長期干旱脅迫下Mdm-miR160-MdARF17-MdHYL1模塊調控蘋果生長發育的研究

劉晨 毛秀山 劉祥梅 申小霞 劉振中

摘 要 為了研究長期干旱條件下Mdm-miR160- MdARF17- MdHYL1? 調控網絡在蘋果生長發育中的作用，以GL-3和Mdm-miR160e OE、 MdARF17? RNAi、 MdmARF17? OE、? MdHYL1? OE及 MdHYL 1 RNAi轉基因蘋果為試驗材料，進行為期3個月的長期干旱處理，測定蘋果株高、根干質量、根冠比以及葉片凈光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導度、蒸騰速率、葉綠素熒光值和水分利用效率。結果表明，在長期干旱脅迫下， Mdm-miR160e OE轉基因蘋果植株更矮化，根冠比、根干質量、光合能力及水分利用效率大于GL-3植株，具有更強的耐旱性；? MdARF17 RNAi植株比GL-3更矮，且具有更大的根冠比、根干質量、光合能力和水分利用效率，而 MdARF17? OE與之相反；? MdHYL1? RNAi植株對長期干旱脅迫更敏感，其株高大于野生型且具有更小的根冠比、更低的光合能力和水分利用效率，而? MdHYL1?? OE植物對長期干旱條件具有更強的適應性，生長發育表型與RNAi植株相反。綜上所述，Mdm-miR160-? MdARF17- MdHYL1調控網絡在蘋果響應長期干旱過程中發揮了重要功能，為蘋果抗旱分子育種提供了候選基因。

關鍵詞 蘋果;長期干旱;? MdARF17;Mdm-miR160; MdHYL1

MicroRNA（miRNA）是一類長度約為21～24個核苷酸（nt）的短鏈小分子RNA[1]。在植物中，miRNA由RNA聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）轉錄，產生初級miRNA（pri-miRNA），經DICER-LIKE1（DCL1）進一步裂解產生成熟的miRNA，它們可以通過形成一個RNA誘導的沉默復合物（RISC）與目標mRNA結合，從而表現為對靶基因的負調節[2-4]。miRNA在植物響應非生物脅迫的過程中發揮重要作用[5]，過表達擬南芥（Arabidopsis thaliana）ath-miR156、ath-miR408或大豆（Glycine max）gma-miR 172c等可以提高這些植物的耐旱能力[6-8]。前人研究表明，miR160通過靶向生長素響應因子（AUXIN RESPONSE FACTORS，ARF） ARF10、 ARF16、 ARF17，調節植物的生長發育[9]。

植物體內的ARF轉錄因子可以通過特異結合Aux/IAA（Auxin/Indole-3-acetic acid）、GH3（Gretchen Hagen 3）等生長素響應基因啟動子區域的生長素響應元件，激活或抑制靶基因的表達[10]。前人研究表明，擬南芥中的ARF5、ARF6、ARF7、ARF8、ARF19會促進生長素響應基因的表達，其余ARF蛋白起轉錄抑制作用[11]。在擬南芥中， ARF17是miR160的靶基因，是擬南芥不定根生長的主要調控因子，過表達 ARF17（35S：5mARF17株系，破壞miR160驅動的 ARF17降解）會導致根、葉片、花器官的發育缺陷[12]。

蘋果（Malus domestica）是中國重要的經濟作物，在全國范圍內都有廣泛栽種。根據國家統計局數據，2019年中國蘋果總產量高達4 242? 萬t，超過世界總蘋果產量的二分之一。 西北黃土高原地區是中國重要的優質蘋果產區，但該地區自然降水少，且年降水量分布不均，影響蘋果的產量和品質，嚴重制約當地蘋果產業的發展[13]。水分在植物生長發育中具有重要作用，無論是長期的干旱還是短期的水分虧缺，都可能對植物體造成不可逆的傷害[14-15]。然而，其是否參與長期干旱調控并不清楚。

本研究分別對蘋果Mdm-miR160、 MdARF17 及? MdHYL1 轉基因蘋果植株進行了長期干旱處理，研究了Mdm-miR160- MdARF17- MdHYL1正反饋調節環在蘋果長期干旱脅迫中的作用，為深入研究蘋果響應長期干旱脅迫的分子機制，并進一步利用基因工程手段培育抗旱蘋果新種質提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

基因克隆和載體構建所用的‘金冠蘋果盆栽苗，生長于西北農林科技大學園藝場。轉基因材料背景為‘皇家嘎啦（Royal Gala）實生后代GL-3，所用植物材料（GL-3、Mdm-miR160e OE、 MdARF17 RNAi、 MdARF17 OE、 MdHYL 1 RNAi、 MdHYL 1 OE轉基因株系）均來自于前期報道[17]。

1.2 試驗處理

長期干旱脅迫處理：參照Geng等[18]的方法進行長期干旱處理。取長勢一致的轉基因蘋果和GL-3，移栽至30 cm×18 cm大盆中[基質∶沙=10∶1（體積比）]，在溫室大棚中正常管理兩個月后，對照組保持正常澆水，處理組澆水至最大田間持水量后，用TDR測量，保持土壤含水量45%～55%，進行3個月的長期干旱處理。處理結束時進行株高、根干質量、根冠比、光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導度、蒸騰速率、葉綠素熒光值、水分利用效率等一系列指標的測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生長指標的測定 處理結束時，對照組和干旱處理組的每個株系各自隨機選取12株進行株高的測定。株高用卷尺（1 mm）測定（從土壤表面至主干頂芽）。隨后各自隨機選取5株拔出、洗凈，分為地上部分和地下部分，之后放入105? ℃烘箱殺青15～20 min，70 ℃烘干。天平稱量地上部分和地下部分，地下部分干質量即為根干質量，其比值為根冠比。

1.3.2 光合作用指標及水分利用效率的測定 光合參數（凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和胞間CO2濃度）測定：使用Li-6400 XT光合儀（Li-Cor Inc.，Lincoln，Nebraska，USA），選取每株主干頂部第9～10片成熟葉進行測定，測定時間為晴天的? 9：00-11：00。

葉綠素熒光參數（PSⅡ最大量子產量? Fv/Fm）測定：使用PAM-2500便攜式調制葉綠素熒光儀（Walz Company，Germany），選取每株主干頂部第9～10片成熟葉，暗適應30 min后進行測定。

水分利用效率（WUE）檢測：長期干旱處理結束后，摘取植株中部成熟葉片，每個株系取3片葉子，烘干后粉碎過80目篩，測定碳同位素豐度比（13C/12C）。

2 結果與分析

2.1 Mdm-miR160e OE轉基因植株在長期干旱脅迫下表型分析

對GL-3 和Mdm-miR160e OE轉基因蘋果植株進行3個月的長期中度干旱脅迫處理，結果顯示，與GL-3植株相比，Mdm-miR160e OE植株在干旱處理前后均具有矮化表型，且干旱脅迫后，轉基因植株與GL-3株高之間的差異減小（圖1-A、1-B）。分析Mdm-miR160e OE植株和GL-3根的干質量和根冠比發現，Mdm-miR160e OE株系具有更大的根干質量和根冠比，說明干旱脅迫條件下Mdm-miR160e過表達能夠維持根系的生長發育狀態（圖1-C、1-D）。

利用光合儀測定光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導度及蒸騰速率，便攜式調制葉綠素熒光儀測定葉綠素熒光， 結果顯示，干旱脅迫使蘋果植株的光合能力下降（圖2-A～2-E）。與GL-3相比，干旱脅迫后Mdm-miR160e OE轉基因植株的氣體交換加強，且葉片PSⅡ光合作用反應中心具有更大的光化學效率，其光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導度、蒸騰速率和葉綠素熒光參數Fv/Fm均顯著高于野生型（圖2-A～2-E），說明其具有比野生型更強的光合能力，對長期干旱的環境具有更強的適應性。植物的水分利用效率（WUE）與植物干物質中穩定碳同位素組成（δ13C）正相關，本研究通過測定碳同位素組成（δ13C）評價植物WUE，結果顯示，在長期干旱脅迫前后，與GL-3相比，Mdm-miR160e OE轉基因植株均具有更高的WUE（圖2-F），說明其在水分虧缺狀態下，能更高效地利用有限的水分。

2.2?? MdARF17轉基因植株在長期干旱脅迫下表型分析

對GL-3、 MdARF17 RNAi蘋果植株進行3個月的長期中度干旱脅迫處理，結果顯示，與GL-3植株相比， MdARF17 RNAi植株在干旱處理前后均具有矮化表型，且長期干旱脅迫后轉基因植株與GL-3株高的差異減小（圖3-A、3-B）。 MdARF17 RNAi植株在長期干旱脅迫處理后，根干質量顯著高于GL-3（圖3-C），根冠比明顯大于GL-3（圖3-D），說明沉默 MdARF17 有利于植物根系發育，使蘋果具有更強的抗旱性。

與GL-3相比，干旱處理后 MdARF17? RNAi轉基因植株具有更強的光合能力，其光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導度、蒸騰速率和葉綠素熒光參數均顯著高于野生型（圖4-A～4-E），說明 MdARF17? RNAi轉基因植株在干旱脅迫處理下具有更強的氣體交換能力，且其PSⅡ反應中心的最大光合效率高于野生型，對長期干旱脅迫有更強適應能力。但與正常澆水的對照組相比，干旱處理使所有株系的光合能力下降（圖4-A～4-E）。通過測定δ13C發現 MdARF17 RNAi株系比GL-3具有更高的水分利用效率（圖4-F）。

對GL-3、 MdmARF17 OE轉基因蘋果植株進行3個月的長期中度干旱脅迫處理，結果顯示，干旱脅迫使 MdmARF17? OE轉基因株系表現出與 MdARF17 RNAi植物相反的趨勢（圖5-A～? 5-D）。與GL-3相比， MdmARF17? OE轉基因植株具有矮化表型，且這種株高間的差異在干旱脅迫后并未減小（圖5-A、5-B），說明 MdmARF17? OE轉基因植株在干旱脅迫條件下生長量小于GL-3；且? MdmARF17? OE植物具有比野生型更低的根干質量（圖5-C）和根冠比（圖5-D），說明過表達 MdARF17 會抑制蘋果根系的生長發育，導致 MdmARF17? OE轉基因植株對干旱脅迫更敏感。

長期干旱脅迫處理后，測定 MdmARF17? OE轉基因株系光合相關參數和葉綠素熒光值，結果顯示，與GL-3相比， MdmARF17? OE植株的光合速率更慢（圖6-A）、胞間CO2濃度較低? （圖 6-B）、氣孔導度更小（圖6-C）、蒸騰速率更慢（圖6-D），具有更低的葉綠素熒光參數Fv/Fm （圖 6-E）。分析δ13C結果，發現 MdmARF17? OE株系的水分利用效率低于GL-3（圖6-F）。以上結果表明，過表達 MdARF17 會導致植物抗旱能力下降。

2.3?? MdHYL1轉基因植株在長期干旱脅迫下表型分析

對GL-3 、 MdHYL1 OE蘋果植株進行3個月的長期中度干旱脅迫處理，結果顯示，與GL-3相比，? MdHYL1? OE株系表現出更強的抗旱能力。干旱處理前， MdHYL 1 OE植株矮于GL-3植株，且株高差異較大，長期干旱脅迫后差異變小（圖7-A、7-B），說明轉基因植株在長期干旱條件下，具有更大的生長量。根系發育狀況可以表征植物在干旱脅迫條件下的吸水能力和抗旱性。且長期干旱脅迫處理后，? MdHYL1? OE植株具有更高的根干質量和根冠比（圖7-C、7-D）。

檢測長期干旱脅迫處理的? MdHYL1? OE與GL-3株系的各項光合參數，結果顯示，與正常澆水的對照組相比，干旱處理使所有株系的光合氣體交換能力顯著下降（圖8-A～8-E），但與GL-3相比，干旱處理后? MdHYL1? OE轉基因植株具有更強的光合能力，其光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導度、蒸騰速率和葉綠素熒光參數Fv/Fm均高于野生型（圖8-A～8-F）。檢測? MdHYL1? OE植株和GL-3在長期干旱條件下的δ13C，結果發現? MdHYL1? OE株系比GL-3具有更高的水分利用效率（圖8-F）。

對GL-3 、 MdHYL 1 RNAi蘋果植株進行3個月的長期干旱處理，結果顯示，? MdHYL1 RNAi植株與GL-3長期干旱脅迫后株高間的差異變大（圖9-A、9-B），說明轉基因植株在長期干旱條件下生長量低于野生型。分析? MdHYL1? RNAi植株和GL-3的根系發育情況發現，? MdHYL1? RNAi植株在長期干旱脅迫處理后根干質量和根冠比均低于GL-3（圖9-C、9-D）。

檢測長期干旱脅迫處理的? MdHYL1? RNAi與GL-3株系的各項光合參數，發現? MdHYL1? RNAi株系的光合參數具有與? MdHYL1? OE株系相反的變化趨勢。與GL-3相比，干旱處理后? MdHYL1? RNAi植物的光合能力較差，其光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導度、蒸騰速率和葉綠素熒光參數Fv/Fm均低于野生型（圖10-A～? 10-E）。檢測? MdHYL1? RNAi植株和GL-3在長期干旱條件下的δ13C，發現? MdHYL1? RNAi株系比GL-3具有更低的水分利用效率（圖10-F）。

3 討論與結論

植物的生長需要碳源和適宜的生長環境[19]。干旱脅迫下，植物的光合能力是描述其對逆境的適應能力和抗旱能力的重要指標[20]，受氣孔因素和非氣孔因素的影響[21]，葉片氣孔是植物與外界環境進行氣體和水分交換的重要通道，氣孔的開張度對植物的光合作用和蒸騰作用有重要影響[22]。長期干旱脅迫條件下，植物葉片氣孔開張度下降，光系統Ⅱ（PSⅡ）部分失活，光合作用減弱[20-21]。在傳統模型中，認為光合作用CO2的吸收對植物生長起主導作用，但在越來越多的研究表明，植物吸收CO2的能力是有限的，當植物光合氣體交換達到最大程度時，增加CO2的濃度并不能改善成熟植物的生長狀況[23]。植物光合作用獲得的碳還需要在體內經過分配[24-25]，一部分轉化為植物的莖生長量，一部分轉化為根系的生長量[26]。本研究發現，Mdm-miR160e OE、 MdARF17? RNAi、? MdHYL1? OE等轉基因株系在具有更強的光合能力的同時，表現出矮化表型，這可能是由于這些轉基因蘋果體內的碳分配模式發生了改變，光合作用獲得的碳更多地流向地下部，使Mdm-miR160e OE、 MdARF17? RNAi、? MdHYL1? OE等轉基因株系蘋果具有更加發達的根系，根系形態變化是蘋果對干旱脅迫的適應性表現，表明Mdm-miR160e OE、 MdARF17? RNAi、? MdHYL1? OE等轉基因株系蘋果在干旱條件下具有更強的吸水能力。而在干旱脅迫條件下，蘋果葉片氣孔開張度下降，光合氣體交換能力強弱成為植物生長的主要限制因素，Mdm-miR160e OE、 MdARF17? RNAi、? MdHYL1? OE轉基因植株具有更強的光合能力、更高的水分利用效率，能更好地適應干旱條件[27-29]，使其與野生型GL-3之間的株高差異減小。

miRNA是植物響應干旱脅迫中的重要參與者，其在不同植物間通常具有保守性，但來自不同植物的miRNA可能對干旱脅迫的表現出不同的響應模式[30-31]。在水稻和番茄中，干旱脅迫會導致miR160的表達量下調，但在小麥和桃中，干旱脅迫后miR160的表達上調[17]。在本研究中，干旱誘導表達的Mdm-miR160e OE轉基因蘋果植株高低于野生型植株，具有更高的根干質量、根冠比、水分利用效率、更強的光合能力，對長期干旱脅迫具有更強的適應性。

一些轉錄因子可以被 miRNA靶定，在一個復雜的調節環路模型中調節miRNA的表達。在擬南芥中，ARF17是miR160的靶基因，可以調控miR160的豐度但不調節pri-miR160的含量[32]。前人研究表明，在干旱脅迫下， MdARF17 通過負調控正響應干旱脅迫的 MdWRKY71 、 MdLTP3 等基因，以及Mdm-miR156 p5，Mdm-miR160，Mdm-miR164c p5，Mdm-miR166c p5，Mdm-miR396 p5等正響應干旱脅迫的miRNA，參與蘋果的耐旱調節[17]。擬南芥中，miR167結合 AtARF6 和 AtARF8 ，參與調控不定根的生成[33]，本研究中， MdARF17 轉基因植株也表現出生長發育表型，與GL-3相比， MdARF17? RNAi 植物株高更矮，且在長期干旱脅迫條件下，MdARF17 沉默株系具有更大的根干質量和更高的根冠比，轉基因植株根系發達，使其表現更為抗旱；此外， MdARF17? RNAi植物水分利用效率和光合能力均大于野生型。而 MdARF17? OE植物與沉默株系具有相反的表型，其根系弱于野生型且對干旱脅迫更為敏感。

實驗室前期研究發現，? MdHYL1 是 MdARF17 的下游靶基因， MdHYL1是雙鏈RNA結合蛋白，其同源二聚體化使pri-miRNA種的切割位點可以被正確選擇[17]， MdARF17 通過? MdHYL1 調控miRNA的合成，形成Mdm-miR160- MdARF17 -? MdHYL1 在干旱脅迫下的正反饋調節網絡。前人研究表明，? MdHYL1 可以調控蘋果發育表型，? MdHYL1? OE植株的不定根數目增多，且長度更長，而沉默株系與之相反[34]。本研究中，3個月長期干旱處理后，? MdHYL1 過表達株系根干質量和根冠比的值均高于野生型，光合能力和水分利用效率同樣大于野生型植物，而沉默株系與之相反，說明Mdm-miR160- MdARF17 -? MdHYL1 正反饋調節網絡在蘋果響應干旱脅迫中同樣重要。

本研究證實在長期干旱脅迫下，干旱誘導表達的Mdm-miR160e轉基因蘋果植株具有更強的耐旱性，而Mdm-miR160的靶基因 MdARF17 是干旱脅迫的負調控因子，在長期干旱脅迫下， MdARF17 RNAi植株表現出更強的耐旱性，而 MdmARF17? OE植株對干旱更敏感。? MdHYL1 是 MdARF17 的下游靶基因，? MdHYL1 在蘋果耐旱調節中也發揮積極作用，? MdHYL1? RNAi植株對長期干旱脅迫更敏感，而過表達株系對長期干旱條件具有更強的適應性。

綜上所述， Mdm-miR160- MdARF17 -? MdHYL1 調控網絡在蘋果響應長期干旱過程中發揮了重要功能，研究結果為蘋果抗旱分子育種提供了候選基因，為深入研究蘋果響應長期干旱脅迫的分子機制，并進一步利用基因工程手段培育抗旱蘋果新種質提供了理論基礎。

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Regulation of Apple Growth and Development by Mdm-miR160-? MdARF17- MdHYL1 Module under Long-term Drought Stress

Abstract GL-3 and Mdm-miR160e OE， MdARF17 RNAi，MdmARF17 OE，? MdHYL1 OE，? MdHYL1 RNAi transgenic apples were used as materials to investigate the role of Mdm-miR160-? MdARF17-? MdHYL1? regulatory network in growth and development of apple trees under long-term drought stress，after three months of drought treatment，we measured plant height，root dry mass，root to shoot ratio，and leaf net photosynthetic rate，intercellular CO2 concentration，stomatal conductance，transpiration rate，Fv/Fm and water use efficiency.The results showed that under long-term drought stress，compared with GL-3 plants，Mdm-miR160e OE transgenic apple plants exhibited a more dwarf symptom，with a higher root-to-shoot ratio，root mass，photosynthetic capacity，and water use efficiency compared to GL-3 plants. They demonstrated a stronger drought tolerance;? MdARF17? RNAi plants were shorter than GL-3，with a higher root to shoot ratio，greater root dry mass，enhanced photosynthetic capacity，and improved water use efficiency. In contrast， MdARF17? OE plants displayed characteristics opposite to those of? MdARF17? RNAi lines.? MdHYL1 RNAi plants were more sensitive to long-term drought stress，with higher plant height compared to the wild-type，a smaller root-to-shoot ratio，lower photosynthetic capacity，and reduced water use efficiency. On the other hand，? MdHYL1? OE plants were better adapted to long-term drought conditions and exhibited phenotypes that were the opposite of those seen in? MdHYL1 RNAi lines.Therefore，Mdm-miR160-?? MdARF17- MdHYL1 regulatory network plays an important role in apple responses to long-term drought stress and provides candidate genes for molecular breeding to enhance drought resistance.

Key words Apple;Long-term drought;? MdARF17; Mdm-miR160;? MdHYL1