青香蕉果肉多酚成分鑒定及其對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

王 倩，王 娟，傅金鳳，盛 鷗

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641；2.廣東省農業科學院果樹研究所，農業農村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；3.廣東省香蕉精深加工與綜合利用工程技術研究中心，廣東 廣州 510641）

香蕉（Musaspp.）為芭蕉科芭蕉屬植物，栽培區域廣泛[1]，因其果肉香甜、細膩可口，深受消費者青睞。香蕉中含有多種生物活性物質，如多酚、低聚糖、抗性淀粉等[2-4]。多酚種類繁多，結構復雜，是植物體內的次生代謝產物[5]，多酚成分鑒定對明晰其生物活性具有重要意義。多酚是香蕉的重要活性成分，Pongsagon等[6]通過液相色譜-質譜聯用技術從香蕉多酚提取物中鑒定出柚皮苷、楊梅素糖苷和蘆丁等多酚類化合物。Jimenez等[7]從Plantain香蕉（Musaparadisiaca）果肉中提取得到槲皮素、兒茶素和沒食子酸。研究表明，多酚能夠預防和治療代謝相關疾病，如改善糖脂代謝紊亂、降血糖等[8-11]，這可能與多酚對淀粉消化酶的抑制有關（如改變酶的二級結構、疏水相互作用等）[12-13]，通過抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性、減少葡萄糖的產生和吸收等方式控制餐后血糖水平。Bhinge等[14]研究發現，香蕉果肉的乙醇提取物可抑制α-淀粉酶活性及葡萄糖擴散，從而實現降血糖效果。Plantain香蕉的甲醇提取物可降低糖尿病小鼠血糖濃度，且喂食劑量與降血糖效果顯著相關，其作用機制可能與機體內的葡萄糖利用有關[15]。同時，傅金鳳[16]前期研究發現，青香蕉粉干預能有效降低糖尿病大鼠初期空腹血糖，改善糖尿病癥狀，而多酚對淀粉消化酶的抑制作用可能是青香蕉降血糖的作用途徑之一。

為了解香蕉多酚的組成，初步探究其在青香蕉降血糖功能方面的作用，本研究采用大孔吸附樹脂純化香蕉果肉多酚，再通過超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯用（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-Exactive Orbitrap-mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS）技術鑒定其多酚組成，然后以阿卡波糖為陽性對照，分析香蕉果肉多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制類型。旨在提供香蕉果肉多酚組成的基礎數據，了解其對淀粉消化酶的影響，為香蕉資源的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青香蕉（Musaspp.Dajiao ABB group）購于廣東省廣州市農貿市場。青香蕉用乙烯利催熟，在黑暗密封環境中放置，按催熟時間取樣，以催熟當天為第0天，連續取樣7 d。經實驗測定，發現第3天的果肉多酚含量最高，因此取催熟后第3天的香蕉果肉為實驗材料，取果肉，液氮冷凍打粉，-80 ℃保存備用。

H-60大孔吸附樹脂 江蘇和成新材料科技有限公司；福林-酚試劑、α-淀粉酶（3 700 U/g）、3,5-二硝基水楊酸顯色劑 北京索萊寶科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）、對硝基苯-α-D-葡萄糖苷（純度≥98%）、對硝基苯酚 上海麥克林生物試劑有限公司；D(+)-無水葡萄糖（純度≥98%）上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ-300DE超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；721可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；Citation 5酶標儀 美國BioTek公司；LGJ冷凍干燥機 北京松源華興科技有限公司；UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS儀美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 香蕉果肉多酚提取

香蕉果肉多酚提取及分離純化：超聲輔助乙醇法提取→旋轉蒸發濃縮→粗提物→大孔吸附樹脂純化→旋轉蒸發濃縮→冷凍干燥→純化樣品

超聲輔助乙醇提取香蕉多酚，提取條件為乙醇體積分數70%、料液比（g/mL）1∶30、提取溫度20 ℃、提取時間10 min，提取液真空抽濾，濾液經減壓濃縮除去乙醇，收集得到多酚粗提液。采用大孔吸附樹脂對多酚粗提液進行純化，收集得到多酚純化液，經減壓濃縮后冷凍干燥，得到香蕉果肉多酚純化樣品。

1.3.2 香蕉果肉多酚成分鑒定

參照Li Wenfeng等[17]的方法，取10 mg香蕉果肉多酚純化樣品凍干粉末，制得1 mg/mL樣品液于4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm有機微孔濾膜。UPLC條件：Agilent PoroShell HPH-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，4 μm），流動相A為超純水（含1‰甲酸），流動相B為乙腈（含1‰甲酸），流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣體積5 μL；梯度洗脫，程序如表1所示。

表1 洗脫程序Table 1 Elution program

MS條件：負離子模式下運行的電噴霧電離源，保護氣（N2）壓力30 arb，輔助氣（N2）壓力10 arb，毛細管電壓3 200 V，毛細管溫度320 ℃，掃描范圍100～1 500m/z。

1.3.3 香蕉果肉多酚對α-淀粉酶的抑制作用分析

1.3.3.1 對α-淀粉酶活性的抑制作用

按照潘玥等[18]方法稍作修改，依次移取50 μL不同質量濃度（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL）香蕉果肉多酚樣品溶液、50 μg/mLα-淀粉酶溶液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）共100 μL于10 mL試管中，混勻后在37 ℃水浴鍋中水浴10 min，加入100 μL 10 mg/mL可溶性淀粉溶液，再次水浴10 min后加入150 μL 3,5-二硝基水楊酸顯色劑，沸水浴10 min后加入5 mL蒸餾水稀釋，在540 nm波長處測定吸光度。以阿卡波糖（與香蕉果肉多酚樣品液質量濃度一致）為陽性對照，以不加PBS的反應體系為實驗組（α-淀粉酶溶液50 μL+香蕉多酚樣品溶液50 μL+PBS 0 μL，反應體系共100 μL，其他組以此類推），不加酶的反應體系為背景組，不加抑制劑的反應體系為陰性對照組，不加酶和抑制劑的反應體系為空白組，按式（1）[19]計算抑制率，根據抑制曲線計算得到半抑制質量濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

式中：A1為實驗組吸光度；A2為背景組吸光度；A3為陰性對照組吸光度；A4為空白組吸光度。

1.3.3.2 對α-淀粉酶的抑制類型及抑制常數測定

參考趙一靈[20]的方法并作適當修改，以確定香蕉果肉多酚對α-淀粉酶的抑制類型和抑制常數。設置香蕉果肉多酚溶液質量濃度為0.0～2.0 mg/mL，可溶性淀粉溶液質量濃度為1.25～15.00 mg/mL，以1.3.3.1節中實驗組為反應體系測定吸光度。配制0.125～8.000 mg/mL葡萄糖標準溶液，以質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線回歸方程為y＝0.183 5x+0.014 6（R2＝0.999 1）。將反應體系吸光度代入標準曲線計算葡萄糖產生量，按式（2）[21]計算酶促反應初速率。

式中：v0為酶促反應初速率/（mg/（mL·min））；t為反應時間/min；c為反應體系中反應產物質量濃度/（mg/mL）。

以1/v0為縱坐標，底物濃度的倒數1/[S]為橫坐標，繪制Lineweaver-Burk雙倒數曲線，確定α-淀粉酶抑制反應類型，通過米氏方程（3）和雙倒數方程（4）分別計算α-淀粉酶的米氏常數（Km）及最大反應速率（vm）[22]。

式中：vm為最大反應速率/（mg/（mL·min））；[S]為底物質量濃度/（mg/mL）；Km為米氏常數/（mg/mL）。

根據中間復合物假說，利用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法，將米氏方程兩邊取倒數，可以得到方程式（4）。

采用混合型抑制Dixon方程（5）[23]進一步驗證抑制類型并確定抑制劑對酶的解離常數（KI）與抑制劑對酶-底物復合物的解離常數（KIS）。

式中：I為抑制劑濃度/（mg/mL）。

1.3.4 香蕉果肉多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用分析

1.3.4.1 對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

參考辛相余[24]的方法并稍作更改。移取40 μL不同質量濃度（5、10、20、40、80、160、320 μg/mL）香蕉多酚樣品溶液、0.4 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液、PBS共80 μL于96 孔板中，混勻后在37 ℃水浴鍋中水浴10 min，加入80 μL 6 mmol/L對硝基苯-α-D-葡萄糖苷溶液，5 min后于酶標儀中測定405 nm波長處吸光度，實驗分組及抑制率計算公式與1.3.3.1節一致，并繪制抑制率折線圖。

1.3.4.2 對α-葡萄糖苷酶的抑制類型及抑制常數測定

實驗方法與1.3.4.1節一致，以實驗組為反應體系測定吸光度，設置香蕉果肉多酚質量濃度為20～80 μg/mL，對硝基苯-α-D-葡萄糖苷質量濃度為0.5～8.0 mmol/L。以50～400 μmol/L對硝基苯酚標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線為y＝0.009 4x+0.068 6（R2＝0.999 3）。通過繪制反應體系的Lineweaver-Burk雙倒數曲線確定對α-葡萄糖苷酶抑制反應類型，各抑制動力學參數按式（2）～（5）計算。

1.4 數據處理

采用SPSS 13.0軟件中的LSD檢驗進行顯著性分析，采用Xcalibur 4.2軟件處理質譜數據，采用ChemDraw軟件繪制化學結構式。

2 結果與分析

2.1 香蕉果肉多酚組成

香蕉多酚提取物在負離子模式下的色譜峰分布如圖1所示，按出峰前后標注出28 個色譜峰，根據保留時間、一級碎片和二級碎片離子信息對化合物進行定性分析，經與標準品庫、文獻和人類代謝組數據庫比對，碎片信息和初步鑒定的單體組成見表2。

圖1 香蕉多酚提取物總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of polyphenols extracted from banana pulp

表2 香蕉多酚提取物成分分析Table 2 Compositional analysis of polyphenols extracted from banana pulp

通過與標準品比對保留時間、母離子和二級碎片離子m/z鑒定出16 種化合物，包括苯甲酸、檸檬酸、香蘭素和13 種多酚類化合物。以化合物16為例，該化合物在圖1中的保留時間為9.26 min，有母離子m/z463[M-H]-，丟失糖基碎片m/z162，產生苷元碎片m/z301 [A-H]-和m/z301 [A-2H]-，與金絲桃苷標準品的數據[25-26]相符，因此確定化合物16為金絲桃苷。以同樣方式鑒定出13 種多酚，包括酚酸類化合物（沒食子酸、原兒茶酸、丁香酸、對羥基肉桂酸和異阿魏酸）和黃酮類化合物（秦皮乙素、蘆丁、丁香醛、金絲桃苷、紫云英苷、柚皮苷、橙皮苷和沒食子兒茶素）。此外，鑒定出的苯甲酸是酚酸化合物（苯甲酸衍生物）的母體結構。

通過與文獻、數據庫比對，鑒定出其他12 種化合物。化合物3在m/z145處有[M-H]-母離子峰、碎片離子m/z101，二者與郝元元[27]對香豆素的鑒定結果一致，因此推測化合物3為香豆素。化合物5有母離子m/z137[M-H]-，產生碎片離子m/z93 [M-H-CO2]-，與楊婉等[28]鑒定出的對羥基苯甲酸碎片一致，因此推測化合物5為對羥基苯甲酸。化合物7在負離子模式下產生母離子m/z289，碎片離子m/z245 [M-H-CO2]-，與白芍藥[29]中兒茶素的質譜信息相符，因此推測化合物7為兒茶素。化合物13母離子[M-H]-m/z為385，失去1 個己糖苷（m/z162）得到碎片離子m/z223，是芥子酸苷元碎片，與Xavier等[30]鑒定的芥子酸-己糖苷結果一致，因此推測化合物13為芥子酸-己糖苷。化合物14在m/z639處有[M-H]-母離子，產生碎片離子m/z331、m/z315，與文獻[31]中3′-甲基-楊梅素-3-O-蕓香糖苷的碎片相符，其中m/z331是甲基楊梅素特征母離子，m/z316[A-CH3]-為楊梅素特征母離子，因此推測化合物14為3′-甲基-楊梅素-3-O-蕓香糖苷。化合物17（m/z259 [M-H]-）、24（m/z243 [M-H]-）、28（m/z277 [M-H]-）的相關碎片離子信息與金丹等[32]對安石榴苷代謝產物的研究結果一致，因此分別被鑒定為尿石素D、尿石素C和尿石素A。化合物18母離子為m/z593，失去1 個m/z309的中性片段，產生m/z285的二級碎片離子[M-H-308]-，為山柰酚苷元離子[33]，根據相對分子質量初步判斷m/z308中性片段為蕓香糖苷[34]，再結合文獻[35]對高羊茅中山柰酚-3-O蕓香苷的質譜分析結果，推測化合物18為山柰酚-3-O-蕓香苷。化合物19在m/z623處有[M-H]-母離子，產生碎片離子m/z477、m/z315，與文獻[36]報道的荷花花瓣中的異鼠李素-3-O-蕓香苷碎片信息相符，其中m/z315為異鼠李素苷元碎片，m/z477 [M-H-146]-為母離子丟失鼠李糖基中性片段產生的碎片離子，因此推測化合物19為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷化合物。化合物26 [M-H]-的m/z為301，碎片離子m/z為227，通過與文獻[32]中鞣花酸的質譜結果比對，被鑒定為鞣花酸。化合物27在圖1中峰面積最大，二級質譜圖（圖2A）及可能的裂解途徑如圖2B所示，母離子m/z329[M-H]-，碎片離子m/z311由母離子脫去1 個水分子得到，繼續脫去1 個水分子得到m/z293碎片離子，進而失去1 個酯基和2 個甲基產生碎片離子m/z229，與文獻[32,37]報道的二甲基鞣花酸質譜結果相符，因此推測化合物27為二甲基鞣花酸。

圖2 二甲基鞣花酸質譜圖Fig.2 Mass spectrum of dimethylellagic acid

與文獻及數據庫比對鑒定出的12 種化合物包括鞣花酸代謝產物（尿石素D、尿石素C和尿石素A）、香豆素和8 種多酚類化合物。多酚類化合物包括酚酸類化合物（對羥基苯甲酸、芥子酸-己糖苷）、黃酮類化合物（3′-甲基-楊梅素-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-蕓香苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷），以及單寧類化合物（兒茶素、鞣花酸、二甲基-鞣花酸）。香豆素是多酚類化合物中香豆素衍生物的母體結構。尿石素D、尿石素C和尿石素A屬于鞣花酸的代謝產物。

二甲基鞣花酸屬于單寧，尿石素A是鞣花單寧的代謝產物，二者為香蕉多酚提取物的主要色譜峰，說明香蕉多酚中含有豐富的單寧類化合物。單寧類化合物常見于未成熟的柿子、紅葡萄和石榴[38-40]等水果中，具有澀味。本研究中，青蕉果肉中豐富的單寧類化合物可能是令其產生澀味的原因[41]，隨著果實的成熟，單寧類化合物發生變化，澀味也逐漸消失。

綜上所述，利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術在香蕉果肉多酚提取物中共鑒定出28 種化合物。通過美國化學文摘數據庫CA檢索發現，香蕉果肉中曾鑒定出沒食子酸[42]、橙皮苷[43]、奎寧酸[44]、柚皮苷、蘆丁[6]、對羥基苯甲酸、異阿魏酸、原兒茶酸、丁香酸[45]、兒茶素、槲皮素[46]等多酚類化合物，而秦皮乙素、金絲桃苷、紫云英苷3 種多酚的報道較少。

2.2 香蕉果肉多酚對淀粉消化酶的抑制作用

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是能量吸收的關鍵酶，作用于淀粉的α-1,4糖苷鍵，前者隨機水解，后者順序水解，釋放葡萄糖為產物，引起機體血糖升高[47]。糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，臨床上檢測藥物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用是初步判斷藥物是否具有降糖效果的常用方法[48]。

2.2.1 對α-淀粉酶的抑制作用

香蕉果肉多酚提取物（以下簡稱香蕉多酚）對α-淀粉酶的抑制效果如圖3A所示，隨著質量濃度的增加，香蕉多酚對α-淀粉酶的抑制率呈現先升高后平緩的趨勢，在質量濃度0.125～2.000 mg/mL范圍內，阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制率高于香蕉多酚，IC50分別為0.15、0.53 mg/mL。香蕉多酚對α-淀粉酶活性的抑制作用弱于阿卡波糖，但抑制劑質量濃度為1.0 mg/mL時，二者抑制率差異不顯著，分別為（76.25±3.79）%和（82.75±2.29）%，因此，香蕉多酚對α-淀粉酶具有較好的抑制效果，可作為潛在的α-淀粉酶抑制劑。

圖3 香蕉多酚對α-淀粉酶的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of banana polyphenols on α-amylase

在不同質量濃度香蕉多酚的雙倒數圖中（圖3B），各直線相交于第3象限。文獻報道，隨著抑制劑質量濃度的增加，vm和Km均減小，為反競爭性-非競爭性混合抑制作用特征[49]。香蕉多酚對α-淀粉酶的抑制作用與上述特征相符，推斷為反競爭性-非競爭性混合抑制。以Lineweaver-Burk方程（表3）的縱截距（1/vm）和斜率（Km/vm）對香蕉多酚質量濃度作圖（圖3C、D），結合公式（5）計算得到香蕉多酚對酶-底物復合物的解離常數（KIS）及對α-淀粉酶的解離常數（KI）分別為0.705、2.823 mg/mL。研究表明，解離常數越小，復合物的結合越緊密[22]，本研究中香蕉多酚KIS＜KI，說明香蕉多酚對酶-底物復合物的親和力強于對游離α-淀粉酶的親和力，能夠通過與酶-底物復合物結合阻止淀粉分解為葡萄糖，從而產生降血糖效果。

表3 不同質量濃度香蕉多酚對α-淀粉酶抑制作用的Lineweaver-Burk方程Table 3 Lineweaver-Burk equation for the inhibition effect of banana polyphenols at different mass concentration on α-amylase

2.2.2 對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

香蕉多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制效果如圖4A所示，隨著質量濃度的增加，香蕉多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率呈先上升后平緩的趨勢，當質量濃度相同時，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率高于香蕉多酚，但隨著質量濃度繼續增加，二者差距逐漸減小。經計算，阿卡波糖和香蕉多酚的IC50分別為3.41、35.76 μg/mL，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制能力優于香蕉多酚，但質量濃度為160 μg/mL時，二者抑制率分別為（96.59±0.01）%和（92.54±0.69）%，無顯著差異，因此，香蕉多酚是潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

圖4 香蕉多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of banana polyphenols on α-glucosidase

隨著抑制劑質量濃度的升高，Km升高，而vm降低，各濃度的抑制直線相交于第2象限，為競爭性-非競爭性混合抑制的典型特征[50]，香蕉多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制曲線符合該特征（圖4B），由此推測為競爭性-非競爭性混合抑制。香蕉多酚抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk方程見表4，以Km/vm和1/vm對抑制劑濃度作圖，得到圖4C、D，并計算得到相關解離常數。香蕉多酚對α-葡萄糖苷酶的解離常數KI為29.89 μg/mL，對酶-底物復合物的抑制常數KIS為44.20 μg/mL，該抑制體系中KI＜KIS表明香蕉多酚對游離α-葡萄糖苷酶的親和力大于對酶-底物復合物的親和力，通過與酶緊密結合減少酶促反應的發生。

表4 不同質量濃度香蕉多酚對α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk方程Table 4 Lineweaver-Burk equation for the inhibition effect of banana polyphenols at different mass concentrations on α-glucosidase

3 結論

在青香蕉果肉多酚提取物中共鑒定出21 種多酚類化合物，包含7 種酚酸類化合物、11 種黃酮類化合物和3 種單寧類化合物。其中，單寧是青香蕉多酚的重要組成部分，并檢測出秦皮乙素、金絲桃苷、紫云英苷3 種多酚類化合物。香蕉多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制效果良好，對α-淀粉酶為反競爭性-非競爭性混合抑制，IC50為0.53 mg/mL；對α-葡萄糖苷酶為競爭性-非競爭性混合抑制，IC50為35.76 μg/mL。香蕉多酚對淀粉消化酶的抑制作用說明其可能是青香蕉降血糖功能的活性成分之一。