的質(zhì)量）×1 mL/g+腹腔抽吸量－腹腔注射量；MTG＝（0 h葡萄糖濃度×PD 液注入體積）－（4 h 葡萄糖濃度×PD 液注入體積）[9]。

2.3 血清中Scr和BUN水平檢測

取“2.2”項(xiàng)下麻醉處死前各組大鼠眼眶后靜脈叢血，離心后取上清液，按試劑盒說明書方法操作，使用全自動生化分析儀檢測血清中Scr和BUN水平。

2.4 腹膜組織病理學(xué)觀察

每組取6只大鼠的腹膜組織，用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片。石蠟切片行HE 染色，封片后使用顯微鏡觀察各組大鼠腹膜組織病理變化。石蠟切片行Masson 染色，封片后使用光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠腹膜組織纖維化變化；每個切片隨機(jī)選擇5個視野計(jì)算腹膜厚度及膠原纖維沉積占比。

2.5 腹膜組織微血管密度及α-SMA、LN蛋白表達(dá)檢測

取“2.4”項(xiàng)下石蠟切片，脫蠟復(fù)水后，加入CD31、α-SMA、LN一抗（稀釋比例分別為1∶50、1∶1 000、1∶500），4 ℃孵育；隨后加入二抗（稀釋比例為1∶2 000），室溫孵育，行DAB、蘇木精染色，漂洗后，干燥封片，使用顯微鏡觀察并采集圖片。顯微鏡下觀察CD31的染色情況并計(jì)數(shù)被染色的陽性微血管數(shù)，以5個視野陽性微血管數(shù)的均值為微血管密度。使用Image J 軟件分析，以光密度值表示α-SMA、LN蛋白的表達(dá)水平。

2.6 腹膜組織中HIF-1α/VEGF信號通路相關(guān)蛋白檢測

取各組剩余6只大鼠的腹膜組織，研磨后離心，取上清液，檢測蛋白濃度，煮沸變性，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入HIF-1α、VEGF、GAPDH 一抗（稀釋比例分別為1∶500、1∶500、1∶1 000），4 ℃孵育；加入二抗（稀釋比例為1∶2 000），室溫孵育，再加入ECL 共孵育，曝光顯影。使用Image J 軟件采集圖像并分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 APS對大鼠腹膜UF和MTG的影響

與Control 組比較，PD 組大鼠腹膜UF 顯著降低，MTG 顯著升高（P＜0.05）；與PD 組比較，APS-L 組、APS-H 組大鼠腹膜UF 均顯著升高，MTG 均顯著降低（P＜0.05），且APS-H 組改善效果優(yōu)于APS-L 組（P＜0.05）；與APS-H 組比較，APS-H+DMOG 組大鼠腹膜UF顯著降低，MTG顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠腹膜UF 和MTG 的檢測結(jié)果（±s，n＝12）

a：與Control組比較，P＜0.05；b：與PD組比較，P＜0.05；c：與APS-L組比較，P＜0.05；d：與APS-H組比較，P＜0.05。

組別Control組PD組APS-L組APS-H組APS-H+DMOG組UF/mL 16.35±1.85 5.16±0.74a 8.74±0.93b 14.65±1.54bc 10.67±1.16d MTG/（mmoL/kg）11.23±1.20 20.56±2.13a 17.38±1.82b 12.24±1.25bc 16.54±1.71d

3.2 APS對大鼠血清中Scr和BUN水平的影響

與Control 組比較，PD 組大鼠血清中Scr 和BUN 水平均顯著升高（P＜0.05）；與PD組比較，APS-L組、APSH組大鼠血清中Scr和BUN水平均顯著降低（P＜0.05），且APS-H 組改善效果優(yōu)于APS-L 組（P＜0.05）；與APSH 組比較，APS-H+DMOG 組大鼠血清中Scr 和BUN 水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清中Scr和BUN水平的檢測結(jié)果（±s，n＝12）

表2 各組大鼠血清中Scr和BUN水平的檢測結(jié)果（±s，n＝12）

a：與Control組比較，P＜0.05；b：與PD組比較，P＜0.05；c：與APS-L組比較，P＜0.05；d：與APS-H組比較，P＜0.05。

組別Control組PD組APS-L組APS-H組APS-H+DMOG組Scr/（μmol/L）30.22±2.76 86.74±7.64a 62.17±5.51b 38.52±3.12bc 55.31±4.83d BUN/（mmol/L）4.32±0.33 9.76±0.89a 7.34±0.63b 5.16±0.46bc 6.45±0.57d

3.3 APS對大鼠腹膜組織病理變化的影響

Control 組大鼠腹膜組織間皮細(xì)胞排列整齊、緊密；與Control 組比較，PD 組大鼠腹膜組織結(jié)構(gòu)松散，腹膜間皮細(xì)胞脫落，腹膜層及間皮下基質(zhì)增厚，大量成纖維樣細(xì)胞及單核、巨噬細(xì)胞浸潤，纖維素樣物質(zhì)沉積；與PD 組比較，APS-L 組、APS-H 組大鼠只有少部分腹膜間皮細(xì)胞排列不整齊并有脫落，腹膜組織腹膜層及間皮下基質(zhì)增厚減少，細(xì)胞浸潤減少；與APS-H 組比較，APS-H+DMOG 組大鼠腹膜組織松散，間皮細(xì)胞脫落增多，腹膜層及間皮下基質(zhì)增厚，細(xì)胞浸潤增多。結(jié)果見圖1。

→：病變部位。圖1 各組大鼠腹膜組織病理形態(tài)顯微鏡圖（HE染色）

3.4 APS對大鼠腹膜組織纖維化的影響

與Control 組比較，PD 組大鼠腹膜厚度和膠原纖維沉積占比均顯著增加（P＜0.05）；與PD 組比較，APS-L組、APS-H組大鼠腹膜厚度和膠原纖維沉積占比均顯著減少（P＜0.05），且APS-H 組改善效果優(yōu)于APS-L 組（P＜0.05）；與APS-H 組比較，APS-H+DMOG 組大鼠腹膜厚度和膠原纖維沉積占比均顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見圖2和表3。

→：膠原纖維沉積。圖2 各組大鼠腹膜組織纖維化顯微圖（Masson染色）

表3 各組大鼠腹膜厚度、膠原纖維沉積占比的檢測結(jié)果（±s，n＝6）

表3 各組大鼠腹膜厚度、膠原纖維沉積占比的檢測結(jié)果（±s，n＝6）

a：與Control組比較，P＜0.05；b：與PD組比較，P＜0.05；c：與APS-L組比較，P＜0.05；d：與APS-H組比較，P＜0.05。

組別Control組PD組APS-L組APS-H組APS-H+DMOG組腹膜厚度/μm 8.67±0.92 36.68±3.27a 28.32±2.33b 16.34±1.49bc 26.17±2.21d膠原纖維沉積占比/%0.17±0.02 0.85±0.09a 0.61±0.06b 0.26±0.03bc 0.52±0.05d

3.5 APS對大鼠腹膜組織微血管密度的影響

與Control 組比較，PD 組大鼠腹膜組織微血管密度顯著升高（P＜0.05）；與PD 組比較，APS-L 組、APS-H 組大鼠腹膜組織微血管密度均顯著降低（P＜0.05），且APS-H 組改善效果優(yōu)于APS-L 組（P＜0.05）；與APS-H組比較，APS-H+DMOG 組大鼠腹膜組織微血管密度顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖3和表4。

圖3 各組大鼠腹膜組織微血管的顯微鏡圖（免疫組化染色）

表4 各組大鼠腹膜組織微血管密度和α-SMA、LN 蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果（±s，n＝6）

表4 各組大鼠腹膜組織微血管密度和α-SMA、LN 蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果（±s，n＝6）

a：與Control組比較，P＜0.05；b：與PD組比較，P＜0.05；c：與APS-L組比較，P＜0.05；d：與APS-H組比較，P＜0.05。

組別Control組PD組APS-L組APS-H組APS-H+DMOG組微血管密度/（個/視野）0 15.50±7.32a 11.17±5.21b 6.33±3.17bc 13.83±6.19d α-SMA光密度值0.036±0.004 0.089±0.009a 0.066±0.007b 0.043±0.004bc 0.059±0.006d LN光密度值0.021±0.002 0.076±0.008a 0.059±0.006b 0.032±0.003bc 0.047±0.005d

3.6 APS 對大鼠腹膜組織中α-SMA、LN 蛋白表達(dá)的影響

與Control 組比較，PD 組大鼠腹膜組織中α-SMA、LN蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與PD組比較，APS-L組、APS-H組大鼠腹膜組織中α-SMA、LN蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），且APS-H 組改善效果優(yōu)于APS-L 組（P＜0.05）；與APS-H 組比較，APS-H+DMOG 組大鼠腹膜組織中α-SMA、LN 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖4和表4。

3.7 APS 對大鼠腹膜組織中HIF-11α/VEGF 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Control 組比較，PD 組大鼠腹膜組織中HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與PD 組比較，APS-L 組、APS-H 組大鼠腹膜組織中HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），且APS-H 組改善效果優(yōu)于APS-L 組（P＜0.05）；與APS-H 組比較，APSH+DMOG 組大鼠腹膜組織中HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖5和表5。

圖5 各組大鼠腹膜組織中HIF-11α、VEGF 蛋白表達(dá)的電泳圖

表5 各組大鼠腹膜組織中HIF-11α、VEGF 蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果（±s，n＝6）

表5 各組大鼠腹膜組織中HIF-11α、VEGF 蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果（±s，n＝6）

a：與Control組比較，P＜0.05；b：與PD組比較，P＜0.05；c：與APS-L組比較，P＜0.05；d：與APS-H組比較，P＜0.05。

組別Control組PD組APS-L組APS-H組APS-H+DMOG組HIF-1α 0.48±0.06 0.89±0.04a 0.73±0.05b 0.52±0.02bc 0.66±0.03d VEGF 0.53±0.03 0.96±0.03a 0.78±0.06b 0.57±0.06bc 0.71±0.07d

4 討論

PD主要是利用腹膜生物半透膜特性清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物和超濾水分，維持電解質(zhì)和酸堿平衡。長期使用PD 液特別是含有高濃度葡萄糖的PD 液可使腹膜的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，導(dǎo)致透析效能降低、超濾失敗。本研究結(jié)果顯示，APS 可以增加PD 大鼠腹膜UF，減少M(fèi)TG 和血清中Scr、BUN 水平，從而抑制腹膜纖維化及血管新生。

腹膜纖維化是導(dǎo)致超濾衰竭的主要原因之一，而腹膜結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的間皮細(xì)胞是影響腹膜纖維化的關(guān)鍵。研究顯示，α-SMA 表達(dá)增加可以導(dǎo)致腹膜纖維化發(fā)生，抑制腹膜間皮分泌α-SMA 可以延緩腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，從而防治腹膜纖維化[10]。LN為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，也是膠原形成過程的中間產(chǎn)物，參與體內(nèi)纖維化進(jìn)程，其水平也可以間接反映體內(nèi)纖維化的程度。研究顯示，降低LN 蛋白表達(dá)水平可以阻止腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的激活，抑制腎纖維化的發(fā)生[11]。本研究結(jié)果顯示，APS可以下調(diào)α-SMA、LN蛋白表達(dá)，從而防治腹膜纖維化。

血管新生是在原有血管基礎(chǔ)上出芽、套疊增生而成，參與機(jī)體的生長發(fā)育、組織修復(fù)、腫瘤形成等生理病理進(jìn)程。新生的腹膜血管可以增大腹膜毛細(xì)血管的交換面積，加速腹膜吸收葡萄糖的速度，導(dǎo)致腹腔滲透濃度梯度消失加快、腹膜超濾減少，致使體內(nèi)的水分及尿液中毒素物質(zhì)不能及時清除，嚴(yán)重時可能造成心臟超負(fù)荷，甚至危及生命[12]。HIF-1α 是血管生成的啟動因子，可以誘導(dǎo)血管生成；VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長因子，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化與遷移，修復(fù)損傷，促使血管新生，保持血管壁通透性與完整性等，是血管新生的標(biāo)志性指標(biāo)；另外VEGF是HIF-1α 主要靶基因之一，在缺氧條件下，可被HIF-1α 迅速誘導(dǎo)活化。研究顯示，下調(diào)VEGF 的表達(dá)可以抑制大鼠腎臟病理性血管新生從而減輕纖維化損傷[13]；抑制HIF-1α/VEGF信號通路可以降低關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥水平，抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)，減緩血管的擴(kuò)張及新生[14]。本研究結(jié)果顯示，APS 可以抑制HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)，從而抑制腹膜血管新生及腹膜纖維化；而作為HIF-1α 激動劑的DMOG 可以逆轉(zhuǎn)APS對腹膜血管新生及腹膜纖維化的抑制作用。

綜上所述，APS可以通過抑制HIF-1α/VEGF信號通路來抑制PD大鼠腹膜纖維化及血管新生。