睡眠障礙與非睡眠障礙維持性血液透析患者腸道菌群多樣性分析

潘璐璐 王澤敏 陳輝 何穎雪 胡文雯 邵國建

作為終末期腎臟病患者的主要替代治療方法，維持性血液透析（maintenance hemodialysis, MHD）可有效延長患者的生存期。但隨著透析時間的增加，MHD 患者容易出現多種并發癥，其中睡眠障礙較為常見，其會增加MHD 患者心血管疾病的發生風險以及死亡率[1-3]。目前對于MHD 患者睡眠障礙發生的影響因素及機制的研究，結論尚不一致。近年來，研究者發現腸道菌群能夠影響大腦的活動，可能是睡眠機制的關鍵調節因素[4-5]。基于此，本研究通過分析睡眠障礙MHD 患者和非睡眠障礙MHD 患者腸道菌群結構的差異，探討MHD 患者睡眠障礙與腸道菌群的關系，以期為臨床上MHD 患者睡眠障礙的治療提供新策略。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2022 年1 至7 月在溫州市中心醫院根據匹茲堡睡眠質量指數（Pittsburgh sleep quality index，PSQI）量表[6]評估為睡眠障礙（PSQI 總分≥5 分）和非睡眠障礙（PSQI 總分＜5 分）的MHD 患者各30例。納入標準：（1）年齡18～80 歲；（2）在本院規律接受MHD 治療至少3 個月以上；（3）至少3 個月內無抗菌藥物及益生菌制劑服用史。排除標準：（1）存在以下情況或疾?。壕窦膊?、認知功能障礙、嚴重心肺功能不全、惡性腫瘤、劇烈疼痛、消化系統感染、膽囊或結腸切除術后等；（2）正處于禁食或腸內、外營養支持患者；（3）患者或家屬不能合作。兩組患者性別、年齡、BMI 及原發病等一般資料比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。本研究經本院醫學倫理委員會審查通過（批準文號：快K2021-04-040），所有患者知情同意并簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 糞便標本采集 使用糞便微生物DNA 專用采集管收集患者新鮮糞便標本（約2～5 g），于30 min內放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 標本DNA 提取和檢測 采用糞便DNA 提取試劑盒（德國QIAGEN 公司）提取糞便標本總DNA，再通過瓊脂糖凝膠電泳儀（美國Bio-RAD 公司）和紫外分光光度計（美國Thermo 公司）進行DNA 濃度及純度的檢測。

1.2.3 PCR 擴增 取50 ng 稀釋后的基因組DNA 作為模板DNA，使用美國NEB 公司的Phusion Hot start flex 2X Master Mix 高效高保真酶對16S rDNA 基因V3-V4 可變區進行PCR 擴增，引物序列為341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'），805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。PCR 產物由核酸純化試劑盒（美國Beckman 公司）純化，Qubit 熒光儀（美國Invitrogen 公司）定量。

1.2.4 16S rDNA 高通量測序及生物學信息分析 對純化后的PCR 產物使用Agilent 2100 生物分析儀（美國Agilent 公司）和文庫定量試劑盒（美國Illumina 公司）進行評估。合格擴增產物使用NovaSeq 6000 測序儀（美國Illumina 公司）進行2×250 bp 的雙端測序。將得到的原始數據進行拆分、拼接和過濾，再使用QIIME2 軟件進行分析，將數據中有效序列以97%的相似度進行操作分類單元（operational taxonomic units，OUT）劃分。基于NT-16S 與SILVA 數據庫注釋OUT，獲得各樣品在門和屬分類學水平上的群落結構圖。采用α 多樣性和β 多樣性進行菌群多樣性分析。本研究α 多樣性分析主要通過Chao1 指數、Shannon 指數和Simpson 指數進行樣本內物種多樣性的評估，其中Chao1 指數和Shannon 指數越大，Simpson 指數越小，代表群落α 多樣性越高。β 多樣性分析通過基于Bray-Curtis 距離的主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）來反映樣本間物種多樣性。采用線性判別分析及效應量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析進行菌群差異性分析。

1.3 觀察指標 觀察并比較睡眠障礙組與非睡眠障礙組患者腸道菌群α 多樣性、β 多樣性、腸道菌群結構，并分析兩組腸道菌群結構差異的顯著性。

1.4 統計學處理 采用SPSS 25.0 統計軟件。正態分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。腸道菌群生物學信息的統計分析和作圖使用R 軟件（Version 2.15.3）完成。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 睡眠障礙組與非睡眠障礙組患者腸道菌群α 多樣性比較 睡眠障礙組患者腸道菌群的Chao1 指數為233.35±65.22，Shannon 指數為4.80±0.48，Simpson指數為0.0749±0.0253；非睡眠障礙組患者腸道菌群的Chao1 指數為235.91±59.73，Shannon 指數為4.24±0.51，Simpson 指數為0.1295±0.0570。兩組患者腸道菌群的Chao1 指數比較差異無統計學意義（t=-0.159，P=0.874）。睡眠障礙組的Shannon 指數高于非睡眠障礙組（t=4.342，P＜0.001），睡眠障礙組的Simpson指數低于非睡眠障礙組（t=-4.799，P＜0.001）。這提示睡眠障礙組患者腸道菌群的α 多樣性高于非睡眠障礙組患者。

2.2 睡眠障礙組與非睡眠障礙組患者腸道菌群β 多樣性比較 PCoA 分析顯示，PC1 對于樣本差異的貢獻值為15.01%，PC2 對于樣本差異的貢獻值為10.18%。睡眠障礙組與非睡眠障礙組樣本在坐標圖中雖有一定重合，但整體距離存在一定分離趨勢，進一步Anosim 分析提示睡眠障礙組與非睡眠障礙組的群落結構差異有統計學意義（R=0.10，P=0.04），見圖1。

圖1 兩組患者腸道菌群β 多樣性的PCoA 圖

2.3 睡眠障礙組與非睡眠障礙組患者腸道菌群結構比較 在門分類水平，兩組患者腸道菌群主要由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）及變形菌門（Proteobacteria）構成，這4 個菌門包含了所有樣本豐度95%以上的腸道細菌。與非睡眠障礙組比較，睡眠障礙組中厚壁菌門的相對豐度明顯下降，而變形菌門的相對豐度明顯升高。在屬分類水平，與非睡眠障礙組比較，睡眠障礙組中雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、羅氏菌屬（Roseburia）及乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度明顯下降，而大腸桿菌-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）和毛螺菌屬（Lachnospira）的相對豐度明顯升高。

2.4 睡眠障礙組與非睡眠障礙組腸道菌群結構差異顯著性分析 兩組患者腸道菌群結構差異行LEfSe 分析，并制作LEfSe 分析柱狀圖。柱狀圖縱坐標是腸道菌群，橫坐標是線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）分值，其長度代表差異的顯著性。本研究LEfSe 分析的閾值設置為LDA＞2.5，P＜0.05。結果顯示，在門水平，睡眠障礙組患者腸道菌群中擬桿菌門相對豐度顯著高于非睡眠障礙組患者，厚壁菌門、放線菌門相對豐度顯著低于非睡眠障礙組患者。在屬水平，MHD 睡眠障礙組患者腸道菌群中擬桿菌屬、大腸桿菌-志賀氏菌屬、毛螺菌屬、鏈球菌屬（Streptococcus）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、巴恩斯氏菌屬（Barnesiella）及顫桿菌克屬（Oribacterium）相對豐度顯著高于非睡眠障礙組患者（均P＜0.05），乳桿菌屬、雙歧桿菌屬及羅氏菌屬相對豐度顯著低于非睡眠障礙組患者（均P＜0.05）。見圖2。

圖2 兩組患者腸道菌群LEfSe 分析柱狀圖

3 討論

近年來，終末期腎臟病的患病人數呈現上升趨勢，目前我國MHD 患者約63.2 萬人[7]。睡眠障礙是困擾MHD 患者最突出的臨床問題之一。睡眠障礙不僅造成MHD 患者虛弱、認知功能障礙、生活質量下降，還導致MHD 患者心血管疾病并發癥和病死率的增加，嚴重影響MHD 患者的預期壽命。

人體腸道中存在著種類繁多的微生物群，其中厚壁菌門和擬桿菌門占整個菌群95%以上。此外還包括變形菌門、放線菌門和梭桿菌門等[8]。這些微生物不僅直接參與了人體的多項生理活動（如消化、免疫、內分泌等），還對大腦發育、情緒和認知功能具有多重影響[9]。研究發現，腸道菌群可通過多種途徑影響中樞神經系統功能，并影響睡眠過程[10-11]。機體睡眠障礙的發生亦與腸道菌群的失調相關[12]。本研究初步探討了睡眠障礙MHD 患者和非睡眠障礙MHD 患者腸道菌群的結構變化。結果顯示，睡眠障礙組患者腸道菌群的α 多樣性高于非睡眠障礙組患者，并且兩組患者腸道菌群的β 多樣性存在統計學差異。α 多樣性分析是度量單個樣本內有多少種微生物物種（豐富度），以及每個微生物物種所占的比例（均勻度），即關注樣本自身的菌群組成與分布。當一個樣本中所含微生物物種種類越多，則它的豐富度越高，所含的每種微生物物種的占比越平均，則均勻度越高。β多樣性分析是度量不同樣本間菌群組成的相似度大小，即關注各樣本間的菌群組成差異。筆者推測，睡眠障礙MHD 患者腸道菌群結構發生紊亂，一些有害菌的增加可能導致了菌群豐富度增高。

通過LEfSe 多級物種差異判別分析，筆者發現，相對于非睡眠障礙MHD 患者，睡眠障礙MHD 患者腸道菌群中擬桿菌屬、大腸桿菌-志賀氏菌屬、毛螺菌屬及鏈球菌屬的相對豐度顯著升高，而雙歧桿菌屬、乳桿菌屬及羅氏菌屬的相對豐度顯著降低。動物研究表明，睡眠質量低下小鼠的腸道菌群中毛螺菌屬豐度增多，而乳桿菌屬豐度減少[13]。在人群中，失眠患者腸道菌群中擬桿菌屬和毛螺菌屬的豐度顯著高于健康人群，而能夠產生短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）的菌屬的豐度顯著降低[14]。作為腸道的有益菌，雙歧桿菌屬、乳桿菌屬及羅氏菌屬能夠合成SCFA，在結腸運動、免疫調節及抗炎方面發揮重要作用[15-17]。一項研究表明，腸道菌群產生的SCFA 能夠增加嬰兒的睡眠時間[18]。雙歧桿菌屬和乳桿菌屬還能夠合成γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA），通過微生物-腸-腦軸，影響大腦功能。GABA 作為一種抑制性神經遞質，能夠緩解機體的焦慮行為，起到改善睡眠的作用。Spiegelhalder 等[19]亦證明GABA 水平低下能夠引起睡眠障礙。大腸桿菌-志賀氏菌屬歸屬于腸桿菌科。有研究者發現，對小鼠進行人為的睡眠剝奪后，其腸道內腸桿菌科的豐度顯著升高[20]。鏈球菌屬是一種革蘭陽性兼性厭氧菌，主要將葡萄糖分解代謝產生乳酸，可能會降低腸道pH 值，導致兼性厭氧菌和厭氧菌的豐度變化，改變腸道微生物代謝，還可以穿過血腦屏障導致神經系統癥狀[21]。研究表明，鏈球菌能夠導致睡眠障礙[22]，并且相較于腦卒中后非睡眠障礙患者，腦卒中后睡眠障礙患者腸道菌群中鏈球菌屬的豐度顯著升高[23]。國內研究發現，Parabacteroides、Barnesiella 為抑郁癥患者優勢菌群[24-25]，產后抑郁患者在其抑郁情緒的緩解與Oribacterium 相對豐度減少相關[26]。睡眠障礙往往與焦慮、抑郁等情況相伴隨。本研究亦發現，睡眠障礙MHD 患者腸道菌群中Parabacteroides、Barnesiella 及Oribacterium 的相對豐度顯著增加。

綜上所述，睡眠障礙組MHD 患者腸道菌群的α多樣性高于非睡眠障礙組MHD 患者，兩組患者的腸道菌群結構組成存在差異。其中擬桿菌屬、大腸桿菌-志賀氏菌屬、毛螺菌屬、鏈球菌屬、Parabacteroides、Barnesiella 及Oribacterium 是MHD 睡眠障礙患者腸道菌群中的優勢菌屬，可能與MHD 患者的睡眠障礙存在相關性。但本研究樣本量較小，也并未排除兩組患者的生活因素及飲食因素方面的影響，上述結論有待后續更多的大樣本研究明確。另外，本研究無法證實MHD 患者睡眠障礙與腸道菌群結構改變之間的因果關系及相互作用機制，亦有待后續進一步的研究探討，以期更好地為臨床治療和干預提供理論依據。