丙泊酚調(diào)節(jié)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激和凋亡

譚 瑩 ，秦海燕 ，孫 翔 ，蘇彥伊 ，王英寶

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，云南 昆明 650032;2）昆明市延安醫(yī)院泌尿外科，云南 昆明 650051）

帕金森（Parkinson's disease，PD）是α-突觸核蛋白聚集介導(dǎo)的黑質(zhì)致密性多巴胺能神經(jīng)元丟失的神經(jīng)退行性疾病，可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)和非運(yùn)動(dòng)癥狀，運(yùn)動(dòng)癥狀的特征是運(yùn)動(dòng)障礙，包括運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫和肌肉強(qiáng)直，非運(yùn)動(dòng)癥狀包括認(rèn)知障礙、抑郁、焦慮、嗅覺和味覺減退以及睡眠障礙等[1]。流行病學(xué)研究顯示，60 歲以上人群的PD 發(fā)病率增加，80 歲以上人群的發(fā)病率達(dá)3%，且男性的PD 發(fā)病率高于女性[2]。隨著人口老齡化的加重，全球范圍內(nèi)PD 的發(fā)病率也在逐漸升高。然而，目前尚沒有治愈PD 的有效方法。

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的穩(wěn)態(tài)失衡是多種神經(jīng)退行性疾病的常見特征。一般認(rèn)為氧化應(yīng)激主要由活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮等強(qiáng)氧化性自由基引起。ROS 主要在線粒體中產(chǎn)生，ROS 增多可能會(huì)使細(xì)胞的氧化還原平衡轉(zhuǎn)向氧化狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，使線粒體中的大分子受到氧化損傷，損傷大分子的積聚進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞的基本功能受損并激活細(xì)胞死亡途徑，最終引起細(xì)胞死亡。臨床研究表明，PD 患者氧化應(yīng)激水平升高[3]。因此，抑制氧化應(yīng)激水平可能是PD 治療的關(guān)鍵途徑。

丙泊酚（propofol，PPF）是臨床常用的全身靜脈麻醉劑，具有抗氧化活性。研究發(fā)現(xiàn)，PPF 刺激可減少PD 大鼠大腦中的氧化應(yīng)激，具有氧化損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[4]。本研究通過MPP+誘導(dǎo)PD 細(xì)胞模型，探討不同濃度的PPF 預(yù)處理對(duì)PD模型細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

細(xì)胞完全培養(yǎng)基購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司。1 mM MPP+購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich。PPF購(gòu)自美國(guó)Merck。CCK-8 試劑盒、H2DCF-DA 熒光探購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress。MDA 和NADPH氧化酶測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成。細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海澤葉生物，線粒體蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博。兔抗細(xì)胞色素c、GAPDH、Bcl-2、Bax 抗體、山羊抗兔二抗購(gòu)自北京博奧森。兔抗COX4 和Cleaved caspase-3 抗體購(gòu)自Abcam。Annexin V-FITC/PI 試劑盒購(gòu)自美侖生物。

1.2 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 購(gòu)自南京科佰。細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞完全培養(yǎng)基（含1%非必需氨基酸、1 mM 丙酮酸鈉以及10%胎牛血清），放入5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 d 更換一次新鮮培養(yǎng)液。

1.3 細(xì)胞處理

狀態(tài)良好的SH-SY5Y 細(xì)胞，經(jīng)消化后接種至新的培養(yǎng)板，將1mM MPP+加至培養(yǎng)液中，輕輕搖勻。將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h 以誘導(dǎo)PD 細(xì)胞模型。

MPP++10 μM PPF 組、MPP++20 μM PPF 組、MPP++40 μM PPF 組、MPP++80 μM PPF 組SHSY5Y 細(xì)胞在經(jīng)MPP+處理前，分別培養(yǎng)于含10、20、40、80 μM PPF 的培養(yǎng)基內(nèi)4 h。棄去培養(yǎng)液，再將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含1 mM MPP+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。NC 組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不進(jìn)行MPP+和PPF 處理。

1.4 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖

處理完成的各組細(xì)胞接種至96 孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，向每孔中加入含10 μL 的CCK-8 溶液100 μL，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（450 nm）。

1.5 ROS 水平

H2DCF-DA 熒光探針用于檢測(cè)SH-SY5Y 細(xì)胞中ROS 的水平。經(jīng)MPP+或PPF 處理后的細(xì)胞，用PBS 漂洗2 次，加入含20 μM H2DCF-DA 的PBS 與細(xì)胞37 ℃避光孵育30 min。洗滌后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.6 MDA 和NADPH 氧化酶活性檢測(cè)

MDA 和NADPH 氧化酶檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)SH-SY5Y 細(xì)胞中MDA 和NADPH 氧化酶水平。

MDA：根據(jù)試劑盒說明書，配置MDA 的三號(hào)試劑并用50%冰醋酸按2∶1 稀釋。各組中的細(xì)胞經(jīng)超速離心使其破裂，使用前搖勻。分別向離心管中加入等量的待測(cè)樣品和試劑一、1.5 mL 試劑二、1.5 mL 試劑三，混勻后95 ℃水浴40 min，冷卻后4 000 r/min，離心10 min，取上清測(cè)定吸光度值。

NADPH 氧化酶：試劑盒中的試劑一和三用于裂解細(xì)胞，離心后取上清。再用10 000 r/min，離心10 min，下層沉淀中加入試劑二和試劑三，利用超聲波處理90 s（每超聲3s 間隔10 s）。取40 μL樣本中分別試劑四（700 μL）、五（100 μL）、六（160 μL），混勻。分光光度計(jì)檢測(cè)600 nm 處20 s（A1）和80 s（A2）的吸光度值。ΔA=A1-A2。

1.7 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞色素c 以及Bcl-2、Bax 和Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)

收集對(duì)照組、MPP+以及MPP+和PPF 處理后的SH-SY5Y 細(xì)胞，分別利用細(xì)胞質(zhì)蛋白和線粒體蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的蛋白。采用聚丙烯酰氨凝膠電泳法將蛋白樣品按分子量分離并轉(zhuǎn)移至PVDF 中。轉(zhuǎn)移后的蛋白與5%脫脂牛奶在室溫中封閉2 h，漂洗后與一抗（兔抗細(xì)胞色素c 抗體1∶1 000，兔抗GAPDH 抗體1∶10 000，兔抗COX4 1 μg/mL，兔抗Bcl-2 1∶1 000，兔抗Bax 1∶1 000，1∶兔抗Cleaved caspase-3 1∶500）在4 ℃條件中孵育過夜，洗滌，再分別與山羊抗兔二抗室溫孵育2 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑處理后，凝膠成像儀顯影。GAPDH 作為細(xì)胞質(zhì)及全細(xì)胞蛋白檢測(cè)的內(nèi)參，COX4 作為線粒體蛋白檢測(cè)內(nèi)參。Image J 軟件分析目的蛋白。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

利用Annexin V-FITC/PI 試劑盒檢測(cè)凋亡率。收集處理后的各組細(xì)胞，室溫中用Annexin VFITC 染色10 min，洗滌后用PI 試劑染色10 min。流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞比例。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均表示為“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析2 組間差異。單因素方差分析多組間差異，Tukey's 事后檢驗(yàn)用于多組間的進(jìn)一步兩兩比較。P<0.05 認(rèn)為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)分析和繪圖利用GraphPad Prism 8.0 完成。

2 結(jié)果

2.1 MPP+誘導(dǎo)對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激的作用

通過MPP+刺激SH-SY5Y 細(xì)胞構(gòu)建PD 細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比NC 組，MPP+誘導(dǎo)組中細(xì)胞增殖活力降低，見圖1A，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。H2DCF-DA 熒光探針檢測(cè)結(jié)果顯示，MPP+作用增加SH-SY5Y 細(xì)胞中ROS 水平（P<0.001，圖1B 和圖1C）。試劑盒檢測(cè)結(jié)果見圖1D和圖1E，MPP+誘導(dǎo)組中MDA（P<0.001，圖1D）和NADPH 氧化酶活性（P<0.01，圖1E）高于NC 組。對(duì)細(xì)胞質(zhì)和線粒體中細(xì)胞色素c 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖2A），與NC 組相比，MPP+誘導(dǎo)組SH-SY5Y細(xì)胞線粒體中細(xì)胞色素c 表達(dá)降低（P<0.001，圖2B），細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素c 表達(dá)升高（P<0.01，圖2B）。雙染法流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，MPP+刺激組中SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡率高于NC 組（P<0.001，圖2C 和D）。凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)表明，Bcl-2 在MPP+處理組中表達(dá)降低（P<0.01，圖2E 和F），MPP+處理組中Bax 和Cleaved caspase-3 表達(dá)高于對(duì)照組（P<0.01）。由此可知，MPP+誘導(dǎo)抑制SH-SY5Y 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。

2.2 PPF 對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激和凋亡的作用

有研究表明，PPF 可抑制大腦中的氧化應(yīng)激水平，對(duì)氧化損傷的神經(jīng)具有保護(hù)作用[4]。但其對(duì)MPP+刺激引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用尚不清楚。利用不同濃度的PPF 分別刺激SH-SY5Y 細(xì)胞，探討其對(duì)細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激的作用。對(duì)細(xì)胞增殖活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與MPP+組相比，PPF 處理促進(jìn)細(xì)胞的增殖活力（P<0.001），且隨著PPF濃度的增加，細(xì)胞的增殖活力增加，其中40 μM和80 μM PPF 處理對(duì)細(xì)胞增殖活力沒有明顯差異，見圖3A。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H2DCF-DA 探針熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖3B、圖3C，PPF 處理組中ROS濃度降低，20 μM、40 μM 和80 μM 組與未經(jīng)PPF處理組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。對(duì)MDA 和NAGPH 氧化酶水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著刺激細(xì)胞的PPF 濃度增加，細(xì)胞中MDA（P<0.001），見圖3D 和NADPH 氧化酶（P<0.001，圖3E）的水平逐漸降低，40 μM 和80 μM PPF 處理組中MDA 和NADPH 氧化酶濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖3 PPF 調(diào)控MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激Fig.3 PPF regulated MPP+-induced mitochondrial oxidative stress in SH-SY5Y cells

隨后，通過Western blot 檢測(cè)SH-SY5Y 細(xì)胞線粒體和細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素c 的蛋白表達(dá)，見圖4A，相比較于MPP+組，PPF 刺激促進(jìn)線粒體中細(xì)胞色素c 的蛋白表達(dá)（P<0.001），見圖4B，降低細(xì)胞色素c 在細(xì)胞質(zhì)中的水平（P<0.001），見圖4B。對(duì)細(xì)胞凋亡率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PPF 預(yù)處理可減少M(fèi)PP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且40 μM 和80 μM PPF 刺激組細(xì)胞的凋亡率與MPP+組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見圖4C 和圖4D。Western blot結(jié)果顯示，Bcl-2 相對(duì)表達(dá)隨PPF 的濃度升高而升 高（P<0.001，圖4E 和F），Bax 和Cleaved caspase-3 表達(dá)隨PPF 的濃度升高降低，且在40μM 和80 μM PPF 組 中Bcl-2、Bax 和Cleaved caspase-3 相對(duì)表達(dá)與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。由此表明，PPF 通過抑制SHSY5Y 細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激和凋亡，降低MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。

圖4 PPF 調(diào)控MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞中細(xì)胞色素c 和細(xì)胞凋亡Fig.4 PPF regulated MPP+-induced cytochrome c and cell apoptosis in SH-SY5Y cells

3 討論

PD 是一種進(jìn)行性、年齡依賴性神經(jīng)退行性疾病。由于全球人口預(yù)期壽命的延長(zhǎng)，PD 患者的數(shù)量將隨老齡化進(jìn)一步增加，給經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療保健系統(tǒng)增加很大的負(fù)擔(dān)[5]。因此，了解疾病的發(fā)病機(jī)制對(duì)尋找PD 的有效治療方法至關(guān)重要。

3.1 誘導(dǎo)PD 細(xì)胞模型的常見試劑

筆者的研究表明，MPP+誘導(dǎo)可抑制SHSY5Y 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的氧化應(yīng)激并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，還可通過6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）、百草枯、魚藤酮等神經(jīng)毒素誘導(dǎo)PD 細(xì)胞模型。Alarcon-Gil 等[6]利用35 μM 6-OHDA 處理的SH-SY5Y 細(xì)胞存活率明顯降低，凋亡率增加。Yao 等[7]通過2 500 μM MPTP誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞構(gòu)建PD 模型，誘導(dǎo)后的細(xì)胞存活率降低、凋亡增加、線粒體膜電位降低、ROS 水平增加。300 μM/mL 的百草枯誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞可抑制細(xì)胞活力、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和ROS 積累[8]。Han 等[9]利用魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)1～200 μM 魚藤酮可降低細(xì)胞活力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

3.2 氧化應(yīng)激與PD

氧化應(yīng)激在PD 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮主導(dǎo)作用。目前，已經(jīng)有大量研究表明抑制氧化應(yīng)激可緩解PD。過表達(dá)miR-375 可通過抑制SP1，改善PD 大鼠的神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激，促進(jìn)大鼠紋狀體中的多巴胺含量并減輕神經(jīng)元凋亡[10]。恩格列凈可以緩解魚藤酮誘導(dǎo)的PD 大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并增強(qiáng)自噬[11]。抗組胺藥依巴斯汀可通過下調(diào)PD 模型小鼠的氧化應(yīng)激、組胺和炎癥水平，減輕PD 癥狀[12]。注射硒納米顆粒至PD 大鼠可減輕氧化應(yīng)激，降低MDA 水平[13]。白藜蘆醇可充當(dāng)抗氧化劑，提高內(nèi)源性抗氧化狀態(tài)、清除ROS，從而減少PD 的氧化應(yīng)激[14]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)，PPF 預(yù)處理可減輕MPP+誘導(dǎo)對(duì)HY-SY5Y 細(xì)胞增殖的抑制作用，降低細(xì)胞中ROS、MDA 以及NADPH 水平，減少細(xì)胞凋亡。

3.3 PPF 與氧化損傷

PPF 是常見的靜脈鎮(zhèn)靜藥物，具有起效快、消除快、作用持續(xù)時(shí)間短、麻醉恢復(fù)快、不良反應(yīng)發(fā)生率低、無致畸和致突變作用等特點(diǎn)，是臨床上廣泛使用的靜脈鎮(zhèn)靜劑。研究發(fā)現(xiàn)，PPF 具有抗氧化特性，可通過降低氧化應(yīng)激對(duì)腦缺血再灌注損傷[15]、心肌梗死[16]、PD 大鼠[4]等氧化損傷起保護(hù)作用。在心肌缺血再灌注損傷中，PPF可減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的氧化損傷、炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡[16]。PPF 通過減少促炎細(xì)胞因子的分泌、乙酰膽堿酯酶活性以及氧化應(yīng)激水平，保護(hù)大鼠腦室內(nèi)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)元損傷[17]。在順鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變大鼠中，PPF 可增加內(nèi)源性抗氧化劑，減少脂質(zhì)過氧化以及炎癥水平，對(duì)順鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性發(fā)揮保護(hù)作用[18]。筆者發(fā)現(xiàn)40 μM 和80 μM PPF 預(yù)處理后，MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞增殖活性相比于對(duì)照組增加，氧化應(yīng)激水平和凋亡率明顯降低，表明PPF 可能通過抑制氧化應(yīng)激對(duì)PD 模型細(xì)胞具有保護(hù)作用。同時(shí)，Wang 等[19]也表明，PPF可緩解MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。高青等[20]發(fā)現(xiàn)，PPF 可通過激活Nrf2 抑制RAGE/NF-κB 信號(hào)通路，抑制PD 大鼠腦黑質(zhì)區(qū)的神經(jīng)炎性因子，改善大鼠認(rèn)知障礙。對(duì)于需要全身麻醉的PD 患者，具有神經(jīng)保護(hù)及抗氧化作用的PPF 對(duì)需要全身麻醉的PD 患者具有良好優(yōu)勢(shì)。然而，PPF 對(duì)PD 中氧化應(yīng)激的具體調(diào)節(jié)機(jī)制需要在未來的研究中進(jìn)一步探索。

綜上所述，MPP+刺激可抑制SH-SY5Y 細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。PPF 預(yù)處理可明顯緩解細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡，對(duì)MPP+處理的細(xì)胞具有保護(hù)作用。