美拉德反應影響甲殼類水產品致敏原致敏性的研究進展

劉 萌，姚有容，張建華，李 穎，孫兆敏，卓澤晟，桓 霏，劉慶梅，劉光明,*

（1.廈門海洋職業技術學院海洋生物學院，福建 廈門 361100；2.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；3.廈門市智慧漁業重點實驗室，福建 廈門 361100；4.澳門大學社會科學學院，澳門 999078；5.廈門蓮花醫院，福建 廈門 361009）

得益于沿海環境和豐富的水產品供應量，亞洲地區的魚類、甲殼類、貝類和藻類等水產品人均消費量遠高于全球平均水平[1]。其中，甲殼類水產品因其味道鮮美、營養豐富而廣受國人青睞，其年養殖量也穩步提升（圖1）[2]。甲殼類水產品與魚、牛奶、雞蛋等食物被世界衛生組織（World Health Organization，WHO）和聯合國糧農組織認定為最易過敏的八大類食物，其引起的食物過敏反應屬于免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導的I型超敏反應，涉及到皮膚、胃腸、呼吸和心血管系統的一系列癥狀[3]。與雞蛋、牛奶等食物引起的“可自愈型”過敏反應相比，由甲殼類水產品引起的食物過敏好發于成年人，且通常伴隨終生，嚴重影響過敏人群的生活質量[4-5]。菲律賓和新加坡的青少年甲殼類水產品過敏比例分別達到5.12%和5.23%[6]；我國上海地區的食物過敏流行病學調查顯示，蝦類和蟹類的過敏比例達到過敏人群的19.92%[7]；而在內陸地區江西省，蝦類水產品也已成為最常見的過敏食物[8]。較高的過敏發生率及交叉反應帶來的甲殼類水產食品安全問題[9]也已經成為制約水產品進一步發展的因素之一。

圖1 甲殼類年養殖量及與水產品年總養殖量占比[2]Fig.1 Annual production of crustaceans and its proportion in the total amount of aquatic products[2]

食品在加工過程中經歷的加熱、剪切等物理作用，以及組分之間內源性的化學作用，均會影響食物的致敏性[10-11]。因此，低致敏性食品加工方式已成為當前的研究熱點[12-13]。低致敏性加工方式主要是借助物理、化學或生物的方式改變食物致敏原的結構或影響其抗原表位，進而影響其致敏性，常見的加工方式可分為熱處理和非熱處理2 種[14]。甲殼類水產品中含有大量優質蛋白質，氨基酸的游離氨基或氨基酸殘基和還原糖的羰基在食品加工或長期貯藏時形成共價鍵，為美拉德反應（Maillard reaction，MR）的發生提供了前提[15]（圖2）。MR又稱羰胺反應，是指發生在羰基化合物和氨基化合物之間的非酶褐變反應，廣泛應用于改善食品色澤和風味相關的食品加工行業中[16]；研究表明其可影響甲殼類水產品的致敏性[10]，但因其反應的復雜性、晚期產物中可能存在有害產物等因素[17]，也制約了其在水產食品工業中的應用。

圖2 MR示意圖[15]Fig.2 Schematic of MR[15]

本文首先對MR方法進行系統介紹，同時，從結構和抗原表位的角度闡述甲殼類水產品致敏原的研究進展；在此基礎上，著重對甲殼類水產品致敏原經MR處理后致敏性變化及其作用機理進行綜述。旨在為MR用于甲殼類水產品致敏原致敏性控制與消減提供參考。

1 MR方法

MR主要有干熱法和濕熱法2 種[18]。早期的MR均為干法，其特點在于蛋白質和還原糖先經凍干處理，低溫（50～60 ℃）下混合即可發生MR。此方法操作簡單，但存在明顯的缺點，蛋白質和還原糖需要分別冷凍干燥，明顯延長了整個MR的時間；反應需嚴格控制反應容器的濕度，也進一步增加了MR的工業化應用成本；此外，反應過程中沒有額外溶劑的存在，反應物蛋白質和還原糖可能接觸不充分，進而影響MR的效果；產物混合后數天至數周的反應時間進一步消耗了反應物中的游離氨基酸，增加了MR產物的復雜性，不利于食品營養品質。因此，干法短時和濕法MR逐漸受到國內外學者的青睞[19-20]。干法短時是將干法MR反應時間控制在數小時之內，Fu Linglin等[19]發現，殼寡糖的干法短時MR可顯著降低食品過敏原致敏性。濕法MR在一定pH值的緩沖液中進行，增加了反應物的接觸，有助于反應溫度的提高，因此所需的反應時間大大縮短；但液體狀態下的反應產物在工業生產中的運輸存在一定限制，也影響了其在工業上的大規模應用[18]。

此外，超聲波[21]、輻照[22]、脈沖電場[23]等非熱加工方式輔助MR的相關研究也越來越多，表1詳細總結了不同類型MR方法的優劣。超聲波處理產生的空化效應所形成的能量及高溫有助于提高MR中晚期的速率，并且具有改善產物溶解性和乳化性的潛力[24]，Hu Hao等[25]認為這也有助于改變蛋白質的空間構象或修飾其抗原表位，Zhang Ziye等[26]報道了高強度超聲（100～800 W、15 min）可破壞過敏原的空間結構，引起關鍵氨基酸的自由基氧化，進而降低其致敏性；雖然超聲輔助MR可有效改善食品的性質，但過高的超聲功率可能會產生一些有害成分，如丙烯酰胺和5-羥甲基糠醛，因此，實際使用時，需先依據具體的反應物質探究其適宜的反應條件[18]。微波處理時的偶極極化和離子傳導產生大量熱量，引起蛋白質結構及二硫鍵、氫鍵等非共價鍵的破壞，此外，微波處理還可以通過解開碳鏈以促進多糖分子的重排和相互作用，進而影響MR的發生[18]；Nasrollahzadeh等[22]發現，牛血清白蛋白和麥芽糊精經微波加熱輔助MR短時處理（90 ℃、450 W）即可有效降低反應物中的游離氨基酸含量，并進一步改變蛋白質的結構、自由基清除活性及乳化性等性質。脈沖電場處理也是一種新興的非熱食品加工技術，其在改變生物大分子微觀結構和相互作用方面具有較大的潛能[27]，MR反應物經脈沖電場處理后，蛋白質二級結構部分展開，暴露出一些隱藏的疏水基團、巰基等；同時多糖鏈發生解聚，分子間反應概率增加，有助于MR的進行[28]。Wang Zhonghe等[29]報道，葡萄糖和甘氨酸可在pH 9.0、10～50 kV/cm經脈沖電場處理0.8～4.0 ms時發生MR，此時MR并未到達晚期階段，產物發生顏色變化且抗氧化活性較好。雖然超聲波等新型MR輔助方法在甲殼類水產品加工工業應用中還存在一定的局限性，但它們具有反應效率高、反應時間短等優點。因此在了解其作用機制的前提下，如何控制MR反應條件以改善蛋白質性質仍然值得進一步探究。

表1 不同類型MR方法的比較Table 1 Comparison of different types of MR

當前甲殼類水產品致敏性的相關研究多集中在干法MR對其致敏原致敏性的影響，也有部分報道表明濕法MR可有效降低甲殼類水產品致敏原致敏性[30]，其作用機理主要包括對致敏原結構和抗原表位的影響。對于甲殼類水產品致敏原種類、結構和抗原表位的研究，有助于低致敏性MR加工方式的探究及其在工業上的推廣和應用。

2 甲殼類水產品致敏原結構及抗原表位

甲殼類水產品屬于節肢動物門，常見的可食用種類包括蝦、蟹、龍蝦等[3]。致敏原的存在是引起甲殼類水產品過敏的主要原因，目前已經被鑒定的甲殼類水產品致敏原主要來自EF手型的鈣離子結合蛋白家族、肌動蛋白結合蛋白家族和磷酸原激酶家族[31]，且多集中于肌肉等可食部分[1]。從種類來看主要有包括原肌球蛋白（tropomyosin，TM）、精氨酸激酶（arginine kinase，AK）、肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）、肌質鈣結合蛋白（sarcoplasmic calcium binding protein，SCP）和磷酸丙糖異構酶（triosephosphate isomerase，TIM）等在內的47 種致敏原被WHO/國際免疫學會聯合會（International Union of Immunological Societies，IUIS）數據庫收錄并命名（表2）。

表2 WHO/IUIS數據庫收錄的甲殼類水產品致敏原Table 2 Crustacean allergens registered in WHO/IUIS database

2.1 致敏原結構

蛋白質結晶法是較為常用且準確的解析致敏原結構的方法[34]。表3總結了目前已報道的甲殼類水產品致敏原晶體結構的相關信息。

表3 蛋白質數據庫（protein data bank，PDB）收錄的甲殼類水產品致敏原晶體結構Table 3 Crystal structure of crustacean allergens registered in the protein data bank (PDB)

TM屬于肌動蛋白結合蛋白家族，是與肌動蛋白結合并調節肌鈣蛋白和肌凝蛋白相互作用的螺旋狀蛋白質，2 條α-螺旋相互纏繞而成的空間結構增加了其結構穩定性，使其經高溫、高壓等加工處理后仍能保持較強的致敏性[35]。但囿于TM線狀結構，無法長成適合X射線衍射的晶體形狀，甲殼類TM的相關晶體結構報道較少。

AK是可催化磷酸基從ATP可逆轉移到精氨酸的激酶，其空間結構較為復雜，甲殼類中僅有Lit v 2（PDB：4AM1）[36]和Scy p 2（PDB：5ZHQ）的晶體結構被報道[37]。AK的N端含有多個α-螺旋組成的α-螺旋結構域，C端的α-β結構域含有多個不同的α-螺旋和β-折疊，其致敏性變化與空間結構的關聯較大[37]。

MLC屬于EF手型家族，在機體內可調節平滑肌的收縮，其空間結構以α-螺旋為主[10]，具有較好的耐熱、耐消化特性[38]，其晶體結構報道較少。

SCP是典型的EF手型鈣離子結合蛋白，具有較好的耐熱、耐消化特性[39]，甲殼類中僅有Scy p 4（PDB：7WBO）的晶體結構被報道；Scy p 4的晶體結構證實了它是一個球狀分子，該結構包括9 個α-螺旋，約占結構的61%。2 個相鄰的α-螺旋和連接環構成了螺旋-環狀-螺旋的EF手型基序[40]。

TIM是糖酵解中的關鍵酶，在機體的代謝中發揮了重要作用，其一級、二級結構保守性較高，甲殼類中僅有P.vannamei中的TIM（PDB：5EYW）[41]和Scy p 8（PDB：6JOX）[42]的晶體結構被報道。其結構中主要包括由多個中心β-鏈和多個環連接的α-螺旋組成的(β/α)8桶狀結構，活性位點通常位于β-鏈，位于具有βα環的桶狀結構的C端。

此外，甲殼類水產品致敏原中90 kDa的細絲蛋白C（Scy p 9，PDB：7VZO）的晶體結構也已經被報道[34]，其屬于絲蛋白家族，三級結構為具有免疫球蛋白樣褶皺的二聚體，單體為由16 個β-鏈和2 個α-螺旋組成的桶狀結構；結構域之間含有保守區域。

CT(Computed Tomography)，即電子計算機斷層掃描技術在醫學病情診斷等領域具有重要地位。然而CT技術的應用對其系統精度具有較高的要求，少許誤差即可能造成診斷失誤。[1-2]但實際CT系統成像往往存在一定的機械誤差，使得其成像效果與理想設計值之間偏差較大。且CT系統射線源、轉臺和探測器間的相對位置關系，以及標定模板信息的離散性均會影響重建圖像是否存在偽影。此外，運動偽影也是造成CT系統誤差的一個重要因素，[3-5]研究運動偽影的消除技術對研究如何提高成像質量具有重要意義。

結構解析是明確其致敏性差異的基礎，但蛋白質本身是否能結晶、結晶條件的摸索和優化不易、晶體結構解析難度大等因素，使得甲殼類水產品致敏原晶體結構解析進展緩慢。甲殼類不同物種間的致敏原序列同源性較高[43]，SWISS-MODEL、AlphaFold2等生物信息學軟件可基于已知蛋白質結構，借助同源建模方法或氨基酸序列同源性分析等預測蛋白質三維結構[44-45]，為甲殼類水產品致敏原的結構研究提供了新的思路[46]。

2.2 致敏原抗原表位

食物致敏原的實質是具有多個IgE結合表位的蛋白質，致敏原的致敏性主要取決于其IgE結合表位[47]，IgE結合表位按其空間結構特點可分為線性表位和構象表位[48]。線性表位是指一級序列上連續的氨基酸，具有較強的耐加工、耐消化特性。構象表位是蛋白質空間結構上鄰近的氨基酸，這部分表位對其空間結構依賴性較強，易受加工熱處理和胃腸道消化的影響而不穩定，因此國內外學者對甲殼類水產品致敏原抗原表位的研究普遍集中在線性表位上。已具有IUIS系統命名的龍蝦致敏原抗原表位主要集中在小龍蝦（P.clarkii）中，AK的6 個線性表位、MLC的4 個線性表位和5 個構象表位區域、TIM的5 個線性表位已經先后被鑒定（表4）。蟹類食物致敏原的抗原表位主要集中在青蟹（S.paramamosain）中，Liu Guangyu等[49]以TM多克隆抗體為靶庫結合噬菌體展示技術確定青蟹的8 個線性表位和7 個構象表位區域；Li Mengsi等[39]基于一珠一化合物（one bead and one compound，OBOC）和噬菌體展示技術確定青蟹的10 個線性表位和3 個表位區域；Liu Meng等[38]采用模擬胃腸液連續消化模型結合質譜分析確定青蟹TM的7 個耐熱、耐消化的線性表位。此外，青蟹AK、MLC、SCP和TIM等致敏原的相關表位也陸續被鑒定（表4）。目前來看，蝦類食物致敏原的抗原表位主要集中在L.vannamei中，TM、AK、MLC和SCP的抗原表位均已被鑒定；此外，其余蝦類食物中，如E.modestus、M.ensis，抗原表位的相關研究均集中在主要致敏原TM中。表4總結了甲殼類水產品致敏原已被鑒定的線性表位和構象表位。

表4 甲殼類水產品致敏原抗原表位Table 4 Epitopes of crustacean allergens

致敏原線性抗原表位的定位主要有重疊肽技術、抗原抗體復合物共結晶技術、噬菌體展示技術、OBOC篩選技術等實驗檢測方法。Ayuso等[52]通過重疊肽技術鑒定了Lit v 1的3 個線性表位、Lit v 2的7 個線性表位、Lit v 3的5 個線性表位、Lit v 4的3 個線性表位；Yang Yang等[60]基于血清和抗體為靶蛋白庫，利用噬菌體展示技術篩選得到Scy p 2的7 個線性表位和8 個構象表位區域。但不同實驗檢測方法原理不同，篩選出的抗原表位有所區別，Li Mengsi等[39]對比分析噬菌體展示技術和OBOC篩選技術對于定位Scy p 3抗原表位的區別，發現2 種方法篩選出的構象表位有部分重合，這些重合的表位可能是致敏原的主要致敏表位。

相比于傳統的實驗檢測方法確定抗原表位，多種生物信息學軟件聯用可以快速且有針對性地預測潛在的抗原表位，Fu Linglin等[67]利用DNAStar、AntheProt、BepiPred 1.0、ABCpred和Immunomedicine Group 5 種生物信息學軟件預測獲得P.chinensisTM的10 個線性表位、Pen c 2的7 個線性表位；Liu Meng等[38]基于多種生物信息學軟件預測，采用模擬胃腸液連續消化模型結合質譜分析獲得Scy p 1的7 個線性表位。

此外，食品過敏原構象表位可引起口腔過敏綜合征[68]，但考慮到構象表位的不穩定性和致敏原晶體結構的匱乏，甲殼類水產品致敏原構象表位的研究方法以噬菌體展示技術、OBOC篩選技術等方法為主，Yang Yang等[60]利用噬菌體展示技術篩選得到Scy p 2的8 個構象表位區域，Li Mengsi等[39]采用OBOC也確定了Scy p 3的構象表位區域。但這類方法技術門檻較高、實驗周期較長，且篩選結果容易出現假陽性，需結合分子突變技術對陽性表位進一步驗證。

甲殼類水產品致敏原抗原表位的研究多集中在主要致敏原TM中，且當前抗原表位多以線性表位為主。單一方法定位抗原表位存在檢測率及準確性等方面的局限；預測、實驗驗證等多種方式聯用可較為全面地鑒定抗原表位，甲殼類水產品致敏原抗原表位的相關研究還需要進一步加強。

3 甲殼類水產品致敏原的MR處理

基于國內外學者目前的研究，MR可通過改變致敏原的結構，或者影響氨基酸之間的交聯、以糖基化等方式化學修飾致敏原，以掩蓋、暴露、形成食品致敏原抗原表位，進而影響食品致敏原的致敏性[69-70]。雖然MR引起反應物結構及與IgE結合能力的變化，但其并非一定能降低致敏原的致敏性[71]，Lit v 1與麥芽糖經MR后，其致敏性未發生顯著變化[72]。此外，不同類型的蛋白質，其致敏性本身也有較大不同，因此本文總結了已報道的甲殼類水產品致敏原經MR后的致敏性變化情況（表5）。

表5 已報道的MR對甲殼類水產品致敏原致敏性的影響Table 5 Influence of reported MR on the allergenicity of crustacean allergens

3.1 甲殼類TM的MR處理

甲殼類水產品致敏原的MR相關研究均集中于TM，其主要原因可能有2 個：1）TM是甲殼類中的主要致敏原，人群中致敏頻率較高[38]；2）TM的結構簡單、熱變性溫度較高、熱穩定性較好[77]，常規熱處理無法完全降低其致敏性，因此對其進行加工處理更有實際應用意義。TM致敏性降低的原因主要有：1）結構的變化：TM的空間結構以α-螺旋為主，α-螺旋的變化對致敏性影響較大；如Pen c 1[19]、Pen a 1[75]等發生的MR反應，致敏原二級結構中的α-螺旋解開，致敏原分子呈舒展狀態，構象變化較大；2）氨基酸的修飾：具有ε-氨基的賴氨酸可以發生縮合反應，精氨酸中的胍基也已經被證明可以參與MR[78]；TM抗原表位上賴氨酸、精氨酸、組氨酸等也是參與MR的主要氨基酸，這也是甲殼類TM致敏性降低的原因之一[19,76]；Scy p 1抗原表位（R105-A116）中第112位的賴氨酸在MR中被修飾[30]，Lit v 1中19 個賴氨酸和18 個精氨酸也被發現發生了位點修飾[20]。此外，有學者認為不含賴氨酸或精氨酸殘基的抗原表位具有較高的IgE結合親和力，隨后的研究也證明MR可以修飾組氨酸和半胱氨酸[20]，反應發生在組氨酸中的咪唑基團，而色氨酸中的吲哚基團也可以被MR所修飾[79]，進而影響其致敏性；3）干預免疫系統：Exo m 1與半乳糖低聚糖、甘露聚糖低聚糖和麥芽糖戊糖發生MR后，小鼠體內嗜堿性粒細胞的脫顆粒程度降低，免疫信號通路被抑制，小鼠致敏癥狀減弱、致敏性降低[74]；Exo m 1與D-葡萄糖、麥芽三糖、麥芽五糖、麥芽七糖發生MR后，糖化產物可顯著影響噬堿性粒細胞KU812的激活、且腸上皮黏膜細胞Caco-2中白細胞介素8的釋放被抑制，其致敏性降低[71]。

Fu Linglin等[19]報道，P.chinensis中TM經MR處理時，相較于核糖、半乳糖寡糖，殼寡糖可在較短反應時間內迅速降低TM的致敏性。相較于麥芽三糖、麥芽五糖、麥芽七糖等，麥芽糖對Lit v 1致敏性沒有顯著的影響，其主要原因在于產物中具有糖基化位點（如賴氨酸）的TM表位可能被破壞，同時可能產生AGEs新表位；抗原表位損失與AGEs新表位產生之間的平衡改變[72]。這表明，MR中不同糖類可引起不同程度的蛋白質構象伸展或折疊，對賴氨酸等抗原表位上的氨基酸進行不同程度的修飾，從而對其致敏性起到決定性作用[12]，但當前鮮有還原糖種類/含量與致敏原致敏性之間構效關系的相關研究。MR過程中應注意選擇還原糖的類型，以避免產生抵消致敏性降低的新致敏原[69,71]。

干法和濕法MR均可以降低蝦蟹TM的致敏性，但已報道的MR處理時間均較短，這可能跟蝦蟹高蛋白含量及豐富的營養價值有關[80]，較短的反應時間可最大程度避免食品中營養成分的流失。

3.2 甲殼類其他致敏原的MR處理

青蟹過敏人群中AK的陽性率高達42.31%，遠高于TM的30.77%；SCP的陽性率也高達15.38%[38]，因此也有學者對這類過敏原進行MR處理。Scy p 2與阿拉伯糖發生MR后，小鼠的過敏癥狀得到顯著改善，Th1型細胞因子表達升高、Th2型細胞因子表達明顯下調；其致敏性下降的主要原因在于Scy p 2抗原表位中的賴氨酸和精氨酸在MR過程中發生了明顯的位點修飾[30]。Scy p 4與木糖發生MR后，蛋白微觀結構變得松散，球狀結構中α-螺旋解開、β-折疊含量升高，疏水性增加，IgE結合能力降低[76]。相較于簡單結構的TM，甲殼類水產品AK、SCP等致敏原具有復雜的空間結構，結構對其致敏性的影響更大，在MR過程中致敏原二級結構被破壞、表面電荷或表面疏水性發生變化，進而引起空間結構的變化，其致敏性也會隨之出現明顯變化[81]。

此外，也有學者基于甲殼類水產品基質探究了MR對L.vannamei可食部分免疫結合活性的影響及其相關機理[20]，L.vannamei與半乳糖在高溫高壓反應后，其可食部分的質構發生明顯變化、可消化性提高、蝦肉的免疫結合活性顯著降低，其原因可能是基質中Lit v 1、Lit v 2、Lit v 3和Lit v 4抗原表位上的賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸經MR后發生了修飾。

MR可作為低致敏性甲殼類水產品加工的候選方法，其機理主要在于：1）對致敏原結構的修飾，如α-螺旋等二級結構的破壞、二硫鍵的修飾、疏水性改變等引起的空間結構變化；2）抗原表位上賴氨酸、精氨酸等的修飾，這種修飾又進一步引起其結構的變化，最終影響致敏原與IgE的結合。但目前的研究對于反應物（還原糖和蛋白質）與甲殼類水產品致敏原致敏性之間的構效關系研究還不足，此外，重視單一致敏原致敏性而忽視其食物基質致敏性的研究，也制約了MR的工業化應用。

4 結語

MR是食品加工及貯藏過程中常見的非酶褐變反應，可增加食品風味、改善蛋白質的功能特性，也可有效降低甲殼類水產品致敏原致敏性。本文首先對MR方法進行了系統介紹；同時，從結構和抗原表位的角度闡述了甲殼類水產品致敏原的研究進展；在此基礎上，著重對甲殼類水產品致敏原經MR處理后致敏性變化及其作用機理進行綜述。相較于干法和濕法MR，超聲波等新型輔助方法展現出反應效率高、反應時間短等優點，但其在甲殼類水產品致敏性中的相關研究還較少。致敏原的結構和抗原表位對于解析其致敏性變化、開發低致敏性加工方式等具有重要意義，基于致敏原晶體結構的抗原表位解析定位是了解致敏原致敏機理的前提；但甲殼類水產品致敏原晶體結構及家族分類信息還不足。MR可降低甲殼類水產品致敏性，主要機理在于其改變了致敏原結構、修飾了抗原表位位點等，但其受致敏原和還原糖種類的影響，因此適合工業化的反應條件仍需要摸索。

在MR影響甲殼類致敏性的相關研究中還有以下幾個方面亟待解決：1）進一步加強超聲波等新型MR輔助技術的相關研究，控制MR反應程度，盡快實現低致敏性甲殼類水產品生產技術的工業化應用；2）甲殼類水產品的MR相關研究起步較晚、研究不深入，致敏原致敏性影響因素較多，MR與甲殼類水產品致敏性的構效關系尚不明確，基于工業化應用的角度，仍需要加大對其構效關系的解析；3）食品中的MR涉及到食物基質等的影響，但目前的研究多集中于單一致敏原的MR，難以真正全面衡量MR降低甲殼類水產品致敏性的效果，因此，基于全食品的MR研究迫在眉睫。