HPLC-MS/MS快速測定蜂蜜中五氯酚殘留

周濤，陳志民，付麗紅，吳芳芳，王華珍，朱麗婷，葉宇茜，黃梅英

(麗水藍城農科檢測技術有限公司，浙江 麗水 323000)

五氯酚(pentachlorophenol，PCP)又名五氯苯酚，是一種持久性有機污染物，曾被用作殺蟲劑、抗菌劑和防腐劑等[1]，且價格便宜，曾經在水產養殖過程中被廣泛使用[2]。研究表明，五氯酚不僅化學性質穩定，而且殘留期長，容易蓄積在水體、土壤中，并通過食物鏈進入動物體內，對動物的甲狀腺功能、生殖系統及神經系統等均具有破壞作用[3-5]，目前已經被包括我國在內的許多國家禁止使用。

當前，有關五氯酚殘留量的檢測方法主要涉及食品和農產品等報道較多，主要有高效液相法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜-質譜法等[6-18]。氣相色譜法和氣相色譜-質譜法需要衍生才能上機測定，前處理時間較長且成本較高，液相法前處理繁瑣，易產生假陽性，不利于樣品的檢測，而液相色譜-質譜法具有前處理簡單、靈敏度高、成本低等諸多優點，是測定五氯酚殘留量的優選方案。為此，本文結合液相色譜串聯質譜抗干擾強、靈敏度高、無需衍生等一系列優點，采用液液分配提取，內標法定量，建立了蜂蜜中五氯酚殘留量的快速檢測方法，該方法采用氨水作堿化劑，減小了儀器受污染的風險，同時減少了前處理步驟，降低了耗材使用成本，使實驗更具操作性，并具有重復性好、定量限低等諸多優點，完全適用于蜂蜜中五氯酚的定性和定量檢測，對保障食品安全和提高行業檢測水平具有重大意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

液相色譜串聯質譜儀(美國安捷倫公司G6470)、離心機(Thermo Fisher Scientific)、電子天平(瑞典梅特勒托利多公司)、Milli超純水機(美國密理博)。

五氯酚標準品(純度>99.0%)及同位素內標(13C6-五氯酚內標13C6-PCP)均購自上海振翔科技有限公司，甲醇色譜純，氨水、乙酸乙酯均為分析純。

標準溶液的稀釋與配置：將五氯酚標準溶液(100 μg·mL-1)配置成10 μg·mL-1，稱取五氯酚內標粉末10.0 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，-18 ℃冷凍保存。分別取適量五氯酚及其內標儲備液稀釋配制成0.5 mg·L-1的混合標準工作液。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：安捷倫XDB C18(2.0 mm×50 mm，1.8 μm)；流動相：甲醇+0.1%甲酸2 mmol·L-1乙酸銨水溶液，洗脫模式見表1。

表1 色譜條件Table 1 Chromatographic conditions

電噴霧正離子掃描(ESI+)：噴霧電壓3 000 V；干燥氣溫度320 ℃，流速10 L·min-1；碰撞氣為氮氣；霧化器壓力40 psi；鞘氣溫度375 ℃，流速10 L·min-1；多反應監測(MRM)模式。

1.3 實驗方法

稱取5.0 g蜂蜜樣品于50 mL離心管中，加入適量內標溶液，然后加入10.0 mL水，準確加入12.0 mL氨化乙酸乙酯(乙酸乙酯∶氨水=9∶1，V∶V)渦旋1.0 min，超聲3.0 min，置于離心機中以6 000 r·min-1離心3.0 min。吸取上清液于10 mL刻度管中，50 ℃水浴氮氣吹干，加入1.0 mL定容液(甲醇∶水=1∶1，V∶V)，混勻，過膜供液質聯用譜儀上機測定。

2 結果與分析

2.1 實驗結果

在本實驗條件下，五氯酚在6.0 min內能得到良好分離，基本無干擾峰，且分析時間短。標準溶液色譜圖(MRM)如圖1所示，五氯酚內標溶液色譜圖如圖2所示。

圖1 五氯酚標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of pentachlorophenol standard solution

圖2 五氯酚內標(13C6-PCP)溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of pentachlorophenol internal standard (13C6-PCP) solution

2.2 儀器參數的優化

本實驗采用電噴霧電離源(ESI)進行了探索，分別對五氯酚和五氯酚同位素內標(13C6-PCP)進行正負離子掃描，再結合五氯酚的酸性特點，發現五氯酚及其同位素內標(13C6-PCP)結構穩定，[M-H]離子化效率很低，無法獲得特征離子。故選擇五氯酚中氯元素的4個同位素為母離子對(262.7/262.7；264.7/264.7；266.7/266.7；268.7/268.7)、五氯酚同位素內標(13C6-PCP)的母離子對(270.7/270.8；272.7/272.8；274.7/274.8；276.7/276.8)進行分析，結合實際通過對蜂蜜空白樣品和加標樣品分析過程發現五氯酚定量離子對266.7/266.7；268.7/268.7存在較大干擾，因此，選取(262.7/262.7；264.7/264.7)作為五氯酚定量定性離子對，(272.7/272.8；274.7/274.8)作為五氯酚內標(13C6-PCP)子離子；五氯酚同位素內標及其定性定量離子對、碰撞能量以及保留時間見表2。

表2 質譜條件Table 2 Mass spectrum conditions

2.3 提取溶劑的選擇

目前，食品與農產品等基質中五氯酚的提取方法主要以酸化法與堿化法兩種方式為主。兩種提取方法各有優劣，本實驗主要采用堿化法提取，堿化法常規的做法是在有機試劑中加入一定比例的三乙胺進行提取，若前處理凈化未完全，極易造成上機樣品中三乙胺的殘留，一旦三乙胺殘留量增加，時間延長，嚴重影響質譜儀的靈敏度，對樣品檢測產生重大影響。所以本文選取氨水做堿化，在未加內標的同時比較提取溶劑中氨水含量對五氯酚提取效率的影響，通過反復試驗對比，試驗結果見圖3。當氨水含量為10%時提取效率達到53.0%，當氨水含量提高到20%時，提取效率明顯下降。最終采用氨化乙酸乙酯(乙酸乙酯∶氨水=9∶1)作為提取溶劑。

圖3 氨水含量與回收率Fig.3 Ammonia content and recovery rate

2.4 標準曲線驗證

按內標法配置濃度為1.0、2.0、4.0、10.0、50.0、100.0 ng·mL-1的標準溶液在設定的儀器條件下進行上機確定其線性方程，結果表明，在1.0～100.0 ng·mL-1其線性方程為y=72 475.3x-1 352.26，其相關系數r為0.998。

實驗結果符合檢測要求，此方法可用于五氯酚藥物的定量分析。

2.5 回收率及檢出限

按照前處理方法稱取空白蜂蜜樣品18份，進行0.5、2.0和10.0 μg·kg-13檔濃度加標(每檔6平行)，在基質中分別加入適量的五氯酚內標(13C6-PCP)和五氯酚標準溶液，參照實驗步驟處理后測定，計算平均回收率和相對標準偏差(RSD)來考察方法的準確度和精密度，在3檔濃度加標水平下，五氯酚的回收率在93.5%～101.3%，RSD在4.30%～6.82%(表3)。以加標濃度為5 μg·kg-1為基準，計算得出該方法的檢出限(LOD)為0.2 μg·kg-1，定量限(LQD)為0.5 μg·kg-1。實驗結果表明，本方法符合實驗要求，可用于實際樣品的快速定量分析。

表3 回收率及精密度(RSD，n=6)Table 3 Recovery rate and precision

3 結論

本實驗建立了蜂蜜中五氯酚殘留量的LC-MS/MS檢測方法，結合液相色譜串聯質譜儀抗干擾強、靈敏度高等特有優點對前處理過程進行簡化，并減少了試劑的使用量。同時該方法具有回收率高、重復性好的諸多優點，說明該方法完全適用于蜂蜜樣品的定性和定量分析，為蜂蜜中五氯酚藥物殘留量的測定提供有力參考。