丙泊酚調節MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞線粒體氧化應激和凋亡

譚 瑩 ，秦海燕 ，孫 翔 ，蘇彥伊 ，王英寶

（1）昆明醫科大學第一附屬醫院麻醉科，云南 昆明 650032;2）昆明市延安醫院泌尿外科，云南 昆明 650051）

帕金森（Parkinson's disease，PD）是α-突觸核蛋白聚集介導的黑質致密性多巴胺能神經元丟失的神經退行性疾病，可導致運動和非運動癥狀，運動癥狀的特征是運動障礙，包括運動遲緩、靜止性震顫和肌肉強直，非運動癥狀包括認知障礙、抑郁、焦慮、嗅覺和味覺減退以及睡眠障礙等[1]。流行病學研究顯示，60 歲以上人群的PD 發病率增加，80 歲以上人群的發病率達3%，且男性的PD 發病率高于女性[2]。隨著人口老齡化的加重，全球范圍內PD 的發病率也在逐漸升高。然而，目前尚沒有治愈PD 的有效方法。

氧化應激誘導的穩態失衡是多種神經退行性疾病的常見特征。一般認為氧化應激主要由活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮等強氧化性自由基引起。ROS 主要在線粒體中產生，ROS 增多可能會使細胞的氧化還原平衡轉向氧化狀態，促進細胞的氧化應激水平，使線粒體中的大分子受到氧化損傷，損傷大分子的積聚進一步導致細胞的基本功能受損并激活細胞死亡途徑，最終引起細胞死亡。臨床研究表明，PD 患者氧化應激水平升高[3]。因此，抑制氧化應激水平可能是PD 治療的關鍵途徑。

丙泊酚（propofol，PPF）是臨床常用的全身靜脈麻醉劑，具有抗氧化活性。研究發現，PPF 刺激可減少PD 大鼠大腦中的氧化應激，具有氧化損傷的神經保護作用[4]。本研究通過MPP+誘導PD 細胞模型，探討不同濃度的PPF 預處理對PD模型細胞氧化應激的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

細胞完全培養基購自南京科佰生物科技有限公司。1 mM MPP+購自美國Sigma-Aldrich。PPF購自美國Merck。CCK-8 試劑盒、H2DCF-DA 熒光探購自美國MedChemExpress。MDA 和NADPH氧化酶測定試劑盒購自南京建成。細胞質蛋白提取試劑盒購自上海澤葉生物，線粒體蛋白提取試劑盒購自北京百奧萊博。兔抗細胞色素c、GAPDH、Bcl-2、Bax 抗體、山羊抗兔二抗購自北京博奧森。兔抗COX4 和Cleaved caspase-3 抗體購自Abcam。Annexin V-FITC/PI 試劑盒購自美侖生物。

1.2 細胞及細胞培養

人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y 購自南京科佰。細胞培養于細胞完全培養基（含1%非必需氨基酸、1 mM 丙酮酸鈉以及10%胎牛血清），放入5% CO2細胞培養箱培養，每2 d 更換一次新鮮培養液。

1.3 細胞處理

狀態良好的SH-SY5Y 細胞，經消化后接種至新的培養板，將1mM MPP+加至培養液中，輕輕搖勻。將培養板放入細胞培養箱，培養24 h 以誘導PD 細胞模型。

MPP++10 μM PPF 組、MPP++20 μM PPF 組、MPP++40 μM PPF 組、MPP++80 μM PPF 組SHSY5Y 細胞在經MPP+處理前，分別培養于含10、20、40、80 μM PPF 的培養基內4 h。棄去培養液，再將細胞轉移至含1 mM MPP+的培養基中培養24 h。NC 組細胞常規培養，不進行MPP+和PPF 處理。

1.4 CCK-8 檢測細胞增殖

處理完成的各組細胞接種至96 孔板，置于細胞培養箱過夜培養，向每孔中加入含10 μL 的CCK-8 溶液100 μL，37 ℃孵育2 h，酶標儀測定吸光度值（450 nm）。

1.5 ROS 水平

H2DCF-DA 熒光探針用于檢測SH-SY5Y 細胞中ROS 的水平。經MPP+或PPF 處理后的細胞，用PBS 漂洗2 次，加入含20 μM H2DCF-DA 的PBS 與細胞37 ℃避光孵育30 min。洗滌后，利用流式細胞儀檢測熒光強度。

1.6 MDA 和NADPH 氧化酶活性檢測

MDA 和NADPH 氧化酶檢測試劑盒用于檢測SH-SY5Y 細胞中MDA 和NADPH 氧化酶水平。

MDA：根據試劑盒說明書，配置MDA 的三號試劑并用50%冰醋酸按2∶1 稀釋。各組中的細胞經超速離心使其破裂，使用前搖勻。分別向離心管中加入等量的待測樣品和試劑一、1.5 mL 試劑二、1.5 mL 試劑三，混勻后95 ℃水浴40 min，冷卻后4 000 r/min，離心10 min，取上清測定吸光度值。

NADPH 氧化酶：試劑盒中的試劑一和三用于裂解細胞，離心后取上清。再用10 000 r/min，離心10 min，下層沉淀中加入試劑二和試劑三，利用超聲波處理90 s（每超聲3s 間隔10 s）。取40 μL樣本中分別試劑四（700 μL）、五（100 μL）、六（160 μL），混勻。分光光度計檢測600 nm 處20 s（A1）和80 s（A2）的吸光度值。ΔA=A1-A2。

1.7 Western blot 檢測細胞色素c 以及Bcl-2、Bax 和Cleaved caspase-3 蛋白表達

收集對照組、MPP+以及MPP+和PPF 處理后的SH-SY5Y 細胞，分別利用細胞質蛋白和線粒體蛋白提取試劑盒提取細胞質和線粒體中的蛋白。采用聚丙烯酰氨凝膠電泳法將蛋白樣品按分子量分離并轉移至PVDF 中。轉移后的蛋白與5%脫脂牛奶在室溫中封閉2 h，漂洗后與一抗（兔抗細胞色素c 抗體1∶1 000，兔抗GAPDH 抗體1∶10 000，兔抗COX4 1 μg/mL，兔抗Bcl-2 1∶1 000，兔抗Bax 1∶1 000，1∶兔抗Cleaved caspase-3 1∶500）在4 ℃條件中孵育過夜，洗滌，再分別與山羊抗兔二抗室溫孵育2 h。增強化學發光試劑處理后，凝膠成像儀顯影。GAPDH 作為細胞質及全細胞蛋白檢測的內參，COX4 作為線粒體蛋白檢測內參。Image J 軟件分析目的蛋白。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡率

利用Annexin V-FITC/PI 試劑盒檢測凋亡率。收集處理后的各組細胞，室溫中用Annexin VFITC 染色10 min，洗滌后用PI 試劑染色10 min。流式細胞儀分析凋亡細胞比例。

1.9 統計學處理

所有數據均表示為“均數±標準差”。獨立樣本t檢驗分析2 組間差異。單因素方差分析多組間差異，Tukey's 事后檢驗用于多組間的進一步兩兩比較。P<0.05 認為差異存在統計學意義。所有數據分析和繪圖利用GraphPad Prism 8.0 完成。

2 結果

2.1 MPP+誘導對SH-SY5Y 細胞線粒體氧化應激的作用

通過MPP+刺激SH-SY5Y 細胞構建PD 細胞模型，實驗檢測發現，相比NC 組，MPP+誘導組中細胞增殖活力降低，見圖1A，差異有統計學意義（P<0.001）。H2DCF-DA 熒光探針檢測結果顯示，MPP+作用增加SH-SY5Y 細胞中ROS 水平（P<0.001，圖1B 和圖1C）。試劑盒檢測結果見圖1D和圖1E，MPP+誘導組中MDA（P<0.001，圖1D）和NADPH 氧化酶活性（P<0.01，圖1E）高于NC 組。對細胞質和線粒體中細胞色素c 檢測發現（圖2A），與NC 組相比，MPP+誘導組SH-SY5Y細胞線粒體中細胞色素c 表達降低（P<0.001，圖2B），細胞質中細胞色素c 表達升高（P<0.01，圖2B）。雙染法流式細胞術結果表明，MPP+刺激組中SH-SY5Y 細胞凋亡率高于NC 組（P<0.001，圖2C 和D）。凋亡相關蛋白表達表明，Bcl-2 在MPP+處理組中表達降低（P<0.01，圖2E 和F），MPP+處理組中Bax 和Cleaved caspase-3 表達高于對照組（P<0.01）。由此可知，MPP+誘導抑制SH-SY5Y 細胞增殖，誘導細胞氧化應激和凋亡。

2.2 PPF 對MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞線粒體氧化應激和凋亡的作用

有研究表明，PPF 可抑制大腦中的氧化應激水平，對氧化損傷的神經具有保護作用[4]。但其對MPP+刺激引起的細胞氧化應激的作用尚不清楚。利用不同濃度的PPF 分別刺激SH-SY5Y 細胞，探討其對細胞線粒體氧化應激的作用。對細胞增殖活力檢測發現，與MPP+組相比，PPF 處理促進細胞的增殖活力（P<0.001），且隨著PPF濃度的增加，細胞的增殖活力增加，其中40 μM和80 μM PPF 處理對細胞增殖活力沒有明顯差異，見圖3A。流式細胞術檢測H2DCF-DA 探針熒光強度，結果見圖3B、圖3C，PPF 處理組中ROS濃度降低，20 μM、40 μM 和80 μM 組與未經PPF處理組相比差異有統計學意義（P<0.001）。對MDA 和NAGPH 氧化酶水平檢測發現，隨著刺激細胞的PPF 濃度增加，細胞中MDA（P<0.001），見圖3D 和NADPH 氧化酶（P<0.001，圖3E）的水平逐漸降低，40 μM 和80 μM PPF 處理組中MDA 和NADPH 氧化酶濃度差異無統計學意義（P>0.05）。

圖3 PPF 調控MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞線粒體氧化應激Fig.3 PPF regulated MPP+-induced mitochondrial oxidative stress in SH-SY5Y cells

隨后，通過Western blot 檢測SH-SY5Y 細胞線粒體和細胞質中細胞色素c 的蛋白表達，見圖4A，相比較于MPP+組，PPF 刺激促進線粒體中細胞色素c 的蛋白表達（P<0.001），見圖4B，降低細胞色素c 在細胞質中的水平（P<0.001），見圖4B。對細胞凋亡率檢測發現，PPF 預處理可減少MPP+誘導的細胞凋亡，且40 μM 和80 μM PPF 刺激組細胞的凋亡率與MPP+組相比差異有統計學意義（P<0.001），見圖4C 和圖4D。Western blot結果顯示，Bcl-2 相對表達隨PPF 的濃度升高而升 高（P<0.001，圖4E 和F），Bax 和Cleaved caspase-3 表達隨PPF 的濃度升高降低，且在40μM 和80 μM PPF 組 中Bcl-2、Bax 和Cleaved caspase-3 相對表達與對照組相比差異有統計學意義（P<0.001）。由此表明，PPF 通過抑制SHSY5Y 細胞線粒體氧化應激和凋亡，降低MPP+誘導的神經毒性。

圖4 PPF 調控MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞中細胞色素c 和細胞凋亡Fig.4 PPF regulated MPP+-induced cytochrome c and cell apoptosis in SH-SY5Y cells

3 討論

PD 是一種進行性、年齡依賴性神經退行性疾病。由于全球人口預期壽命的延長，PD 患者的數量將隨老齡化進一步增加，給經濟和醫療保健系統增加很大的負擔[5]。因此，了解疾病的發病機制對尋找PD 的有效治療方法至關重要。

3.1 誘導PD 細胞模型的常見試劑

筆者的研究表明，MPP+誘導可抑制SHSY5Y 細胞的增殖，促進細胞的氧化應激并誘導細胞凋亡。此外，還可通過6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）、百草枯、魚藤酮等神經毒素誘導PD 細胞模型。Alarcon-Gil 等[6]利用35 μM 6-OHDA 處理的SH-SY5Y 細胞存活率明顯降低，凋亡率增加。Yao 等[7]通過2 500 μM MPTP誘導PC12 細胞構建PD 模型，誘導后的細胞存活率降低、凋亡增加、線粒體膜電位降低、ROS 水平增加。300 μM/mL 的百草枯誘導SH-SY5Y 細胞可抑制細胞活力、促進細胞凋亡和ROS 積累[8]。Han 等[9]利用魚藤酮誘導SH-SY5Y 細胞，發現1～200 μM 魚藤酮可降低細胞活力并促進細胞凋亡。

3.2 氧化應激與PD

氧化應激在PD 的發生和發展中發揮主導作用。目前，已經有大量研究表明抑制氧化應激可緩解PD。過表達miR-375 可通過抑制SP1，改善PD 大鼠的神經炎癥和氧化應激，促進大鼠紋狀體中的多巴胺含量并減輕神經元凋亡[10]。恩格列凈可以緩解魚藤酮誘導的PD 大鼠內質網應激并增強自噬[11]?？菇M胺藥依巴斯汀可通過下調PD 模型小鼠的氧化應激、組胺和炎癥水平，減輕PD 癥狀[12]。注射硒納米顆粒至PD 大鼠可減輕氧化應激，降低MDA 水平[13]。白藜蘆醇可充當抗氧化劑，提高內源性抗氧化狀態、清除ROS，從而減少PD 的氧化應激[14]。筆者的研究發現，PPF 預處理可減輕MPP+誘導對HY-SY5Y 細胞增殖的抑制作用，降低細胞中ROS、MDA 以及NADPH 水平，減少細胞凋亡。

3.3 PPF 與氧化損傷

PPF 是常見的靜脈鎮靜藥物，具有起效快、消除快、作用持續時間短、麻醉恢復快、不良反應發生率低、無致畸和致突變作用等特點，是臨床上廣泛使用的靜脈鎮靜劑。研究發現，PPF 具有抗氧化特性，可通過降低氧化應激對腦缺血再灌注損傷[15]、心肌梗死[16]、PD 大鼠[4]等氧化損傷起保護作用。在心肌缺血再灌注損傷中，PPF可減輕異丙腎上腺素誘導的氧化損傷、炎癥反應和心肌細胞凋亡[16]。PPF 通過減少促炎細胞因子的分泌、乙酰膽堿酯酶活性以及氧化應激水平，保護大鼠腦室內鏈脲佐菌素誘導的認知功能障礙和神經元損傷[17]。在順鉑誘導的周圍神經病變大鼠中，PPF 可增加內源性抗氧化劑，減少脂質過氧化以及炎癥水平，對順鉑誘導的神經毒性發揮保護作用[18]。筆者發現40 μM 和80 μM PPF 預處理后，MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞增殖活性相比于對照組增加，氧化應激水平和凋亡率明顯降低，表明PPF 可能通過抑制氧化應激對PD 模型細胞具有保護作用。同時，Wang 等[19]也表明，PPF可緩解MPP+誘導的神經毒性。高青等[20]發現，PPF 可通過激活Nrf2 抑制RAGE/NF-κB 信號通路，抑制PD 大鼠腦黑質區的神經炎性因子，改善大鼠認知障礙。對于需要全身麻醉的PD 患者，具有神經保護及抗氧化作用的PPF 對需要全身麻醉的PD 患者具有良好優勢。然而，PPF 對PD 中氧化應激的具體調節機制需要在未來的研究中進一步探索。

綜上所述，MPP+刺激可抑制SH-SY5Y 細胞的增殖、誘導氧化應激和細胞凋亡。PPF 預處理可明顯緩解細胞的氧化應激和凋亡，對MPP+處理的細胞具有保護作用。