濃香型白酒酒醅發酵過程中微生物群落結構演替及其與理化指標相關性

曾 波，饒家權，鄒永芳，文 靜，黃治國,3，鄧 杰,3,*

（1.四川輕化工大學 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.舍得酒業股份有限公司，四川 射洪 629000；3.中國輕工業釀酒生物技術及智能制造重點實驗室，四川 宜賓 644000）

濃香型白酒是中國白酒的典型代表，具有窖香濃郁、綿甜醇厚、香味協調、回味悠長等特征，深受消費者青睞，其產量和銷量比例占整個白酒行業的70%[1]。酒醅是濃香型白酒生產的重要微生物來源之一，包括酵母、霉菌、細菌在內的多種微生物對生產原料中大分子有機物分解能力較強，其代謝產物也可以作為白酒呈香物質的前體物，對白酒生產過程中香味物質的形成起關鍵作用[2]。因此，對白酒酒醅中微生物群落結構的研究成為近幾年白酒領域的研究熱點。

由于濃香型白酒發酵過程中窖內環境的變化，酒醅微生物呈動態、有規律的演變[3]。肖辰等[4]通過對濃香型酒醅細菌群落結構的演替規律研究發現，酒醅中乳桿菌屬（Lactobacillus）在發酵初期迅速增長，發酵中后期相對豐度呈緩慢上升趨勢，是酒醅中的絕對優勢菌屬。田瑞杰等[5]采用宏轉錄組學技術對濃香型白酒窖池酒醅微生物的差異表達基因進行研究，發現酒醅微生物的代謝差異富集在RNA降解與糖酵解，且下層酒醅的微生物對代謝活動的貢獻最大，酒醅發酵過程中微生物群落結構的組成不同，其代謝也會有所差異。Qian Wei等[6]對酒醅與窖泥微生物在濃香型白酒發酵過程中有機酸代謝的分工進行研究，結果表明，與乙酸、乳酸代謝相關的酶主要富集在酒醅中，這些酸隨后被窖泥菌群代謝為己酸和丁酸，酒醅與窖泥微生物合力推動濃香型白酒風味的形成。目前的研究主要是對酒醅發酵過程中的微生物群落結構解析，許多研究表明，乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、片球菌屬、地芽孢桿菌屬等是酒醅中的優勢細菌屬[7-8]，哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、伊薩酵母屬等是酒醅中的優勢真菌屬[9-10]，但濃香型酒醅中微生物的代謝尚不清晰，對不同發酵節點的濃香型白酒酒醅微生物的演替規律對代謝功能的影響研究較少，對微生物結構的復雜性、多樣性及動態變化情況等方面認識不足。

本研究以四川某濃香型窖池不同發酵節點的酒醅作為研究對象，測定酒醅樣品發酵過程中理化指標的變化規律，并借助高通量測序技術分析酒醅中微生物群落結構，使用冗余分析（redundancy analysis，RDA）、相關性分析研究微生物群落結構與理化指標的關聯性，并利用PICRUSt分析發酵過程中酒醅微生物群落代謝的差異，旨在為明確濃香型白酒的釀造機理提供科學依據，及為釀造過程中微生物的調控和代謝機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品：酒醅樣品取自四川某濃香型白酒廠生產窖池，每個樣品分別于窖池的上、中、下3 層采集（圖1），合并混合均勻后作為該發酵節點的酒醅樣品（約200 g）。在60 d發酵期內，分別從同一窖池取發酵5、10、15、20、30、40、50、60 d的樣品。樣品采集后暫存于-20 ℃，并及時進行酒醅微生物基因組DNA提取和理化檢測，每個樣品的理化指標檢測3 次。

圖1 取樣點示意圖Fig.1 Schematic diagram of sampling sites

E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒 上海晶諾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AR2140電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；DL-1電子萬用爐 北京市永光明醫療儀器有限公司；T100聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳儀 美國Bio-Rad公司；PiCo21臺式高速離心機 美國Thermo Fisher公司；NanoDrop2000 DNA含量測定儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅理化檢測方法

水分含量采用常壓干燥法測定；酸度參照DB 34/T 2264—2014《固態發酵酒醅分析方法》采用酸堿滴定法測定；淀粉與還原糖含量采用菲林試劑法[11]測定。

1.3.2 酒醅DNA的提取

細菌根據E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒說明書進行DNA提取，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000 DNA含量測定儀進行檢測，同時利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。真菌根據十六烷基三甲基溴化銨法，將提取的DNA加適量含10 ng/μL RNase的100 μL超純水溶解，37 ℃孵育1 h，分裝2 管，置于-20 ℃保存備用。

1.3.3 PCR擴增

細菌用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對V3～V4可變區進行PCR擴增，擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，27 個循環；最后72 ℃延伸10 min。擴增體系為20 μL：4 μL 5×FastPfu緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL引物（5 μmol/L）、0.4 μL FastPfu聚合酶、10 ng DNA模板。真菌通用引物ITS1FI2（5′-GAACCWGCGGARGGATCA-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）用于真菌ITS序列的擴增，序列長度205 bp。PCR擴增體系為：模板DNA 100 ng，ITS1FI2（0.5 μmol/L）和ITS2（0.5 μmol/L）各2.5 μL，Premix ExTaqTMHot Start Version 12.5 μL，加ddH2O補至25 μL。PCR程序：98 ℃預變性10 s；98 ℃變性10 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，33 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[12]。全部樣本按照正式實驗條件進行，每個樣本3 個重復，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR產物送至上海美吉生物技術有限公司進行測序，用于后續分析。

1.4 數據處理

原始測序序列使用Trimmomatic軟件質控，使用FLASH軟件進行拼接。使用UPARSE軟件，根據97%的相似度對序列進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，并在聚類過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數據庫（SSU123），參考京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫（https://www.kegg.jp/），采用PICRUSt（https://cloud.majorbio.com/）工具對導入的OTU分類信息文件進行在線功能預測，基于KEGG注釋結果，將擴增子序列變體（amplicon sequence variant，ASVs）與其內參序列比對，把ASVs置入相應的參考樹中，推斷每個ASV基因家族的拷貝數，預測每個ASV的基因含量，結合MinPath確定每個樣本基因家族的豐度；將基因家族信息與KEGG數據庫對應的功能進行比對，獲得每個樣本的功能信息和豐度信息，繪制代謝途徑，根據酶的豐度信息繪制氣泡圖。利用Origin軟件分析理化指標的變化規律，酒醅理化數據用平均值±標準差表示，通過Origin軟件及R語言進行微生物群落的變化規律分析、理化指標相關性分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 酒醅理化指標的變化規律

如圖2所示，淀粉含量在發酵前期呈持續下降趨勢，30 d后趨于平穩，質量分數維持在7.8%，酒醅在發酵前期淀粉含量較高，細菌、霉菌等迅速繁殖使得糖化酶活力增高，導致還原糖含量升高，但還原糖含量變化在整個發酵過程中呈下降趨勢，可能是由于5 d后酵母菌等大量兼性厭氧微生物大量繁殖，還原糖被迅速利用[13]。發酵后期微生物發酵能力減弱，還原糖與淀粉含量趨于平穩；發酵初期，酒醅中淀粉含量較高，微生物在利用淀粉時產生大量的熱量，同時糖化作用會產生大量水分，導致酒醅中的水分含量從發酵初期持續上升，水分含量在60 d達到最高，為74.01%；同時適宜的水分可以調節窖內溫度和降低發酵酒醅的酸度，影響酒醅發酵的質量[14]。酒醅中的有機酸是酒體重要的風味物質并且參與酯化過程，適宜的酸度可以抑制部分有害雜菌的繁殖[15]。酸度在整個發酵過程中呈上升趨勢，在30 d后趨于平穩，60 d時酸度最高，為3.57 mmol/10 g，窖內厭氧與兼性厭氧微生物代謝旺盛是酸度升高的原因之一。

圖2 發酵過程中酒醅理化指標的變化Fig.2 Changes in physicochemical indicators of fermented grains during fermentation process

2.2 酒醅微生物群落結構的α多樣性分析

經測序數據的處理，8 個酒醅樣品共得到445 296 條真菌有效序列和602 328 條細菌有效序列，由表1可知，所有樣品的覆蓋率均達到99.84%以上，表明酒醅樣品的測序結果能反映微生物群落全部信息，經分析，酒醅中的細菌OTU數量為134～481，真菌OTU數量為135～293，說明在發酵過程中，細菌的物種豐富度高于真菌。細菌Shannon指數為1.16～2.44，真菌Shannon指數為1.42～2.04，Shannon指數用于衡量物種多樣性，隨著發酵進行，酒醅中細菌的Shannon指數呈先升高后降低的趨勢，這與王鵬[16]、Zhang Yanyan[17]等研究結果相似，這可能是酒醅發酵前期存在大量來源于大曲的微生物，且酒醅營養豐富，適宜的酸度使酒醅微生物大量繁殖，導致酒醅細菌多樣性在10 d前增加，真菌的Shannon指數變化較小。酒醅中細菌的Chao1指數呈先升高后降低的趨勢，而真菌的Chao1指數波動變化，表明酒醅發酵過程中真菌和細菌的豐度在不斷變化。

表1 酒醅中微生物的α多樣性Table 1 α-Diversity of microbial communities in fermented grains

2.3 酒醅發酵過程中細菌群落演替規律

如圖3 所示，細菌群落中的厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）占主導地位；濃香型發酵酒醅主要存在12 個優勢菌屬（相對豐度＞1%），分別為Lactobacillus、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、unclassified_f_Enterobacteriaceae、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、Kroppenstedtia、不動桿菌屬（Acinetobacter）、片球菌屬（Pediococcus）等，在窖內發酵前期，Lactobacillus、Bacillus、Staphylococcus、Thermoactinomyces、Weissella、Pseudomonas、Klebsiella等是優勢細菌屬，Bacillus和Staphylococcus的相對豐度分別為5.3%～13.9%和0.4%～15.6%，隨著酒醅發酵進行，Thermoactinomyces、Weissella的相對豐度迅速下降。發酵15 d后，Bacillus、Staphylococcus等菌屬的相對豐度降低，Lactobacillus在發酵15～20 d相對豐度增加29%，15 d后成為酒醅發酵過程中的絕對優勢菌屬（相對豐度＞89.6%），Lactobacillus在酒醅整個發酵過程中占據絕對的優勢地位，相對豐度維持在47%以上，優勢細菌屬與高江婧[18]、翟磊[19]等研究結果一致。

圖3 細菌群落結構門水平（A）和屬水平（B）組成分布Fig.3 Distribution of bacterial community structure at phylum (A) and genus (B) levels

2.4 酒醅發酵過程中真菌群落演替規律

如圖4 所示，真菌群落中的子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）占主導地位；濃香型發酵酒醅中主要存在12 個優勢真菌屬（相對豐度＞1%），分別為Kazachstania、威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）、青霉屬（Penicillium）、unclassified_f_Aspergillaceae、季也蒙酵母屬（Meyerozyma）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、假絲酵母菌屬（Candida）、unclassified_f__Dipodascaceae、曲霉菌屬（Aspergillus）、Thermoascus等。其中，Kazachstania、Wickerhamomyces是濃香型白酒酒醅整個發酵過程中的優勢菌屬，在發酵5～10 dKazachstania的相對豐度為47%～53%，10 d后開始降低，但始終高于14%；Penicillium在發酵30 d相對豐度達到最高（12%），與細菌群落結構不同的是酒醅發酵過程中真菌存在多個優勢菌屬，Meyerozyma在發酵5～10、40～60 d是優勢菌屬，Debaryomyces在10～15 d相對豐度由0.4%增加到17.0%，Candida在10～15、40～60 d是優勢菌屬之一，此外Aspergillus、Thermoascus、嗜熱真菌屬（Thermomyces）等微生物均為濃香型白酒發酵過程中的優勢菌屬。

圖4 真菌群落結構門水平（A）和屬水平（B）組成分布Fig.4 Distribution of fungal community structure at phylum (A) and genus (B) levels

綜上，濃香型酒醅細菌以Lactobacillus、Bacillus、Staphylococcus、Thermoactinomyces為主，真菌以Kazachstania、Wickerhamomyces、Penicillium、Meyerozyma、Debaryomyces、Candida、Aspergillus為主，其中Lactobacillus、Kazachstania、Wickerhamomyces占絕對優勢。

由上述濃香型酒醅微生物群落演替規律可知，酒醅發酵前期與后期的微生物群落結構存在明顯差異，15～20 d是微生物群落結構劇烈變化的時期，Lactobacillus在發酵過程中相對豐度不斷升高，該菌具有較強的碳水化合物代謝能力，能夠將糖類轉化為乳酸，這可能是酒醅發酵過程中酸度不斷升高的原因，同時乳酸能與乙醇通過酯化反應生成濃香型白酒關鍵風味物質乳酸乙酯，還可以作為其他脂肪酸的底物[20]。Kazachstania、Wickerhamomyces等真菌屬在酒醅發酵過程中保持較高的豐度，Kazachstania廣泛分布于酸面團、泡菜、青貯飼料等植物乳酸發酵過程，同化乳酸，并水解葡萄糖醛酸苷作為異型發酵乳酸菌的代謝底物，促進其利用果糖產乙酸[21]。Kazachstania也是濃香型白酒酒醅微環境的標志性酵母種屬之一，對濃香型白酒風味有重要影響[22]。Jood等[23]研究發現，Kazachstania對酒體風味的貢獻主要體現在異丙醇和異戊醇。研究表明，濃香型白酒的發酵過程主要是微生物間的共同發酵，通過互相協調和抑制實現釀造過程中的微生物動態平衡[24]，微生物在發酵過程中的演替使酒醅菌群代謝更完整，同時與窖內酒醅的理化環境密切相關。

2.5 酒醅理化指標與微生物群落結構的相關性分析

根據微生物群落結構的組成，將不同發酵時間的酒醅分為2 個階段（5～15 d和20～60 d），通過相關性分析闡明酒醅樣品、發酵參數與微生物之間的關系。如圖5A、B所示，RDA結果顯示了細菌群落與真菌群落在樣品中的分布，解釋了不同發酵時期理化指標與酒醅樣品96.15%和65.27%的關系，說明樣品的分布與理化指標存在一定的相關性。水分、還原糖、淀粉含量對濃香型白酒風味物質具有強烈影響[25]，RDA表明，發酵前期細菌群落和真菌群落主要受到淀粉與還原糖的影響，Bacillus、Pseudomonas、unclassified_f_Enterobacteriaceae、Kazachstania、Wickerhamomyces與還原糖、淀粉含量呈正相關，發酵后期細菌群落和真菌群落主要受到水分含量與酸度的影響，Lactobacillus、Penicillium、unclassified_f_Aspergillaceae與水分含量、酸度呈正相關，可見在濃香型白酒發酵過程中，發酵參數的驅動力可能會影響微生物的組成結構。

圖5 酒醅發酵過程中理化指標與微生物相關性分析Fig.5 Analysis of correlation between physicochemical indicators and microbial communities

為了解理化指標對優勢菌屬的影響，通過Spearman系數評估微生物與理化指標的相關性，如圖5C、D所示，水分含量、酸度與Lactobacillus呈顯著正相關（P＜0.0 5），但與10 個細菌屬呈顯著負相關（P＜0.05）；還原糖含量與Lactobacillus呈顯著負相關（P＜0.05），與Pseudomonas、Enterobacter等8 個細菌屬呈顯著正相關（P＜0.05）；淀粉含量與Bacillus、Staphylococcus等8 個細菌屬呈顯著正相關（P＜0.05）。淀粉和還原糖含量與真菌中的Kazachstania呈顯著正相關（P＜0.05），與其他菌屬呈負相關，但相關性未達到顯著水平，水分含量和酸度與Kazachstania呈顯著正相關（P＜0.05），可見濃香型白酒發酵過程中的理化指標對真菌群落的影響較小，相關性分析表明，酒醅的酸度、水分、淀粉、還原糖含量與微生物菌群顯著相關，有研究表明，水分、還原糖、淀粉含量可作為酒醅微生物調控和香氣調控的指標，從而間接調節白酒的風味和品質，理化指標對濃香型白酒風味物質的影響通過微生物代謝實現[26]。

2.6 酒醅發酵過程中微生物代謝的變化

結合酒醅微生物物種注釋結果和KEGG數據庫繪制代謝圖，濃香型白酒酒醅發酵過程中微生物主要參與的代謝包括糖酵解、乙醇合成、酸代謝等（圖6A），不同發酵時期的微生物群落組成結構不同，解析不同發酵時期酒醅中微生物的潛在功能有利于了解發酵特性，通過PICRUSt標記基因序列預測不同發酵階段酒醅微生物群落的功能酶及其豐度信息，并繪制氣泡圖，如圖6B所示，隨Penicillium、Aspergillus相對豐度的增加，糖原磷酸化酶（EC2.4.1.1）、磷酸葡萄糖變位酶（EC5.4.2.2）、葡萄糖-6-磷酸異構酶（EC5.3.1.9）、果糖二磷酸酶（EC3.1.3.11）等表達水平開始上調，這些酶與淀粉代謝密切相關，這也解釋了淀粉含量在發酵10 d后迅速降低的原因，30 d后降低緩慢，淀粉會轉化為乙醇，可見前30 d是酒醅的主發酵期，發酵后期是微生物代謝產物的平衡。Lactobacillus在酒醅發酵過程中豐度不斷增加，與之相關的磷酸甘油酸激酶（EC2.7.2.3）、磷酸甘油酸變位酶（EC5.4.2.11、EC5.4.2.12）、磷酸烯醇式丙酮酸（EC4.2.1.11）、丙酮酸激酶（EC2.7.1.40）以及乳酸脫氫酶（EC1.1.1.27）多種酶的表達水平逐漸增高，表明可能是由于酒醅中乳酸脫氫酶的高表達積累了大量乳酸，使酒醅的酸度在發酵過程中不斷升高，Lactobacillus的存在可能影響糖酵解代謝過程中酶的表達。乙醛可以由乙醇脫氫生成，脫氫酶作為產乙醛途徑的關鍵酶，其在發酵中期的表達有利于乙醛的積累及濃香型白酒的酸代謝，該過程可能涉及Kazachstania、Sterigmatomyces的參與，這些菌屬能夠分泌淀粉酶及纖維素酶，也能夠在酒醅發酵前期為其他微生物提供營養物質，同時與酵母之間的相互作用影響原料的出酒率[27]。

圖6 酒醅微生物參與的代謝（A）及其相關酶的豐度變化（B）Fig.6 Metabolism involving microorganisms in fermented grains (A) and changes in the abundance of associated enzymes (B)

乙酰輔酶A是酸代謝途徑中合成脂肪酸的關鍵前體物質，醋酸輔酶A轉移酶（EC2.8.3.8）是己酸代謝途徑的關鍵酶，該酶在發酵中期的表達水平較高，有利于濃香型白酒主體風味己酸乙酯前體物質己酸的合成，該過程可能涉及Bacillus、Staphylococcus等菌屬的參與，Bacillus是酒醅中的重要功能菌，為白酒釀造過程提供豐富的淀粉酶或蛋白酶，對白酒風味物質具有重要影響[28]。黃治國等[29]將芽孢桿菌應用于小曲酒發酵，降低了小曲酒的高級醇含量。Staphylococcus能夠豐富濃香型白酒的風味，具有促進乙醇、醛類和酯類物質合成的潛力。通過PICRUSt預測發現，糖酵解代謝相關的功能酶在發酵前期較活躍，酸代謝相關的功能酶在發酵中后期較活躍，并且這些酶與酒醅中的優勢菌屬相關，可見在發酵過程中酒醅微生物的演替有利于濃香型白酒風味的形成。

3 結論

本研究基于高通量測序技術研究濃香型酒醅微生物的群落演替規律及潛在的代謝功能，結果表明：在門水平，Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteriota、Ascomycota、Basidiomycota是酒醅中的優勢菌門，在屬水平，Lactobacillus是發酵15 d之后酒醅中的絕對優勢細菌屬，Kazachstania、Wickerhamomyces是整個發酵過程中酒醅的優勢真菌屬，細菌多樣性隨著發酵的進行不斷降低，真菌多樣性在發酵過程中較為穩定，理化指標與細菌群落的相關性更強；通過功能預測發現，Penicillium、Aspergillus主要參與糖酵解代謝，該過程葡萄糖被降解為丙酮酸，隨后在厭氧條件下被Lactobacillus還原成乳酸，Bacillus、Staphylococcus等涉及乙酸、丁酸、己酸的代謝，Kazachstania、Sterigmatomyces等涉及乙醇的合成，酒醅中微生物群落結構的變化影響糖酵解、酸代謝、乙醇合成相關的酶，說明濃香型酒醅微生物的演替規律與風味物質代謝密切相關，目前關于濃香型酒醅微生物與風味物質代謝的機制尚不清晰，這將是后期研究的重點。綜上所述，本研究解析了濃香型白酒酒醅微生物的演替規律及其功能預測，為深入研究酒醅微生物在釀造過程中的作用提供了研究基礎。