擬穴青蟹精氨酸激酶的重組表達及致敏性分析

楊 陽，何欣蓉，何少貴，陳錦莉，劉 萌，費丹霞，毛海燕，劉光明,*

（1.廈門華廈學院環境與公共健康學院，福建 廈門 361024；2.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；3.翔安創新實驗室，福建 廈門 361104；4.廈門海洋職業技術學院海洋生物學院，福建 廈門 361102）

在過去幾十年里，過敏性疾病的發病率在全球范圍內顯著且迅速地升高[1]。食物過敏是人體對食品中抗原物質產生的由免疫系統介導的不良反應，屬于免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導的I型（速發型）超敏反應，其臨床癥狀多種多樣，最常見的是消化道癥狀、皮膚黏膜癥狀和呼吸道癥狀，嚴重時會產生過敏性休克甚至危及生命[2-3]。根據2021年聯合國糧農組織和世界衛生組織公布的數據，引發過敏性疾病的八大類主要致敏食物為谷物、甲殼類水產品、雞蛋、魚類、牛乳、花生、芝麻和堅果[4]。

甲殼類水產品是亞洲最常見的致敏食物，近年來食品加工業的不斷發展使得水產品來源的食品原材料被廣泛添加于各類食品中，在客觀上擴大了水產品過敏原的分布范圍，導致我國水產食物過敏發生率呈現出上升趨勢，過敏癥狀也更加復雜化和嚴重化[5-6]。甲殼類水產食物過敏主要由蝦、蟹、章魚等引起，精氨酸激酶（arginine kinase，AK）被認為是其水溶性蛋白中的主要過敏原[7]。擬穴青蟹（Scylla paramamosain）具有較高的經濟價值和營養價值，是我國海水養殖產量最高的蟹類[8]，但其產量和消費量逐年升高的同時也伴隨著越來越多的蟹類食物過敏問題。前期研究表明，擬穴青蟹AK是一種分子質量為40 kDa的糖蛋白，其空間結構包含1 個N端的α-螺旋結構域和C端的α-β結構域，N端的α-螺旋結構域由位于氨基酸（amino acids，AA）1～92位的5 個α-螺旋組成；C端的α-β結構域由位于AA 93～356位的7 個α-螺旋和8 個β-折疊組成；AK分子內含2 對二硫鍵，其中201位和271位半胱氨酸形成的二硫鍵對于維持AK分子規則折疊的高級結構和致敏性具有重要作用[9-10]。

對于AK的研究，擬穴青蟹肌肉中提取的天然AK（native AK，nAK）最能體現其原本致敏性，但是天然蛋白也有其不可避免的缺點。分離純化過程中步驟繁瑣、過敏原組分含量和生物活性存在差異，以及處理過程中過敏原的降解等問題，都使提取天然過敏原難以標準化、程序化和量產化。因此，通過分子生物學方法制備的重組食物過敏原成為替代天然過敏原應用于食品安全檢測、過敏性疾病診斷和治療的重要工具[11]。前期Mao Haiyan等[12]利用大腸桿菌（Escherichia coli）原核表達系統獲得了擬穴青蟹重組AK（recombinant AK，rAK），并證實rAK與nAK具有相似的IgE結合活性。但費丹霞[13]對rAK和nAK的性質比較發現rAK分子中游離巰基含量和疏水性高于nAK，即蛋白質分子空間結構折疊松散。AK分子內二硫鍵是維持其空間結構和致敏性的重要因素，rAK與nAK空間結構的差異可能導致二者穩定性和致敏性的差異[10,12]，因此rAK是否能夠替代nAK需進一步通過致敏性評估進行驗證。此外，目前已報道的甲殼類水產品AK的線性表位主要分布于AA 29～53、AA 101～110、AA 113～155、AA 204～225和AA 308～330[10,12,14-16]。從結構上看，AA 29～53位于AK N端的α-螺旋結構域，其余線性表位區域則位于其C端的α-β結構域[9-10,12,14-16]，但在機體中這些抗原表位所發揮的作用也需進一步評估。

對于過敏原致敏性的評估主要包括體內和體外2 種方式。目前應用最多的過敏原致敏性體內評估方式是動物模型，即利用鼠、兔等動物模擬人體食物過敏反應，檢測其血清中的抗體水平及免疫細胞的變化情況，從而達到對過敏原致敏性評估的目的，這種方法在高度模擬過敏原在體內作用方式的同時，也避免了過敏原對人體造成的威脅[17]。根據過敏反應的發生機制，機體中效應細胞表面的特異性IgE和入侵機體的過敏原是觸發過敏反應的物質基礎，因此過敏原致敏性的體外評估除血清學分析外，還包括細胞模型[18]。過敏反應發生時效應細胞會產生介質釋放、脫顆粒等變化，因此過敏原激發效應細胞釋放介質的能力也可作為評估其致敏性的一個標準，目前大鼠嗜堿性白血病（rat basophilic leukemia，RBL）-2H3細胞脫顆粒模型是一種較為常用的過敏原致敏體外評估模型[19]。RBL-2H3細胞表面高表達IgE高親和力受體，且細胞內存在預先合成的β-己糖苷酶，經IgE敏化的RBL-2H3細胞可被抗原激發而發生脫顆粒、釋放β-己糖苷酶，細胞脫顆粒時釋放的β-己糖苷酶與過敏相關活性物質的釋放呈正相關[20]。因此，在過敏原的致敏性體外評估中常用致敏小鼠血清特異性IgE敏化的RBL-2H3細胞建立模型，以β-己糖苷酶的釋放作為脫顆粒的一個衡量標準，評價過敏原的致敏性[10,21-22]。

獲得高純度、標準化的過敏原對后續致敏機理的相關研究、過敏原檢測、過敏性疾病的診斷和治療等都具有重要意義，重組蛋白具有易標準化、量產化等優勢，與天然過敏原具有相似理化特性和免疫學特性的重組過敏原具有重要的應用潛力。此外，探究過敏原分子中主要的表位分布區域在機體過敏時所發揮的作用，可為過敏原檢測、過敏性疾病的治療提供依據。因此，本研究針對擬穴青蟹AK，根據其已報道的空間結構和抗原表位對該分子進行分段并利用E.coli原核表達系統對分段的基因進行重組表達；進一步通過BALB/c小鼠致敏模型和RBL-2H3細胞模型對nAK、rAK及AK分段表達產物致敏性進行評估，比較分析nAK和rAK的致敏性，并鑒定AK分子中致敏的主要表位區域，以期為AK檢測及過敏性疾病診斷、治療提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活的擬穴青蟹購自廈門市集美區集美菜市場。

6～8 周齡雌性BALB/c小鼠，無特定病原體級別，購自中國科學院上海實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（閩）2016-0006。

E.coliTop10/BL21感受態、質粒pEASY-T1、T4連接酶北京全式金生物技術有限公司；TaqDNA聚合酶、限制性內切酶NdeI、SalI、DNA Marker（DL2000）日本Takara公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒 天根生化（中國）有限公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠IgE、IgG1、IgG2a抗體、HRP-羊抗兔IgG抗體 美國Abcam公司；小鼠淋巴細胞分離液 中國達科為生物技術有限公司；小鼠白細胞介素4（interleukin 4，IL-4）、IL-13、干擾素γ（interferon γ，INF-γ）酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒美國Peprotech公司；明礬佐劑、Ni2+-次氨基三乙酸（nitrilotriacetic acid，NTA）瓊脂糖凝膠柱 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；大鼠嗜堿性粒細胞（RBL-2H3）上海復祥生物技術有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；rAK表達菌株（E.coli）由本實驗室Mao Haiyan等[12]前期構建。其他試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

PTC-1198聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、DNA水平電泳槽、蛋白垂直電泳槽、Biologic LP蛋白層析系統、Bench mark 96酶標儀美國Bio-Rad公司；Bio-Profile凝膠成像儀 法國Vibler Lourmant公司；AvantiTM JA-25高速冷凍離心機（大型）美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 擬穴青蟹AK的分段和引物設計

根據對AK序列的分段信息，利用Primer 5.0軟件設計4 對帶有酶切位點的分段擴增引物，為使限制性內切酶能夠有效識別酶切位點，分別在AK-E1上游引物和下游引物的5′端加入CCG和CGC保護性堿基，實驗所用引物由廈門瑞辰鉑生物技術有限公司合成（表1）。

表1 AK基因分段引物序列、內切酶及酶切位點Table 1 Primer sequences,endonucleases,and cleavage sites used for amplification of gene fragments of AK

1.3.2 AK片段的基因擴增及表達載體構建

以實驗室前期構建的rAK表達菌株質粒（pET-28a載體）pET-AK作為PCR反應的模板[12]，對AK的4 個片段進行PCR擴增，PCR程序參數為：94 ℃預變性，5 min；94 ℃變性，30 s，根據表1的引物退火溫度退火，45 s；72 ℃延伸，60 s；變性、退火、延伸過程共進行30 個循環后72 ℃延伸10 min，反應結束后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，切膠回收目的條帶。將擴增得到的AK片段基因與pEASY-T1載體連接，構建AK的分段克隆載體，轉化Top10感受態細胞，涂布于含卡那霉素的LB平板，37 ℃培養過夜，挑取單菌落進行高溫裂解作為菌落PCR模板，采用與4 個AK片段PCR擴增反應相同的條件進行PCR擴增。根據擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，選取PCR產物分子質量與設計的片段大小相符、擴增條帶單一的克隆子測序。將測序正確的分段克隆載體及表達載體pET-28a分別采用表1所列的限制性內切酶進行雙酶切后，回收酶切產物，用T4 DNA連接酶將目的基因片段與載體酶切產物于16 ℃連接18 h，轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，構建rAK分段表達載體pET-28a-AK-E1、pET-28a-AK-E2、pET-28a-AK-E3和pET-28a-AK-E4。將轉化了連接產物的大腸桿菌BL21涂布于含卡那霉素的LB平板，篩選能夠在含卡那霉素抗性固體培養平板上生長的菌株，委托廈門瑞辰鉑生物技術有限公司對菌株所攜帶的重組質粒進行測序。

1.3.3 重組蛋白的小量誘導表達

表達載體在BL21中的表達及檢測參照He Xinrong等[23]的方法，選取上述測序正確的表達宿主菌種接種于含卡那霉素的LB液體培養基，培養至600 nm波長處的光密度（optical density，OD）（OD600nm）為0.6左右，加入異丙基硫代半乳糖苷至濃度為0.5 mmol/L，37 ℃下誘導培養4 h。離心（4 ℃、10 000×g、1 min）回收菌體，用含0.5 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）重懸后超聲破碎。收集全菌液，離心（4 ℃、12 000×g、2 min）得到上清液及沉淀，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）鑒定誘導表達結果。

1.3.4 nAK、rAK和AK分段表達產物的純化及鑒定

nAK的純化參照Yang Yang等[9]的方法，新鮮擬穴青蟹肌肉經組織搗碎、硫酸銨鹽析、Q-Sepharose陰離子交換柱層析后，收集目的蛋白進行SDS-PAGE分析。rAK和AK分段表達產物的純化參照Huang Yuhao等[24]的方法，將誘導表達后的重組質粒菌液進行超聲破碎后離心（4 ℃、12 000×g、20 min），可溶表達的重組蛋白取上清；包涵體蛋白棄上清后沉淀用4 mol/L脲復溶，于2 mol/L脲和不含脲的緩沖液中分步透析復性；選擇Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠柱純化目的蛋白，收集目的蛋白，采用SDS-PAGE檢測純化結果。純化的蛋白采用Yang Yang等[10]制備的兔抗擬穴青蟹AK IgG多克隆抗體為一抗，通過Western blot對純化的蛋白進行鑒定。

1.3.5 BALB/c小鼠致敏模型構建

小鼠實驗全程在集美大學水產學院動物中心（實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2016-0006）進行。將42 只BALB/c小鼠分為磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）對照組、nAK致敏組、rAK致敏組、AK-E1～AK-E4致敏組，每組各6 只）。純化的抗原根據BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定質量濃度并調整質量濃度至1 mg/mL后，與明礬佐劑以3∶1（V/V）混勻，對照組小鼠注射采用等體積的PBS代替抗原。致敏方式為在第0、14天以腹腔注射的方式敏化小鼠，每只小鼠注射200 μg抗原。第2次腹腔注射后1 d，眼球取血并分離血清用于特異性抗體水平檢測[25]。將小鼠宰殺，取出脾臟，分離淋巴細胞，將細胞數量調整為2×105個/mL，加入100 μg/mL抗原，對照組細胞加入等體積培養基，放置于37 ℃的CO2細胞培養箱刺激培養72 h。將刺激培養后的細胞離心（25 ℃、4 000×g、10 min），回收上清液用于脾臟淋巴細胞因子釋放水平檢測[26]。

1.3.6 BALB/c小鼠血清特異性抗體及脾臟淋巴細胞因子釋放水平測定

參照史云鳳等[27]的方法，采用間接ELISA檢測小鼠血清中AK-特異性IgE（specific IgE，sIgE）、AK-sIgG1和AK-sIgG2a抗體水平。以10 μg純化的nAK包被96 孔板，4 ℃孵育過夜；用TPBS（含0.05%吐溫-20的20 mmol/L PBS）洗滌3 次后，用5 g/100 mL脫脂乳于37 ℃封閉2 h；洗滌3 次后加入以1 g/100 mL脫脂乳稀釋5 倍的小鼠血清樣品，37 ℃孵育2 h；洗滌5 次后加入二抗（HRP-羊抗鼠IgE、IgG1、IgG2a抗體），37 ℃孵育2 h；洗滌5 次后加入3,3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺底物，37 ℃避光反應20 min后用2 mol/L H2SO4終止反應，在450 nm波長處檢測各孔的OD450nm。同時，以小鼠血清（1∶5稀釋）為一抗，HRP-羊抗鼠IgE、IgG1、IgG2a抗體為二抗，采用Western blot對小鼠血清中AK特異性抗體水平進行檢測[25]。

小鼠脾臟淋巴細胞刺激培養后上清液細胞因子質量濃度的檢測均按照細胞因子（IL-4、IL-13、INF-γ）檢測試劑盒說明書采用ELISA法進行檢測。

1.3.7 RBL-2H3細胞脫顆粒效率測定

將培養至對數生長期的RBL-2H3細胞調整至濃度為1×106個/mL，在48 孔細胞培養板中每孔加入200 μL，并添加1.3.5節以nAK免疫小鼠后獲得的鼠抗擬穴青蟹nAK抗血清（10 μL/孔），放置于37 ℃的CO2細胞培養箱中培養過夜。用PBS洗滌細胞3 次，將各抗原按照濃度梯度溶于200 μL Tyrode’s緩沖液，分別加入培養板中，陰性對照孔加入等體積PBS，繼續培養6 h。回收細胞培養上清，每孔加入200 μL含0.1% Triton X-100的Tyrode’s緩沖液冰浴5 min，使培養板底部的細胞完全裂解后回收。取25 μL上清/細胞裂解液，加入100 μLβ-氨基己糖苷酶的底物1.2 mmol/L 4-甲基傘形酮基-N-乙酰基-b-D-氨基葡萄糖苷，于37 ℃反應30 min，當體系中含有β-氨基己糖苷酶時，可將該底物分解，釋放熒光分子，在360 nm激發波長、450 nm發射波長下可測定熒光強度，該熒光強度可反映細胞的β-氨基己糖苷酶水平[28]。抗原刺激細胞脫顆粒的能力以脫顆粒效率表示，按下式計算：

1.4 數據處理

實驗所得數據采用GraphPad軟件分析，數據進行方差分析，采用Tukey多重檢驗法進行顯著性檢驗。數據均平行測定3 次，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 重組蛋白的表達

2.1.1 AK片段表達載體的構建及測序

根據擬穴青蟹AK的AA序列（GI：375298903）和已解析的晶體結構（PDB：5ZHQ），以及已鑒定的抗原表位[9-10,12,14]，AK的N端α-螺旋結構域中包含1 個位于AA 29～53的線性表位區域，因此首先確定AK-E1為AA 1～92。在AK分子C端的α-β結構域中，主要有3 個線性表位的分布區域：AA 101～110和AA 113～155、AA 204～225、AA 308～330。根據線性表位在C端結構域的分布，并確保各分段表達產物相對分子質量較一致且分段表達產物中α-螺旋和β-折疊結構不受破壞，從無規卷曲區域選擇AK的分段位點，確定AK的C端的α-β結構域分為AK-E2（AA 87～187）、AK-E3（AA 172～265）和AK-E4（AA 276～357）3 段（圖1）。以rAK表達質粒pET-AK為PCR擴增模板，分別采用4 對引物進行擴增后，由瓊脂糖凝膠電泳結果（圖2）可知，擴增的4 個基因大小與設計的目的基因片段大小基本相符。將產物回收，構建分段克隆載體，轉入Top 10克隆宿主大量擴增后，回收質粒，將目的條帶與pET-28a載體雙酶切后連接，構建分段表達載體，轉化BL21表達宿主。選取菌落PCR陽性克隆子進行測序。

圖1 AK的分段表達示意圖Fig.1 Schematic diagram of partial expression of AK

圖2 AK片段PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electropherograms of PCR amplification products of AK fragments

2.1.2 重組蛋白的誘導表達及nAK、rAK、分段表達產物的純化

將測序結果正確的宿主表達菌在37 ℃下誘導表達后，提取超聲處理的上清液和沉淀，用SDS-PAGE分析各重組蛋白的表達情況，并采用Western blot對表達產物進行鑒定。由圖3可知，AK-E1為可溶表達，AK-E2、AK-E3和AK-E4則以包涵體形式表達，各分段表達產物大小約為14 kDa，與理論值相符，并且目的蛋白均能被兔抗擬穴青蟹AK IgG多克隆抗體特異性識別，表明獲得的表達產物為AK的片段。AK-E1為可溶表達蛋白，直接上樣于Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠柱，用Ni2+吸附純化帶有His標簽的重組蛋白；AK-E2、AK-E3包涵體蛋白溶解于4 mol/L脲，透析復性后上樣于Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠柱，用Ni2+吸附純化帶有His標簽的重組蛋白；AK-E4包涵體蛋白溶解于4 mol/L脲，透析復性后離心收集上清液中的重組蛋白。分別參照Mao Haiyan[12]、Yang Yang[9]等的方法純化rAK和nAK。通過SDS-PAGE檢測經柱層析分離的樣品（圖4）并分別對各泳道的目的蛋白純度進行分析，結果表明，純化后目的蛋白純度均達到90%以上。

圖3 AK分段表達產物的SDS-PAGE和Western blot檢測結果Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of AK fragments

圖4 nAK、rAK及AK分段表達產物的SDS-PAGE分析結果Fig.4 SDS-PAGE analysis of nAK,rAK,and AK fragments

2.2 重組蛋白的致敏性分析

2.2.1 重組蛋白和nAK致敏BALB/c小鼠的血清學分析

由圖5A可知，nAK敏化組小鼠的血清特異性IgE升高最為明顯，ELISA檢測結果OD450nm為1.098±0.008，顯著高于rAK和AK分段表達產物敏化組小鼠（P＜0.05）。重組蛋白中，rAK、AK-E1、AK-E2、AK-E3都能刺激小鼠產生AK-sIgE，其中rAK敏化組小鼠OD450nm升高至0.472±0.002，顯著高于對照組和AK分段表達產物敏化組，而AK的4 個片段中，AK-E2可刺激機體產生較高水平的AK-sIgE。Western blot檢測結果表明，nAK和rAK敏化組小鼠血清中的IgE能夠特異性識別結合AK，但AK分段表達產物敏化組小鼠血清中的IgE水平較低，未出現免疫印跡。

圖5 第2次腹腔注射后1 d小鼠血清中AK特異性抗體的Western blot和ELISA檢測結果Fig.5 Western blot and ELISA analysis of AK-specific antibodies in the serum of mice at 1 d after the second intraperitoneal injection

對AK-sIgG1的ELISA檢測結果（圖5B）表明，與PBS組小鼠血清相比，nAK（OD450nm＝1.975±0.058）、rAK（OD450nm＝1.891±0.088）、AK-E2（OD450nm＝1.772±0.105）和AK-E3（OD450nm＝0.929±0.085）敏化組小鼠血清中的AK-s IgG 1 含量顯著升高（P＜0.05），AK-E1（OD450nm＝0.082±0.003）和AK-E4（OD450nm＝0.126±0.004）敏化組小鼠注射抗原后未檢測到其血清中AK-sIgG1水平升高。通過Western blot檢測，nAK、rAK、AK-E2及AK-E3組小鼠血清中的AKsIgG1呈陽性，與ELISA檢測結果相符。小鼠血清中AKsIgG2a水平的ELISA測定結果（圖5C）表明，與PBS組相比，nAK（OD450nm＝0.965±0.042）、rAK（OD450nm＝0.694±0.010）、AK-E2（OD450nm＝0.468±0.018）、AK-E3（OD450nm＝0.481±0.001）和AK-E4（OD450nm＝0.456±0.001）敏化組小鼠血清中的AK-sIgG2a水平顯著升高（P＜0.05），AK-E1（OD450nm＝0.090±0.002）組小鼠注射抗原后未檢測到其血清中AK-sIgG2a水平的升高。各組血清中AK-sIgG2a水平的Western blot檢測結果與ELISA檢測結果均相符。此外，在nAK、rAK、AKE1、AK-E2和AK-E3敏化小鼠中，sIgG1水平均明顯高于sIgG2a，即IgG1/IgG2a比值均大于1，表明在能夠產生特異性IgE的小鼠機體內過敏反應均為Th2型[29]。

2.2.2 小鼠脾臟細胞培養上清液中細胞因子水平

由圖6可知，與PBS組相比，nAK敏化組小鼠的淋巴細胞刺激培養上清中，IL-4（（63.067±1.359）pg/mL）、IL-13（（20.767±0.040）pg/mL）和IFN-γ（（133.289±2.393）pg/mL）水平均顯著升高，且顯著高于重組蛋白組（P＜0.05）。rAK敏化組小鼠淋巴細胞的刺激培養上清中IL-4（（49.501±0.352）pg/mL）、IL-13（（14.851±1.073）pg/mL）和IFN-γ（（68.141±7.464）pg/mL）水平也有顯著升高（P＜0.05），而在分段表達產物中，AK-E2能夠刺激淋巴細胞釋放較高水平的IL-4（（50.668±0.759）pg/mL），且其釋放水平與rAK組無顯著差異。在I型超敏反應中，Th0向Th2分化、Th1/Th2失衡、IgE含量增加是關鍵環節，而Th2分泌IL-4、IL-13等多種細胞因子，具有誘導B細胞的免疫球蛋白類別轉化、導致IgE水平升高并協同IL-3共同刺激肥大細胞增殖等功能[30]。nAK、rAK和AK-E2敏化組小鼠脾臟淋巴細胞刺激培養上清中的Th2型細胞因子與其血清中特異性抗體水平一致，表明與nAK相比，rAK對機體的敏化能力較弱，而在AK分子中，AK-E2（AA 87～187）在致敏階段發揮較為重要的作用。對Th1型細胞因子IFN-γ水平的檢測結果表明，nAK組IFN-γ水平同樣最高，但有研究表明這一細胞因子還參與機體的炎癥反應[31]，表明AK敏化組小鼠機體中IFN-γ水平升高可能主要是因為參與機體的炎癥反應。

圖6 nAK、rAK及AK分段表達產物對小鼠脾臟淋巴細胞因子釋放影響的ELISA檢測結果Fig.6 ELISA analysis of effects of nAK,rAK and AK fragments on cytokine levels in splenocyte culture

2.2.3 rAK及AK分段表達產物對RBL-2H3細胞脫顆粒的影響

用不同質量濃度梯度的重組蛋白刺激經AK-sIgE敏化過夜的細胞，以nAK為陽性對照，PBS為陰性對照，評價各重組蛋白刺激RBL-2H3細胞的脫顆粒效率。由表2可知，與PBS組相比，當nAK質量濃度達到50 μg/mL時就能夠使細胞產生明顯脫顆粒反應，而rAK則在質量濃度達到100 μg/mL時能夠引起細胞產生明顯的脫顆粒。AK的4 個分段表達產物均能夠引起RBL-2H3細胞脫顆粒，但其能夠引起細胞脫顆粒所需的質量濃度比rAK高出10 倍以上，AK的分段表達產物刺激RBL-2H3細胞脫顆粒效率的程度為AK-E2＞AK-E4＞AK-E3＞AK-E1。

表2 nAK、rAK及AK分段表達產物對RBL-2H3細胞脫顆粒效率的影響Table 2 Effect of nAK,rAK and AK fragments on the degranulation efficiency of RBL-2H3 cells %

3 討論

水產品是人們日常飲食的重要組成部分，是營養的重要來源，但同時也是引起食物過敏的重要因素，甲殼類水產品引起的過敏反應可引起皮膚紅疹、面部及喉部水腫，甚至引發休克，在亞洲沿海地區這種現象尤為常見[32]，因此，甲殼類水產品過敏原的研究開始受到廣泛關注。重組過敏原可以作為天然過敏原的一種替代物，特別是用于過敏原標準物的制備，在過敏原研究中具有重要意義[33]。

重組表達系統主要包括原核表達系統、真核表達系統和無細胞表達系統，其中大腸桿菌原核表達系統因其成本低、表達量高、易于培養等優勢被廣泛應用于重組過敏原的表達。史云鳳等[27]以大腸桿菌原核表達系統成功重組表達了花生過敏原Ara h 1，并通過體內和體外致敏性評估方法證實重組Ara h 1與天然Ara h 1蛋白性質、致敏性相似。此外，目前已有多種由大腸桿菌表達系統獲得的重組過敏原被證實與天然過敏原具有相似的IgE結合性，并廣泛應用于過敏原組分診斷和抗原特異性治療等領域[11]。但是大腸桿菌作為一種原核表達宿主，也存在缺乏翻譯后修飾作用、無法使蛋白質形成正確折疊的空間結構等問題，而大多數過敏原屬于糖蛋白，且多肽鏈經過正確折疊形成的空間結構對某些過敏原的致敏性也有重要影響，因此糖基化、二硫鍵形成等翻譯后修飾過程是影響某些過敏原致敏性的關鍵因素[34]。Huang Yuhao等[24]以大腸桿菌表達宿主表達大菱鲆小清蛋白，對天然和重組小清蛋白等性質分析發現，重組小清蛋白鈣離子結合方式與天然蛋白有所差異，導致其IgG結合活性及消化穩定性弱于天然過敏原。前期Mao Haiyan等[12]證實rAK與nAK具有相似的IgE結合活性，但本研究通過體內實驗證實二者的免疫原性存在較大差異，rAK致敏BALB/c小鼠后，血清中特異性抗體水平顯著升高，但顯著低于nAK致敏組小鼠；Th2型細胞因子（IL-4、IL-13）水平也顯著低于nAK致敏組小鼠。RBL-2H3細胞的β-己糖苷酶釋放率檢測結果表明，rAK刺激效應細胞脫顆粒的能力較nAK弱，進一步證實盡管rAK的IgE結合活性與nAK相似，但在機體內，其免疫原性弱于天然過敏原。費丹霞[13]對rAK和nAK的理化特性分析比較發現，rAK分子中二硫鍵含量較nAK少，且其熱穩定性較天然蛋白差，在30 ℃時即產生多聚體。AK分子中的二硫鍵是其空間結構穩定性的關鍵，由此可推測，通過原核表達系統獲得的rAK由于無法形成二硫鍵而導致空間結構變化及理化特性改變，是其免疫原性弱于nAK的重要原因。因此，由原核表達系統表達的rAK無法完全替代天然過敏原，通過更換表達系統，實現rAK分子的翻譯后修飾和空間結構的正確形成是獲得高免疫原性rAK的重要措施。盡管如此，低免疫原性的重組蛋白被證實在應用于過敏性疾病的臨床診斷和過敏原特異性治療過程中有較高的安全性[35-36]，因此，rAK這種高IgE結合活性、低免疫原性的特點可為甲殼類水產品過敏性疾病的診斷和治療提供參考。

過敏原分子中抗原表位是抗體分子和免疫細胞識別抗原的基本單位，因此，對于食物過敏的研究逐漸深入至抗原表位水平，關于甲殼類水產品AK抗原表位的研究也已較為深入[14-15]。為進一步探究AK致敏的關鍵表位，本研究根據AK線性表位的分布情況及其結構域將AK分為AK-E1（AA 1～92）、AK-E2（AA 87～187）、AK-E3（AA 172～265）和AK-E4（AA 276～357）4 個部分，進行分段重組表達。以4 個分段表達產物免疫BALB/c小鼠，結果發現，AK-E2區域在機體內的免疫原性最強，而AK-E4最弱；利用RBL-2H3細胞模型對4 個分段表達產物刺激效應細胞的能力進行比較發現，AK-E2和AK-E4能刺激細胞釋放較高水平的β-己糖苷酶。從AK分子的抗原表位分布情況看，AK-E1、AK-E3主要為構象表位分布區域[10,14]，分段表達產物失去AK分子的空間結構，無法形成原有的構象表位，是該片段免疫原性較弱的重要原因；而AK-E2是AK分子中線性表位較為集中的區域[10,12,14-15]，刺激機體產生免疫反應的能力較強，因此，針對該區域通過食品加工或分子生物學手段改造AK有望有效降低AK的致敏性。AK-E4也是AK分子中線性表位分布較多的區域[10,12,14-15]，但其刺激機體產生AK特異性抗體的能力較弱，這可能與該片段長度較小有關，盡管如此，該片段對效應細胞具有較強的刺激作用，可能在機體過敏的效應階段發揮較重要的作用，有望用于食品中過敏原的檢測及蟹類過敏性疾病的診斷。

4 結論

本研究成功重組表達了擬穴青蟹AK的4 個區域，且利用BALB/c小鼠模型和RBL-2H3細胞模型對nAK、rAK及AK的分段表達產物進行了致敏性分析，證實通過原核表達系統獲得的rAK免疫原性較nAK弱，而AK分子中免疫原性較強的區域為AA 87～187，免疫反應性較強的區域為AA 276～357。相關結果為利用重組蛋白進行過敏原標準物質的制備以及食物過敏的診斷、治療提供了理論依據。