基于機器學習篩選慢性鼻竇炎相關診斷基因及其與免疫微環境的關系分析

王珍珍 黃琦 黃鈞濤 沈毅 鄔振華

慢性鼻竇炎是目前臨床最常見的慢性疾病之一，以鼻竇黏膜炎癥、繼發自然引流通道阻塞而導致的一系列臨床癥狀為特征，如鼻塞、鼻涕、鼻后滴漏、面部脹痛、嗅覺減退或喪失、頭痛、疲勞甚至抑郁。慢性鼻竇炎會嚴重影響患者的生活質量，加重經濟負擔[1-2]。研究表明，慢性鼻竇炎具有臨床、病理和免疫多樣性，盡管其病因和發病機制尚不完全清楚，但炎癥相關因素起著重要作用，主要表現為鼻竇黏膜的慢性炎癥，伴有大量淋巴細胞、巨噬細胞、漿細胞和嗜酸性粒細胞的炎性浸潤及黏膜上皮結構的病理變化[3-4]。隨著基因測序及生物信息學技術的發展，疾病的發病機制在基因層面得到了更詳細的探究。采用生物基因測序技術和機器學習算法相結合，可將目標對象的特征數據納入對應的數學模型，通過計算機迭代模擬，篩選出目標的候選相關特征[5-6]。基于此，本研究使用多種機器學習模型對慢性鼻竇炎的相關測序芯片進行分析，在此基礎上，篩選出慢性鼻竇炎的相關基因，并與慢性鼻竇炎免疫微環境中的炎性細胞進行相關性分析，探討其臨床意義，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 慢性鼻竇炎相關基因表達芯片獲取 從高通量基因表達（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫公開獲取慢性鼻竇炎疾病相關基因芯片，選擇GSE23552 芯片作為本次研究的訓練集。該芯片由17 例慢性鼻竇炎樣本和22 例正常對照樣本組成，根據GPL 5175 平臺的探針注釋信息，對該芯片進行注釋，使用R 軟件的“limma”程序包對該芯片進行標準化處理，獲得基因表達矩陣用于后續分析。本研究經寧波市醫療中心李惠利醫院醫學倫理委員會審查通過（批準文號：KY2023ML046）。

1.2 差異基因篩選、加權共表達分析及功能分析使用R 軟件的“limma”程序包對上述GSE23552 芯片中的慢性鼻竇炎和正常對照樣本進行基因表達差異分析，篩選標準：（1）|log2FC|＞1（即兩組基因表達量的差異＞2 倍）；（2）校準后P＜0.05，當基因同時滿足上述2 個條件時認為是慢性鼻竇炎樣本和正常對照樣本的差異基因。篩選后獲得的差異基因的表達分布情況通過基因熱圖和火山圖呈現。同時，采用加權共表達分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）對兩組樣本進行分析，篩選相關基因，選擇基因重要性＞0.5 和模塊相關性＞0.8 作為過濾標準，過濾并篩選疾病相關基因。對上述差異基因和加權共表達分析的結果取交集，即為候選慢性鼻竇炎的相關基因，用于進一步機器學習篩選。將上述交集基因輸入蛋白質相互作用數據庫（search tool for retrieval of interacting genes/proteins，STRING）在線分析網站，分析上述基因蛋白相互作用關系，構建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡。此外，選擇P＜0.05 作為篩選標準對交集基因行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encylopaedia of genes and genomes，KEGG）分析，探究其潛在的生物學功能及有關信號通路。

1.3 機器學習篩選核心基因及驗證 分別使用最小絕對值收斂和選擇算子算法（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）、隨機森林算法以及支持向量機遞歸特征消除算法（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）對上述慢性鼻竇炎候選基因進行篩選，分別獲得3 種算法下的特征基因集，并對上述3 種算法的結果取交集，獲得慢性鼻竇炎疾病相關基因。使用箱式圖反映基因在慢性鼻竇炎樣本和正常對照樣本的差異顯著性，使用ROC 曲線的AUC 評估基因的診斷效能，并使用GSE179265 芯片作為外部隊列進行相關外部驗證。

1.4 慢性鼻竇炎免疫微環境分析 采用CIBERSORT 算法對訓練集芯片進行免疫浸潤分析，對每個樣本中的22 種免疫細胞浸潤情況進行預測，并進行相關差異分析。此外，對慢性鼻竇炎樣本和正常對照樣本的免疫細胞浸潤情況進行差異比較，采用Spearman 秩相關對診斷基因與免疫細胞浸潤情況進行相關性分析。

2 結果

2.1 慢性鼻竇炎差異基因篩選及加權共表達分析結果 基于|log2FC| ＞1，校準后P＜0.05 標準對GSE23552 芯片進行差異表達分析，共獲得309 個差異基因，其中126 個基因在正常對照樣本中上調，其余183 個基因在慢性鼻竇炎樣本中上調（圖1A，見插頁）。使用加權共表達分析對上述樣本進行聚類（圖1B，見插頁），篩選疾病相關基因模塊。如圖1C（插頁）所示，天青色、藍色、棕色模塊中的基因與慢性鼻竇炎相關，綜合考慮模塊的顯著性檢驗P值、圖1D（插頁）中的基因顯著性及圖1E（插頁）模塊相關性，選擇天青色模塊的總計214 個核心基因作為慢性鼻竇炎差異基因最終篩選結果。

圖1 慢性鼻竇炎候選基因的篩選（A：慢性鼻竇炎差異性基因火山圖；B：加權共表達對差異性基因進一步分析篩選出疾病相關基因模塊；C：分析各模塊基因與慢性鼻竇炎的相關性；D：各模塊基因的顯著性；E：選擇天青色模塊進行加權共表達分析，篩選出214 個相關基因）

2.2 慢性鼻竇炎差異基因PPI 網絡及功能分析 將上述309 個差異表達基因和214 個加權共表達分析模塊基因取交集后，共獲得184 個交集基因。將其輸入STRING 在線數據庫后，獲得其PPI 網絡關系圖。使用R 軟件對交集基因行GO 富集分析（圖2A，見插頁），結果表明，上述184 交集基因主要參與白細胞游出、免疫反應的細胞激活等生物學過程。KEGG 分析顯示（圖2B，見插頁），上述交集基因主要參與細胞因子-細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用、中性粒細胞細胞外陷阱的形成等相關信號通路。

圖2 相關功能分析（A：基本本體富集分析；B：京都基因與基因組百科全書分析）

2.3 慢性鼻竇炎相關診斷基因機器學習篩選及驗證 LASSO 回歸結果表明，當基因數為9 時該算法擬合效果最好，所篩選獲得基因包括PLP1、ADRA1A、CSRP1、SCN7A、ALX1、CD180、LPHN3、SLAMF6 和EVI2B（圖3A、B，見插頁）。隨機森林算法分析結果表明，當決策樹數目為10 時模型擬合最優，進而選擇重要性＞1 的基因作為候選診斷基因，包括CSRP1、PLP1、F13A1、CGNL1、FHL1、EMR3、GPR97、CD209、SPON1 和CCR3（圖3C、D，見插頁）。SVM-RFE 分析表明，SCN7A、ADRA1A、ALX1 和PLP1可作為疾病診斷的候選基因（圖3E，見插頁）。隨后，對上述結果取交集，PLP1 在3 種算法擬合下均考慮為慢性鼻竇炎相關基因（圖3F，見插頁），故考慮其為潛在的疾病相關診斷基因。

圖3 慢性鼻竇炎相關診斷基因的篩選（A、B：LASSO 回歸得出擬合效果最好的9 個候選基因；C、D：隨機森林算法分析得出擬合效果最好的10 個候選基因；E：SVM-RFE 分析得出4 個候選基因；F：3 種算法取交集得出最終得慢性鼻竇炎相關診斷基因PLP1）

對PLP1 進行相關性驗證，結果表明，PLP1 基因在訓練集（GSE23552）和驗證集（GSE179265）均表現為在慢性鼻竇炎樣本中下調（圖4A、B），差異均有統計學意義（P＜0.05）。ROC 曲線顯示，PLP1 在訓練集中的AUC 為1.000（圖4C），在驗證集中的AUC 為0.950（圖4D），表明該基因有良好的診斷效能。

圖4 PLP1 進行相關性驗證（A、B：PLP1 在2 個慢性鼻竇炎樣本集中表現為下調；C：PLP1 在訓練集中的ROC 曲線；D：PLP1 在驗證集中的ROC 曲線）

2.4 慢性鼻竇炎免疫微環境探究 采用CIBERSORT算法對訓練集芯片中22 種免疫細胞浸潤情況行免疫浸潤分析預測，各免疫細胞在每個樣本中的分布情況及占比見圖5A（插頁）。隨后，對22 種免疫細胞的浸潤情況作差異分析（圖5B，見插頁），結果表明慢性鼻竇炎樣本中的漿細胞、CD8 T 細胞、活化NK細胞、單核細胞和M0 巨噬細胞較正常對照樣本顯著減少，而M2 巨噬細胞、靜息肥大細胞和嗜酸性粒細胞顯著增加。Spearman 秩相關分析顯示，PLP1 基因表達與漿細胞、CD8 T 細胞、活化NK 細胞、單核細胞、M0 巨噬細胞和M1 巨噬細胞浸潤呈正相關，與M2 巨噬細胞、靜息肥大細胞、靜息樹突細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤呈負相關（圖5C、D，見插頁）。其中，PLP1 表達量與嗜酸性粒細胞浸潤相關系數r=-0.7（P＜0.001）。

圖5 PLP1 表達量與慢性鼻竇炎免疫微環境分析（A：CIBERSORT 對22 種免疫細胞浸潤情況分析；B：Spearman 秩相關分析PLP1基因表達量與嗜酸性粒細胞的相關性；C：22 種免疫細胞的浸潤情況的差異分析；D：PLP1 表達量與各細胞相關系數顯示）

3 討論

慢性鼻竇炎為耳鼻咽喉頭頸外科常見疾病之一，是一種病因復雜、復發率高的鼻腔鼻竇黏膜的慢性炎癥性疾病。隨著對慢性鼻竇炎遺傳學的深入探索，研究表明慢性鼻竇炎患者具有良好的遺傳突變特征[7-8]，但對其是否表現出可識別的單基因改變卻缺乏研究。在此基礎上，本文對公開的測序數據庫中有效數據進行整合，通過加權共表達分析得出慢性鼻竇炎相關候選基因，通過PPI 網絡及GO 富集分析與KEGG 分析得出上述候選基因主要位于細胞膜，與免疫相關反應有關。同時發現其通過白細胞介導免疫、免疫反應的細胞激活、白細胞趨化反應、免疫效應過程的調節等發揮生物學作用，本研究顯示慢性鼻竇炎的發生、發展與細胞因子-細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路等相關信號通路密切相關，這與之前的研究一致[9-10]。

研究表明PLP1 是髓鞘形成中最豐富的蛋白質，其在中樞神經系統的研究被廣泛報道[11-12]。除神經系統病變外，PLP1 在其他疾病中也有相關研究，有文獻報道原發性癌癥患者中PLP1 的高水平表達與總體生存時間呈負相關[13]，PLP1 可作為子宮肌瘤的潛在生物標志物[14]。本研究通過3 種算法對候選基因進行交集分析，最終得到潛在疾病相關診斷基因PLP1，并通過診斷ROC 曲線驗證PLP1 在慢性鼻竇炎中的診斷效能，所研究的2 個數據集的AUC 為分別為1.000 和0.950，驗證了PLP1 的診斷特異性，表明PLP1 可以作為慢性鼻竇炎的診斷基因，并可指導后續的相關分子生物學水平的研究。

巨噬細胞存在于各種組織中，在機體的發育、組織重塑、傷口愈合、血管生成和代謝中擔任著重要角色。巨噬細胞根據其分泌的不同炎癥介質及基因特征分為不同的亞型，每種亞型的免疫作用各不相同[15]。隨著對慢性鼻竇炎患者免疫微環境的深入探索，研究表明慢性鼻竇炎中M2 型巨噬細胞數量在一定程度上有所增加，其主要通過復雜的免疫反應和組織重塑來調節慢性鼻竇炎的發病機制并影響鼻竇炎的預后及轉歸[16-17]。巨噬細胞是鼻黏膜中嗜酸性粒細胞趨化因子的重要細胞來源，可誘導嗜酸性粒細胞的產生[18]。研究表明在慢性鼻竇炎，特別是嗜酸性慢性鼻竇炎的發展過程中，嗜酸性粒細胞作為重要的效應細胞發揮作用，其作為一種有害的免疫細胞，加劇局部炎癥反應，導致治療效果不佳，增加了并發癥的風險[19]。本研究對慢性鼻竇炎患者標本中的22 種免疫細胞浸潤情況行免疫浸潤分析及差異性分析，顯示CRS 中嗜酸性粒細胞、M2 巨噬細胞顯著增加，而M0 巨噬細胞較正常樣本顯著減少。對PLP1 基因與免疫細胞進行相關性分析，顯示PLP1 基因表達與M0 巨噬細胞和M1 巨噬細胞浸潤呈正相關，與M2 巨噬細胞、嗜酸性粒細胞浸潤呈負相關，進一步表明了PLP1 作為低表達基因與慢性鼻竇炎的免疫相關性，影響著慢性鼻竇炎的預后及復發，顯示其臨床意義。

本研究尚有不足之處，盡管通過機器學習得出PLP1 可作為慢性鼻竇炎的診斷性基因，與慢性鼻竇炎的免疫微環境存在一定的相關性，但尚缺乏PCR 等相關實驗數據支撐驗證。

綜上所述，本研究運用機器學習得出慢性鼻竇炎的發病機制中的相關診斷基因為PLP1，并初步推斷出相關基因可能的作用機制及其與慢性鼻竇炎嗜酸性粒細胞的相關性，為后續進一步機制及通路的研究提供了方向。