牛樟樹水提物中促進樟芝無性產孢的效應物鑒定及其添加量優化

李華祥，戴嘉寧，王娟娟，劉泊伶，吉 丹，羅志珊，陸震鳴，楊振泉,*

（1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫 214122）

樟芝（Antrodia cinnamomea），又名牛樟芝或牛樟菇，是一種珍稀藥食兩用真菌，隸屬于擔子菌門（Basidiomycetes）、多孔菌科（Polyporaceae）、薄孔菌屬（Antrodia）[1-2]，具有保肝護肝[3]、抗癌、抗腫瘤[4]、降血糖、降血壓、抗病毒[5]、抑菌[6]、調節免疫及調節腸道菌群[7-8]等多種功效。目前，樟芝的人工培養方式主要有椴木栽培、平皿培養、固態發酵和液態發酵（又稱深層發酵）[9]。其中，采用樟芝深層發酵所產生的無性孢子（即節孢子）接種取代傳統菌絲接種的樟芝深層發酵工藝由于具有接種量及種子質量可控、批次穩定性好、發酵周期短、活性物質產量高及易于規模化等優點，已成為目前最高效、最受歡迎的樟芝人工培養方式[9-11]。但是，該發酵工藝仍然存在不足，尤其是作為接種物的樟芝無性孢子產量較低，進而導致種子制備過程繁瑣耗時，并大幅增加了生產成本[12-13]。因此，提高樟芝深層發酵產孢量對提高樟芝深層發酵生產效益及促進樟芝大規模工業化生產的發展至關重要?；诖耍緢F隊前期也對促進樟芝深層發酵無性產孢效應因子篩選及其作用機制進行了大量研究[12-16]。

牛樟樹（Cinnamomum kanehiraeHay）是樟屬植物的一種，也是野生牛樟芝唯一的天然寄主，通常生長在氣候溫暖濕潤及土壤肥沃的高海拔地區[17-18]。牛樟樹本身具有抑菌、防腐、抗癌等功效[18-20]。此外，Zhang Zhang等[21]發現，在平皿培養樟芝時添加牛樟樹枝勻漿，可提高樟芝菌絲體中的三萜含量。轉錄組學分析發現，牛樟樹勻漿通過調節參與三萜生物合成的關鍵基因HMGR和SQS的表達來促進三萜合成；Zeng Wenwen等[22]發現，在固態發酵樟芝時添加牛樟樹葉乙醇提取物可有效促進樟芝菌絲體的生長及酚類化合物的合成；同時，Hsu等[23]發現，香樟樹枝水提物中的多糖類物質顯著促進樟芝菌絲體生長；Lu Zhenming等[24]發現，低質量濃度（0.05 g/L）的香樟樹枝石油醚提取物顯著促進樟芝深層發酵菌絲生長及三萜類物質的合成。以上研究證明，牛樟樹或其他樟屬植物中存在一些促進樟芝生長、繁殖或活性產物合成的物質。目前已從牛樟樹的樹干或樹葉中分離到香豆素、類固醇、木脂素、芝麻素、芫花素、苯甲酸-2-甲基丙酯等物質[20,25-26]。

本團隊前期研究了牛樟樹木屑的4 種溶劑（水、甲醇、乙酸乙酯及石油醚）提取物對樟芝深層發酵無性產孢的影響，結果表明，只有牛樟樹水提物（aqueous extract ofC.kanehiraeHay，CWE）顯著促進樟芝無性產孢，且在最佳質量濃度（60 μg/mL）下使樟芝產孢量較對照組（不添加CWE）提高58%左右[27]。但前期研究未對CWE中促進樟芝無性產孢效應物進行分離及鑒定等深入研究。因此，為了進一步完善上述研究，本研究采用液相色譜-質譜聯用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）分析法對CWE的不同有機溶劑萃取物進行成分分析，并對相關化合物促進樟芝無性產孢的效果進行驗證，最終明確CWE中促進樟芝無性產孢的物質并優化其最佳添加量，為進一步提高樟芝深層發酵無性孢子產量及促進樟芝深層發酵工業化生產提供理論依據和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樟芝菌株購自美國菌種保藏中心，編號為ATCC200183。

野生牛樟樹枯木 福建皓天生物科技有限公司；赤蘚糖醇（純度98%）、甜菜堿（純度98%）北京索萊寶科技有限公司；正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、葡萄糖、酵母粉、硫酸鎂及磷酸二氫鉀等常規試劑（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA124S電子天平 蘇州江東精密儀器有限公司；YXQ-50SII高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；XSP-18A顯微鏡 上海彼愛姆光學儀器制造有限公司；QT-3多功能搖床 上海琪特分析儀器有限公司；TG-16WS高速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；RE-52B旋轉蒸發儀 上海雅蓉生物儀器設備有限公司；DGX-9053B-2烘箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司；Dionex Ultimate 3000 LC-MS儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 CWE的制備

準確稱取20 g牛樟樹木屑，加入400 mL去離子水，90 ℃水浴提取3 h后，用4 層紗布過濾并收集濾液。重復提取3 次，合并濾液并離心（6 000 r/min、10 min、4 ℃）收集上清，再用旋轉蒸發儀將上清濃縮至黏稠狀后，75 ℃烘干并稱質量，即得CWE。用去離子水復溶CWE并使其最終質量濃度為10 mg/mL，即得CWE母液，分裝成10 mL每管后保存于-20 ℃冰箱中備用[27]。

1.3.2 CWE醇沉及萃取

1.3.2.1 CWE醇沉

取10 mL CWE母液，加入30 mL無水乙醇，混勻后于4 ℃冰箱靜置過夜，8 000 r/min離心10 min（4 ℃），分別收集上清和沉淀部分。其中，上清液部分置于75 ℃烘箱中濃縮至10 mL（若體積不足則用去離子水定容），即得CWE醇沉上清液；沉淀部分置于75 ℃烘箱中干燥后用去離子水復溶并定容至10 mL，即得CWE醇沉沉淀溶液。將CWE醇沉上清液和沉淀溶液保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2.2 上清液分級萃取

將10 mL上清液與10 mL正丁醇振蕩（200 r/min）混合30 min后，加入分液漏斗中靜置分層，收集上層正丁醇萃取相，75 ℃烘干后即得上清液正丁醇萃取物DCE；再將下層水相與乙酸乙酯等體積振蕩（200 r/min）混合30 min后，加入分液漏斗中靜置分層，收集上層乙酸乙酯萃取相，75 ℃烘干后即得上清液乙酸乙酯萃取物YZE；下層水相繼續與氯仿等體積振蕩（200 r/min）混合30 min，分液漏斗分層后，收集下層氯仿萃取相，75 ℃烘干后即得上清液氯仿萃取物LFE；上層水相濃縮烘干后，即為上清液萃取剩余物WTE。

1.3.3 上清液萃取物LC-MS檢測分析

將上述DCE、YZE、LFE及WTE分別用去離子水配制成質量濃度為20 mg/L的溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，取適量濾液加入檢測瓶進行LC-MS檢測分析，檢測條件[28]為：色譜條件：色譜柱：

ACQUITY UPLC?HSS T3（2.1×150 mm，1.8 μm）；自動進樣器溫度8 ℃；流速0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL；流動相：正離子0.1%甲酸溶液（C）-0.1%甲酸-乙腈（D），負離子5 mmol/L甲酸銨溶 液（A ）-乙腈（B ）；梯度洗脫程序：0～1 min，2% B/D；1～9 min，2%～50% B/D；9～12 min，50%～98% B/D；12～13.5 min，98% B/D；13.5～14 min，9 8%～2% B/D；14～20 min，2% D（正模式）（14～17 min，2% B（負模式））。質譜條件：儀器使用電噴霧離子源，正負離子電離模式，正離子噴霧電壓為3.50 kV，負離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣壓力30 arb，輔助氣壓力10 arb。毛細管溫度325 ℃，以分辨率60 000進行全掃描，掃描范圍m/z81～1 000，并采用高能碰撞解離進行二級裂解，碰撞能為30 eV，同時采用動態排除去除無必要的MS/MS信息。

1.3.4 樟芝深層發酵培養

將樟芝無性孢子按1.0×106個/mL接種到裝有100 mL液體培養基（含葡萄糖20 g/L、酵母粉2 g/L、MgSO4?7H2O 3 g/L、KH2PO43 g/L，pH 4.5）的500 mL錐形瓶中，于搖床中26 ℃、150 r/min培養11 d[29]。

1.3.5 CWE不同組分對樟芝深層發酵產孢量的影響

1.3.5.1 不同醇沉組分對產孢量的影響

將1.3.1節制備的CWE母液及1.3.2.1節CWE醇沉上清液和沉淀溶液用0.45 μm無菌微孔濾膜過濾除菌后，分別吸取600 μL加入100 mL滅菌冷卻后的液體培養基中（各組分終質量濃度均為60 μg/mL），再按1.3.4節方法進行接種和發酵培養，從第6天開始每日定時取樣檢測產孢量，以添加等體積（600 μL）去離子水作為空白對照。

1.3.5.2 不同上清液萃取組分對產孢量的影響

將1.3.2.2節CWE分級萃取后的4 個組分（DCE、YZE、LFE及WTE）分別用去離子水配制成質量濃度為10 mg/mL的母液，用0.45 μm無菌微孔濾膜過濾除菌后，分別吸取100、300、500 μL加入100 mL滅菌冷卻后的液體培養基中（各組分終質量濃度分別為10、30、50 μg/mL），再按1.3.4節方法進行接種和發酵培養，從第6天開始每日定時取樣檢測產孢量，以添加500 μL去離子水作為空白對照。

1.3.6 甜菜堿和赤蘚糖醇對樟芝深層發酵產孢量的影響

1.3.6.1 不同質量濃度的甜菜堿對樟芝產孢量的影響

將甜菜堿用去離子水配制成質量濃度為5 mg/mL的原液，再用去離子水分別稀釋至原液質量濃度的1/5及1/25，將原液和所有稀釋液用0.45 μm微孔濾膜過濾除菌后，分別吸取100 μL加入100 mL滅菌冷卻后的液體培養基中（甜菜堿終質量濃度分別為0.2、1.0、5.0 μg/mL），再按1.3.4節方法進行接種和發酵培養，從第6天開始每日定時取樣檢測產孢量，以添加等體積（100 μL）去離子水作為空白對照。

1.3.6.2 不同質量濃度的赤蘚糖醇對樟芝深層發酵的影響

將赤蘚糖醇用去離子水配制成質量濃度為5 mg/mL的原液，再用去離子水分別稀釋至原液質量濃度的1/2、1/5、1/10及1/20，將原液和所有稀釋液用0.45 μm微孔濾膜過濾除菌后，分別吸取200 μL加入100 mL滅菌冷卻后的液體培養基中（赤蘚糖醇終質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL），再按1.3.4節方法進行接種和發酵培養，以添加等體積（200 μL）去離子水作為空白對照。從第6天開始每日定時取樣檢測產孢量。發酵結束（11 d）后，檢測對照組和赤蘚糖醇最佳添加質量濃度組的生物量、胞內多糖產量及總三萜產量等指標。

1.3.7 樟芝深層發酵相關指標測定

1.3.7.1 產孢量和生物量測定

發酵結束后的發酵液用4 層紗布過濾，取適量濾液用血球計數板于光學顯微鏡下對樟芝節孢子進行計數并計算產孢量，單位為個/mL；同時，濾渣（即樟芝菌絲體）用去離子水沖洗3 遍后，放入75 ℃烘箱中烘干并稱質量，計算生物量，單位為g/L[27]。

1.3.7.2 胞內多糖和總三萜產量測定

將測完生物量的樟芝菌絲體粉碎后，準確稱取2 g加入10 mL蒸餾水，95 ℃水浴提取2 h，收集上清。重復提取3 次并合并上清，用旋轉蒸發儀濃縮至10 mL左右，再加入3 倍體積的無水乙醇，混勻后放入4 ℃冰箱中靜置過夜，8 000 r/min離心10 min（4 ℃），收集沉淀并置于75 ℃烘箱中烘干，稱質量并計算胞內多糖產量[27]。同時，采用香草醛-高氯酸法測定樟芝菌絲體中總三萜含量?？側朴眉状继崛?，采用分光光度計在550 nm波長處檢測吸光度，以齊墩果酸為標準品繪制標準曲線，根據標準曲線及生物量計算總三萜產量[27]。

1.4 數據處理

每組實驗均設置3 個生物重復，所有數據均采用平均值±標準差表示，采用Origin Pro 8.5軟件進行繪圖，采用SPSS 22.0軟件及單因素方差分析法進行差異顯著性分析，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 牛樟樹水提物醇沉上清和沉淀對樟芝產孢量的影響

前期研究發現，在培養基中添加60 μg/mL的CWE可顯著促進樟芝深層發酵無性產孢，產孢量較對照組提高58%左右[27]。由圖1可知，CWE醇沉沉淀對樟芝產孢量無明顯影響，而CWE醇沉上清明顯促進樟芝無性產孢且促進效果與CWE相當?？梢?，CWE中的效應物主要存在于CWE醇沉上清中。

圖1 CWE不同醇沉組分對樟芝產孢量的影響Fig.1 Effects of different fractions obtained from CWE by alcohol precipitation on the sporulation of A.cinnamomea

2.2 牛樟樹水提物醇沉上清萃取物對樟芝產孢量的影響

由圖2可知，10～50 μg/mL WTE對樟芝無性產孢均無任何促進效果，說明效應物已被萃取到有機溶劑中，在萃取剩余物中已無殘留或殘留量甚微；添加10～50 μg/mL的DCE對樟芝產孢亦無任何促進效果，相反，高質量濃度（50 μg/mL）的DEC明顯抑制樟芝產孢，說明DCE中幾乎不含效應物，甚至含有抑制樟芝無性產孢的物質；添加10～50 μg/mL的YZE和LFE均明顯促進樟芝無性產孢，且LFE的促進效果優于YZE。其中，YZE的最佳添加質量濃度為50 μg/mL，此時樟芝最大產孢量（6.33×107個/mL）較對照組提高35.35%；LFE的最佳添加質量濃度為30 μg/mL，此時樟芝最大產孢量（7.10×107個/mL）較對照組提高52.02%。上述結果表明，效應物主要存在于YZE和LFE中，且在LFE中的含量（質量分數）明顯高于YZE。

圖2 不同質量濃度的DCE（A）、YZE（B）、LFE（C）及WTE（D）對樟芝產孢量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of DCE (A),YZE (B),LFE (C)and WTE (D) on the sporulation of A.cinnamomea

2.3 上清液分級萃取組分LC-MS分析

為明確CWE中促進樟芝無性產孢的主要效應物，對CWE醇沉上清的4 個萃取組分進行LC-MS檢測分析，每個組分中質量分數排名前10的物質信息見表1。

表1 CWE醇沉上清液分級萃取組分中含量排名前10的物質Table 1 Top 10 most abundant compounds in different fractions obtained from the supernatant after alcohol precipitation of CWE

綜合表1和圖2的結果可知，LFE和YZE均明顯促進樟芝無性產孢，而LFE中質量分數較高（10%以上）的物質分別為赤蘚糖醇和7-甲氧基香豆素，YZE中質量分數較高（6%以上）的物質分別為甲吡唑、赤蘚糖醇和甜菜堿。因此，效應物應為赤蘚糖醇、7-甲氧基香豆素、甲吡唑和甜菜堿中的一種或幾種。DCE和WTE均無任何促樟芝無性產孢效果，而DCE和WTE中質量分數最高（13%以上）的物質均為甲吡唑，因此，可以確定甲吡唑并非效應物。同時，高質量濃度的DCE明顯抑制樟芝無性產孢（圖2），可見甲吡唑對樟芝無性產孢可能有抑制作用。此外，YZE中質量分數最高的物質也是甲吡唑，而LFE中甲吡唑的質量分數相對較低（排名第6），這解釋了LFE促進樟芝無性產孢的效果明顯優于YZE的原因。YZE中質量分數排名前10的物質并無7-甲氧基香豆素，LC-MS檢測7-甲氧基香豆素在YZE中的質量分數僅為0.37%?？梢?，7-甲氧基香豆素并非效應物。在促進樟芝無性產孢效果最好的LFE中，質量分數最高的物質為赤蘚糖醇，達12.78%。在促進樟芝無性產孢效果僅次于LFE的YZE中，赤蘚糖醇的質量分數排名第2，為6.78%。此外，有文獻報道，以赤蘚糖醇為碳源可以顯著促進哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和棘孢木霉（Trichoderma asperellum）分生孢子的產生[30]。因此，赤蘚糖醇可能為CWE中促進樟芝深層發酵無性產孢的主要效應物；甜菜堿在YZE中的質量分數與赤蘚糖醇相當，均為6%以上。在LFE中，甜菜堿的質量分數也在3%以上。因此，甜菜堿亦可能為效應物之一，但尚需進一步驗證。

2.4 不同質量濃度赤蘚糖醇和甜菜堿對樟芝深層發酵的影響

為驗證赤蘚糖醇和甜菜堿對樟芝深層發酵無性產孢是否具有促進作用，考察不同質量濃度商用赤蘚糖醇和甜菜堿對樟芝深層發酵無性產孢量的影響。由圖3可知，添加1.0 μg/mL甜菜堿對樟芝深層發酵無性產孢有輕微促進作用，最大產孢量較對照組提高7.36%，但二者之間并無顯著差異?？梢?，甜菜堿對樟芝深層發酵無性產孢無顯著促進作用。相反，高質量濃度（5.0 μg/mL）的甜菜堿對樟芝深層發酵無性產孢有明顯抑制作用。此外，添加1.0、2.0 μg/mL的赤蘚糖醇均明顯提高樟芝深層發酵無性孢子產量。其中，添加1.0 μg/mL的赤蘚糖醇時，最大產孢量達6.78×107個/mL，較對照組提高55.17%，促進效果較為明顯；添加2.0 μg/mL的赤蘚糖醇對樟芝無性產孢的促進效果略低于1.0 μg/mL；但當赤蘚糖醇的添加質量濃度高于5.0 μg/mL時，則對樟芝無性產孢表現出明顯的抑制效果，產孢量大幅下降。

圖3 不同質量濃度的赤蘚糖醇（A）和甜菜堿（B）對樟芝產孢量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of erythritol (A) and betaine (B)on the sporulation of A.cinnamomea

綜上所述，赤蘚糖醇確為CWE中促進樟芝深層發酵無性產孢的主要效應物，但促進效果具有嚴重的濃度依賴性。最適添加質量濃度范圍為1.0～2.0 μg/mL。當添加質量濃度過低（≤0.5 μg/mL）時，無明顯促進效果；當添加質量濃度過高（≥5.0 μg/mL）時，則表現出明顯抑制效果。

最后，考察赤蘚糖醇在最佳添加質量濃度（1.0 μg/mL）下對樟芝深層發酵生物量、胞內多糖產量及總三萜產量的影響。由表2可知，添加1.0 μg/mL的赤蘚糖醇對樟芝深層發酵過程中菌絲體的生長有顯著促進作用（P＜0.05），使生物量較對照組提高18.65%。同時，赤蘚糖醇對樟芝胞內多糖的合成具有較為顯著促進作用（P＜0.05），使胞內多糖產量較對照組提高260.13%，效果極其可觀。但是，赤蘚糖醇對樟芝深層發酵總三萜的合成及產量無顯著影響。

表2 赤蘚糖醇對樟芝深層發酵活性物質產量的影響Table 2 Effect of erythritol on the biomass and bioactive substance yield from A.cinnamomea in submerged fermentation

3 結論

CWE中促進樟芝深層發酵無性產孢的主要效應物為赤蘚糖醇，其最佳添加質量濃度為1.0 μg/mL，使樟芝產孢量較對照組提高55.17%。此外，1.0 μg/mL的赤蘚糖醇還顯著促進樟芝深層發酵過程中菌絲體生長及胞內多糖的合成，使胞內多糖產量較對照組提高260.13%，效果較為顯著。本研究成果可大幅提高樟芝深層發酵工業化生產過程中種子制備效率及胞內多糖生產效率，對推動樟芝深層發酵工業化生產進程具有重要意義。