異黃酮與β-伴大豆球蛋白的相互作用及其對蛋白結構和潛在致敏性的影響

鄧 雯，廖雅如，黃麗衡，楊安樹,2,*，陳紅兵,2

（1.南昌大學 食品科學與資源挖掘全國重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學中德聯合研究院，江西 南昌 330047）

大豆營養豐富，蛋白質含量高，是人們日常飲食中重要的蛋白質來源[1]。但大豆又是常見的過敏食物之一，目前仍沒有可完全治愈大豆過敏的方法，患者最有效的方法是規避攝入大豆過敏原[2]。β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin，BCG）是大豆中的主要過敏原之一[3]。迄今為止，工業上使用的任何單一的食品加工處理都不能完全消除大豆的致敏性[4]，而且還極易破壞大豆的營養成分與功能特性[5]。所以，尋找安全有效的新型方法降低大豆致敏性具有重要意義。大豆異黃酮是一種植物類雌激素[6]，其中活性成分主要為染料木素（genistein，Gen）、大豆苷元（daidzein，Dai）和黃豆黃素（glycitein，Gly），具有抗氧化[7]、抗過敏、預防骨質疏松、防癌抗癌等功效[8]。研究顯示，大豆異黃酮可以調節Th1/Th2平衡、減少免疫因子合成、加強人體對致敏食物的耐受[9]。有研究表明，大豆異黃酮可顯著減少花生過敏小鼠的肥大細胞脫顆粒，有效緩解小鼠過敏癥狀的發生[10]。迄今為止，黃酮類化合物抗過敏的相關報道，多數文獻主要圍繞黃酮類化合物本身開展抗過敏作用研究，一般通過調節機體免疫系統的平衡和減少效應細胞中活性介質的釋放來緩解過敏反應。近年來，從食物組分干預的角度研究抗過敏作用受到廣泛關注，如通過主要過敏蛋白與多酚類、黃酮類活性物質發生相互作用，可降低花生過敏蛋白的致敏性[11-12]。由于不同種類異黃酮與不同過敏蛋白的相互作用機制及其對復合物結構與致敏性的影響也存在差異，大豆異黃酮能否改變大豆中主要過敏原蛋白的結構從而影響其致敏性，有待進一步研究。

本研究以Gen、Dai 2 種活性異黃酮和BCG為研究對象，利用熒光光譜法分析異黃酮與蛋白相互作用機制及其復合物的結構，并利用競爭酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法和免疫印跡評估復合物及其消化產物的致敏性，以期在分子水平為活性大豆異黃酮與BCG相互作用機制提供新的見解，并為其在食物過敏預防和管理中的潛在應用提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BCG（純度為84.1%）實驗室自制；Gen、Dai（純度≥98%）上海源葉生物科技有限公司；苯氨基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、胃蛋白酶、胰蛋白酶、生物素標記的羊抗人免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）美國Sigma公司；大豆過敏患者血清（詳細信息見表1）重慶曼紐艾克科技有限公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的鏈霉親和素 深圳欣博盛生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

表1 大豆過敏患者血清信息Table 1 Sera information about soybean allergic patients participating in this study

1.2 儀器與設備

F-4600熒光分光光度計 日本Hitachi公司；Varioskan LUX多功能酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；MOS-450圓二色光譜儀 法國Bio-Logi公司；UV WinLab紫外分光光度計 美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光猝滅光譜分析

首先掃描BCG樣品（2×10-6mol/L）的熒光光譜，再依次將60 μL異黃酮溶液（2×10-4mol/L）等分10 次加入，掃描混合溶液的熒光光譜。同時掃描磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的熒光光譜作為空白對照，并扣除相應濃度異黃酮溶液的熒光。光譜條件：在溫度298 K和314 K下，設定激發波長（λex）為280 nm，發射波長（λem）為250～500 nm，狹縫寬度為2.5 nm，固定掃描速率為1 200 nm/min。分別以Gen、Dai濃度為橫坐標、F0/F為縱坐標擬合得到Stern-Volmer曲線進行分析，方程如式（1）所示：

式中：F和F0分別為有、無猝滅劑時的大分子熒光強度；[Q]為淬滅劑濃度/（mol/L）；KSV為猝滅常數/（L/（mol·s））；Kq為生物分子的猝滅速率常數/（L/mol）；τ0為無猝滅劑時生物大分子的平均壽命（10-8s）。

1.3.2 同步熒光光譜分析

在Δλ=15/60 nm 條件下，掃描BCG 溶液（2×10-6mol/L）的同步熒光光譜，再將60 μL異黃酮溶液（2×10-4mol/L）分5 次加入，每次加入后靜置3 min后，依次掃描混合溶液的熒光光譜，并扣除相應濃度異黃酮溶液的熒光。

1.3.3 三維熒光光譜分析

配制BCG與異黃酮物質的量比分別為1∶1、1∶10、1∶20的混合溶液，以PBS作為空白對照，掃描其三維熒光光譜，并扣除相應濃度異黃酮溶液的熒光。掃描條件為：激發波長200～400 nm，發射波長200～600 nm，光譜采集間距5 nm，溫度298 K。

1.3.4 外源性熒光光譜分析

室溫條件下，配制不同濃度異黃酮溶液，分別加入BCG溶液（0.2 mg/mL）中，得到不同物質的量比混合溶液，靜置2 h。將20 μL 5 mmol/L ANS溶液加入2 mL混合溶液中，黑暗條件下反應30 min后，掃描疏水性熒光光譜，并扣除相應濃度異黃酮溶液的熒光。掃描條件為：激發波長390 nm，發射波長400～600 nm。

1.3.5 圓二色光譜分析

配制不同濃度異黃酮溶液，加入BCG溶液（0.2 mg/mL）中，得到不同物質的量比混合溶液，靜置2 h后掃描圓二色光譜。設置掃描范圍為190～250 nm，光徑為1 mm，掃描速率為60 nm/min，掃描間隔為1 nm，相關結果利用圓二色光譜在線分析網站（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml）進行整理分析。

1.3.6 異黃酮-BCG復合物的制備

復合物制備參考Sui Xiaonan等[13]的方法，主要步驟如下：1）堿性復合物：用PBS（pH 9.0）將BCG稀釋至4 mg/mL，將異黃酮溶液稀釋至0.4 mmol/L后邊攪拌邊加入蛋白溶液中，調節混合溶液pH值為9.0，室溫攪拌反應24 h后超濾除去游離異黃酮；2）中性復合物：與堿性復合物制備大致相同，但略有改動。BCG溶液和異黃酮稀釋后不調節pH值，攪拌反應時間為2 h。

將BCG在堿性條件下分別與Gen、Dai制備的復合物標注為BCG-Gen-A、BCG-Dai-A，在中性條件下分別與Gen、Dai制備的復合物標注為BCG-Gen-N、BCGDai-N。

1.3.7 競爭ELISA

參考張英[14]方法，采用競爭抑制ELISA法檢測BCG及其復合物與大豆過敏患者血清特異性IgE的結合能力。通過方陣滴定法確定蛋白的包被質量濃度為0.4 μg/mL，大豆過敏患者血清（一抗）稀釋倍數為1∶35，生物素標記的羊抗人IgE（二抗）稀釋倍數為1∶10 000，HRP標記的鏈霉親和素稀釋倍數為1∶300。用酶標儀檢測樣品在450 nm波長處的光密度（OD450nm），按式（2）計算抑制率，IgE結合能力以半抑制質量濃度（50% inhibiting concentration，IC50）表示。

1.3.8 復合物體外模擬胃腸消化

包括模擬嬰幼兒胃腸消化和模擬成人胃腸消化，參考Dupont[15]、孟軒夷[16]等的方法并稍作修改。

1.3.8.1 模擬嬰幼兒胃腸消化

模擬胃消化：在離心管中分別加入5 mL的BCG及復合物（2 mg/mL）。將6.9 mL KCl溶液（0.5 mol/L）、12.5 mL NaHCO3溶液（1 mol/L）、11.8 mL NaCl溶液（2 mol/L）、0.9 mL KH2PO4溶液（0.5 mol/L）、0.4 m L M g C l2(H2O)6溶液（0.1 5 m o l/L）和0.5 mL (NH4)2CO3溶液（0.15 mol/L）混勻，調節pH值為3.0，定容至500 mL配制成胃儲液，加入4.909 mL胃儲液和91 μL胃蛋白酶（2 500 U/mL），調節pH值至3.0，將所有樣品置于搖床（37 ℃、100 r/min）中消化反應2 h，滴加NaHCO3調節溶液pH值至7.0終止反應。

模擬腸消化：在離心管中加入5 mL胃消化后的樣品。將6.8 mL KCl溶液（0.5 mol/L）、42.5 mL NaHCO3溶液（1 mol/L）、9.6 mL NaCl溶液（2 mol/L）、0.8 mL KH2PO4溶液（0.5 mol/L）和1.1 mL MgCl2(H2O)6溶液（0.15 mol/L）混勻，調節pH值為6.5，定容至500 mL配制成腸儲液，通過加入4.94 mL腸儲液、35 μL胰酵素（2.5 mg/mL）和25 μL CaCl2(H2O)2（0.3 mol/L）溶液模擬腸消化環境，調節溶液pH值至6.5后，將所有樣品置于搖床中反應2 h，沸水浴加熱5 min結束消化。

1.3.8.2 模擬成人胃腸消化

實驗步驟與嬰幼兒胃腸消化類似，實驗參數略有改動。成人胃消化：胃蛋白酶活力為182 U/mg，pH值為2.5。成人腸消化：胰蛋白酶活力為35 U/mg，pH值為6.5。

1.3.9 復合物消化產物免疫印跡

參考常雪嬌[17]方法對BCG胃腸消化產物進行免疫印跡鑒定。將胃腸消化產物經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電泳凝膠洗滌后在轉印儀上進行轉膜，設置轉膜電壓100 V，電流400 mA，時間60 min，轉膜結束后在室溫下封阻1 h；加入大豆過敏患者血清（一抗，1∶10）后，4 ℃孵育過夜，含0.1% Tween-20的Tris緩沖液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）漂洗3 次；加入生物素標記的羊抗人IgE（二抗，1∶2 500），室溫孵育60 min，TBST漂洗3 次；滾動孵育HRP標記的鏈霉親和素（1∶60稀釋）60 min，TBST漂洗3 次；再使用增強型化學發光顯色劑顯色，并立即用凝膠成像系統拍照。

1.4 數據處理

所有實驗均重復測定3 次。采用Excel軟件對實驗所得數據進行處理，采用SPSS 26.0軟件進行差異顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著，通過Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 異黃酮與BCG相互作用

2.1.1 熒光猝滅機制

通過熒光猝滅光譜分析Gen/Dai與BCG相互作用的猝滅機制。由圖1中Stern-Vlomer圖可以觀察到，隨著Gen和Dai添加量的增加，蛋白熒光強度呈線性下降趨勢。根據表2中數據，在298 K和314 K條件下加入Gen和Dai后，BCG的Kq均遠大于2.0×1010L/（mol·s）（最大擴散碰撞猝滅常數）[18]，說明2 種活性異黃酮與BCG發生的猝滅屬于靜態猝滅[19-20]。靜態猝滅是多酚類化合物與蛋白結合的常見猝滅方式，在多酚-玉米醇溶蛋白[21]、白藜蘆醇-大豆分離蛋白（soybean protein isolated，SPI）[22]以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯-SPI[23]相互作用的研究中均有體現。

圖1 Gen（A、B）和Dai（C、D）對BCG熒光猝滅的影響Fig.1 Effects of Gen (A and B) and Dai (C and D) on the fluorescence quenching of BCG

表2 異黃酮與BCG結合的相關常數和熱力學參數Table 2 Kinetic constants and thermodynamic parameters of the interaction between isoflavones and BCG

根據Scatchard方程可計算得到BCG與Gen/Dai的結合常數（Ka）和結合位點數（n）（表2）。溫度升高，2 種活性異黃酮與BCG之間的Ka均增大，并且不同溫度的n都接近1，表明BCG與Gen/Dai在空間結構上至少存在1 個結合位點。

生物大分子與小分子之間存在的非共價作用力主要有氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和范德華力，由熱力學參數（ΔS、ΔH和ΔG）可以推斷蛋白質與小分子之間相互作用力的類型。通過Van’t Hoff方程計算可得到相互作用的熱力學參數（表2）。按照Ross等[24]總結的熱力學參數與相互作用力之間的規律，表2中ΔH、ΔS均為正值，表明BCG與Gen、Dai的相互作用力中疏水相互作用起主要作用。這可能是因為Gen/Dai含有碳碳雙鍵和苯環等疏水基團，這些基團與BCG中的疏水基團或結構域發生疏水相互作用。類似地，疏水相互作用也是姜黃素與SPI[25]、VB12與大豆7S/11S蛋白[26]結合的主要驅動力。

2.1.2 同步熒光光譜

同步熒光光譜通過同步掃描λex和λem可以提供生色團分子附近微環境的信息。當波長間隔Δλ為15、60 nm時，同步熒光分別體現出酪氨酸（Tyr）或色氨酸（Trp）殘基微環境的變化[27]。由圖2可知，蛋白熒光強度隨著Gen/Dai的加入逐漸降低，當Δλ為15 nm時，可以觀察到Gen僅對BCG中Tyr殘基的最大吸收波長向長波方向移動了1 nm，而添加Dai后，最大吸收波長并未出現明顯移動；當Δλ為60 nm時，Gen使BCG中Trp特征峰紅移14.6 nm，而Dai使其紅移4 nm。某些關鍵氨基酸決定了蛋白質的結構和功能，這些氨基酸微環境的改變會導致蛋白質整體結構發生相應變化[28]，同步熒光光譜的結果表明，蛋白中酪氨酸和色氨酸周圍環境的極性增加，BCG與2 種異黃酮發生絡合作用，從而使蛋白結構更加松散，使其內部更多的親水性氨基酸暴露[29]。由于2 種異黃酮結構存在差異，Gen比Dai多1 個酚羥基，且多出的酚羥基在空間位置上更接近羰基，導致Gen的活性更強，因此對BCG氨基酸殘基微環境的影響比Dai更明顯[30]。

圖2 Gen（A、B）和Dai（C、D）對BCG同步熒光光譜的影響Fig.2 Effects of Gen (A and B) and Dai (C and D) on the synchronous fluorescence spectrum of BCG

2.1.3 三維熒光光譜

為進一步了解Gen/Dai對BCG構象的影響，運用三維熒光光譜進行分析，由圖3和表3可知，在λex＝295 nm和λex＝282 nm處，BCG的三維熒光光譜顯示出2 個峰。根據峰位置分析，峰a（λex＝295 nm）和峰b（λex＝282 nm）是BCG中Tyr或Trp殘基的2 個特征峰[31]。隨著2 種活性異黃酮的添加，峰a和峰b的峰高都明顯降低。相較于Dai，Gen對峰a的影響更為顯著，當BCG∶Gen＝1∶10時，峰a完全消失。逐漸添加Gen后，峰b的λem發生紅移；而Dai加入后，峰b從原來的282 nm/323 nm紅移至284 nm/325 nm和287 nm/325 nm，同時中高劑量異黃酮誘導蛋白產生了一個新的峰c（377 nm/380 nm）。以上信息表明，異黃酮的加入促使BCG的特征峰產生紅移，誘導蛋白質結構發生輕微的去折疊或適應性重排[32]，引起氨基酸微環境的極性增加，導致蛋白構象發生變化[33]。

圖3 異黃酮對BCG三維熒光光譜的影響Fig.3 Effects of isoflavones on the three-dimensional fluorescence spectrum of BCG

表3 BCG與活性異黃酮相互作用后三維熒光光譜峰位置和峰強度Table 3 Three-dimensional fluorescence peak positions and intensities of BCG-isoflavone complexes

2.1.4 外源性熒光光譜

同步熒光與三維熒光光譜展示了蛋白氨基酸微環境的變化，外源性熒光光譜主要是從整體上體現蛋白質表面疏水性的強弱。蛋白質表面疏水性是支撐蛋白質空間結構穩定必不可少的部分，對蛋白質的結構和功能性質有極其重要的影響[34]。ANS是一種疏水性熒光探針，在水溶液中其熒光強度很微弱，但與蛋白質的疏水區域結合時，其熒光強度顯著增強。因此可采用ANS熒光探針作為標記物，檢測2 種活性異黃酮添加量變化對BCG表面疏水性的影響。由圖4可知，當BCG與Gen物質的量比為1∶1時，BCG表面疏水性明顯增加；而隨著Gen濃度增大，BCG表面疏水性又減小，即中、高劑量（10、20 倍）的Gen使BCG的表面疏水性明顯降低。添加Dai對BCG表面疏水性的影響與劑量之間的規律不明顯，BCG與Dai物質的量比為1∶1和1∶20時，BCG的疏水性顯著增加，而BCG與Dai物質的量比為1∶10時，BCG表面疏水性顯著減小。

圖4 異黃酮對BCG表面疏水性的影響Fig.4 Effects of isoflavones on the surface hydrophobicity of BCG

2.1.5 圓二色光譜

α-螺旋結構的圓二色光譜在190 nm附近有一正峰，在222、208 nm波長處有2 個負峰；β-折疊結構在216 nm波長處有一負峰，在185～200 nm波長處有一正峰[35]。由圖5可知，當BCG∶Gen＝1∶1時，在蛋白二級結構中，α-螺旋相對含量略有升高，但當Gen濃度繼續增加后，α-螺旋和β-轉角相對含量明顯下降；而β-折疊相對含量隨著Gen的添加顯著增加。同時Dai的添加使蛋白中β-折疊相對含量顯著減少，而β-轉角相對含量顯著提高。隨Dai濃度的升高，蛋白的無規卷曲相對含量則表現出先降低后升高的變化。綜上所述，Gen的添加使得BCG的二級結構組成呈現出從α-螺旋、β-轉角轉化為β-折疊的趨勢；Dai的添加使BCG的結構呈現從β-折疊轉化為β-轉角的趨勢，這在矢車菊素-3-O-葡萄糖苷與7S/11S蛋白相互作用研究中也有所體現[36]，使蛋白質結構更為松散。二級結構的變化與前文熒光光譜的研究結果結合，可以看出異黃酮的添加使BCG的結構更為疏松，內部緊湊的基團暴露在外部環境中。

圖5 異黃酮對BCG二級結構的影響Fig.5 Effects of isoflavones on the secondary structure of BCG

2.2 異黃酮-BCG復合物結構及潛在致敏性

2.2.1 復合物的結構

由圖6A、B可知，相較于原蛋白，2 種活性異黃酮與蛋白形成復合物的二級結構中α-螺旋相對含量略有升高，占主要地位的β-折疊相對含量均降低。由于結合方式與異黃酮種類不同，2 種復合物結構變化仍有差別，BCG-Gen復合物主要表現為β-轉角相對含量顯著升高，而BCG-Dai復合物表現為無規卷曲相對含量顯著升高。

圖6 異黃酮-BCG復合物的結構表征Fig.6 Structure of isoflavone-BCG complexes

蛋白質在280 nm處的吸收峰主要由芳香族氨基酸（如Tyr和Trp）的π-π*躍遷引起[33]，可以提供有關蛋白質三級結構的信息。由圖6C可知，與原蛋白相比，BCG-Gen-A和BCG-Dai-N在280 nm處的吸收峰強度增強，而BCG-Gen-N和BCG-Dai-A吸收峰強度減弱。這表明BCG-Gen-A和BCG-Dai-N的蛋白展開程度變大，使得Tyr和Trp殘基暴露在蛋白質表面，導致紫外吸收峰強度增加[28]；而BCG-Gen-N和BCG-Dai-A暴露在表面的芳香族氨基酸殘基數量有所減少，可能是因為復合物的二級結構組成發生了較大的變化，導致芳香族氨基酸的分布出現差異。

由圖6D可知，相較于原蛋白，BCG-Gen-A、BCGDai-A與BCG-Dai-N的表面疏水性增強，疏水基團暴露；而BCG-Gen-N的表面疏水性明顯減小。

2.2.2 復合物的潛在致敏性

為探究復合物潛在致敏性，采用競爭ELISA評估BCG及其復合物的特異性IgE結合能力，以IC50表示，IC50越大，樣品與IgE的結合能力越弱。由圖7A可知，復合物的IC50均顯著變小（P＜0.05），其中堿性復合物的IC50變化尤為顯著，即BCG與2 種異黃酮復合物的致敏性增強，特別是堿性復合物。

圖7 異黃酮-BCG復合物的潛在致敏性Fig.7 Potential allergenicity of isoflavone-BCG complexes

通過免疫印跡法鑒定BCG及其復合物消化產物的潛在致敏性。由圖7B～E可知，蛋白及復合物消化后存在已被降解的小分子，以及未被消化的蛋白β亞基和大分子聚合物。免疫印跡結果顯示，蛋白中β亞基及大分子聚合物顯色明顯，而消化后小分子不顯色。嬰幼兒消化產物中BCG-Dai-N與成人消化產物中BCG-Gen-A的免疫印跡條帶顯色明顯強于原蛋白及其他復合物，具有一定的潛在致敏性。消化產物的電泳與免疫印跡結果與前文ELISA結果相互印證，復合物致敏性的升高也可能是由于蛋白質與異黃酮結合后產生了致敏性強的大分子聚合物，導致表現出較強的IgE結合能力。

與2 種異黃酮結合后，BCG的潛在致敏性增強，類似的研究結果在操強等[37]研究中也有報道：卵白蛋白-白藜蘆醇相互作用后卵白蛋白的體外IgE結合能力變強。結合前文復合物結構的表征結果推測，復合物致敏性增強可能是因為異黃酮與BCG相互作用后，蛋白結構變得更為松散，抗原表位更多地暴露在復合物表面。并且相較于體外實驗，人體內的過敏機制更為復雜，已有較多研究證明了異黃酮的抗過敏能力。體外血清學實驗僅表明與2 種活性異黃酮相互作用后蛋白的IgE結合能力有所增強，但黃酮類化合物在體內可能通過影響免疫細胞、調節免疫因子等途徑達到緩解過敏的作用，后續將通過細胞實驗及動物實驗進一步探究異黃酮對于大豆過敏蛋白致敏性的影響機制。

3 結論

本研究采用多種光譜方法對大豆中Gen/Dai與BCG的相互作用及復合物的結構進行研究，發現2 種活性異黃酮通過靜態猝滅方式猝滅BCG的內源性熒光，n均接近1，作用力以疏水相互作用為主；而2 種異黃酮與BCG相互作用后會導致蛋白的結構與氨基酸殘基微環境發生改變，使蛋白結構更為松散。體外血清學實驗結果說明，復合物與消化產物的致敏性均強于原蛋白，這可能是由于相互作用后蛋白質結構展開，使更多的過敏原表位暴露。