水力空化處理對大豆分離蛋白與兒茶素相互作用及結構功能特性的影響

謝歡歡，任仙娥，宋楊鳳，楊 鋒

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西柳州螺螄粉工程技術研究中心，廣西 柳州 545006）

蛋白質是生命的基石，是健康飲食的重要組成部分，隨著世界人口的增加和生活水平的提高，人類對蛋白質的需求量越來越大。然而，動物蛋白不僅成本高，大量養殖還會導致水資源進一步枯竭、溫室氣體排放、抗生素耐藥性等全球性社會問題的加劇[1]。選擇植物蛋白是未來滿足人類蛋白質需求、改善蛋白質平衡、減少攝入與動物蛋白相關的脂肪、促進農業可持續發展的有效途徑。大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是一種重要的植物蛋白，具有高營養價值、低生產成本、優良的生物相容性和加工特性，廣泛應用于食品工業、農業、生物技術等領域[2]。但天然SPI很難同時滿足不同食品體系對其功能性質的需求。為拓寬其市場應用，可以通過修飾SPI的結構改善其功能特性。生物小分子物質常與蛋白質相互作用，影響其結構和功能特性[3]。兒茶素作為一種多酚類小分子物質，是膳食中重要的營養成分，可作為食品添加劑改善食品的風味和質地。兒茶素還具有很強的抗炎、抗菌和抗氧化等生理活性，可以清除自由基、減少炎癥，有助于預防心血管疾病[4]。

多酚可通過氫鍵、離子鍵、疏水相互作用等非共價的方式與蛋白質結合，還可通過C—N鍵或C—S鍵與蛋白質進行共價結合。蛋白質和多酚之間的相互作用會導致蛋白質的結構、功能和營養特性等發生較大變化[5]。因此，更好地了解蛋白質與多酚之間的相互作用，對于它們在食品工業中的應用至關重要。Rani等[6]發現，蘆丁和表兒茶素與大豆蛋白結合后，均能改善大豆蛋白的成膜性能，使膜的抗拉強度增加。Guo Yang等[7]研究發現，大豆蛋白與單寧酸在堿性條件下（pH 9.0～11.0）能共價結合，并且隨著單寧酸濃度的增加，大豆蛋白凝膠硬度、彈性、儲能模量和損耗能量也增大，凝膠的微觀結構也變得更加致密。Xue Feng等[8]發現，花青素-2-半乳糖苷作用于大豆蛋白后，能降低蛋白質的表面疏水性和平均粒徑，使其具有更好的溶解性和熱穩定性。Jiang Lianzhou等[9]研究發現，大豆蛋白與花青素的相互作用能提高蛋白質的抗氧化活性。這些結果表明，利用多酚類物質與蛋白質的相互作用不僅可以調控蛋白質的功能性質還能賦予蛋白質一些生物活性，具有較好的應用前景。

加工技術可對蛋白質的結構進行修飾，同時也可促進蛋白質與多酚的相互作用，改善蛋白質的結構和功能性質，以滿足不同食品體系的需求。Liu Jiayuan等[10]研究發現，超聲的空化和剪切作用可以破壞蛋白質結構，使蛋白質分子展開，暴露出更多的結合位點；同時，超聲的空化效應作用于H2O分子，產生氫自由基、氧自由基和羥自由基，促進蛋白質與多酚的結合。嵇威等[11]也發現，動態高壓微射流通過高速撞擊、高頻剪切等一系列高強度作用使蛋白質結構發生變化，促進蛋白質與多酚結合。水力空化技術作為一種新興的加工技術，是流體流經孔板、文丘里管、葉輪或轉子時，由于流速的突然變化引起壓力波動，產生空化泡，當空化泡潰滅時產生與超聲類似的空化效應，如剪切力、沖擊波、極端高溫和高壓、自由基等，這些效應能誘導或加速物質的物理或化學變化[12]。Niveditha等[13]研究發現，水力空化能破壞蛋清蛋白分子間的氫鍵和疏水相互作用，降低蛋白的黏度，改善其起泡性、乳化性和凝膠性，提高體外消化率。Gregersen等[14]研究發現，乳清濃縮蛋白經水力空化處理后，大的聚集體解聚，粒徑減小，黏度大幅度降低，貯藏穩定性增強。本課題組前期研究發現，水力空化可引起大豆蛋白的構象發生變化，進而改善其功能性質[15-16]。基于此，本研究進一步利用水力空化技術調控SPI與兒茶素的相互作用，開發制備功能性大豆蛋白的新技術，并從兒茶素與SPI相互作用模式和所形成復合物的結構變化揭示水力空化調控多酚-大豆蛋白互作制備功能性植物蛋白的作用機制，為開發功能性大豆蛋白制備新技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI（蛋白質量分數≥90%）山東禹王生態食品有限公司；兒茶素（純度≥98%）西安天廣源生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）（分析純）上海源葉生物科技有限公司；5,5′二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5′-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）（分析純）合肥巴斯夫生物科技有限公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）（分析純）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度≥96%）、2,2′-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）（純度≥98%）上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AE2204電子分析天平 湘儀天平儀器設備有限公司；JXN-26冷凍高速離心機 美國貝克曼庫爾特股份有限公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司；Zetasizer Nano納米粒度及Zeta電位分析儀 英國Malvern公司；Chirascan圓二色光譜儀 英國Applied Photophysis公司；UV-2600紫外分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；G9800A熒光分光光度計 美國安捷倫科技有限公司。

水力空化實驗裝置由實驗室自制，其結構示意圖見圖1，由離心泵（功率550 W）、儲液罐、恒溫水箱、孔板（孔徑3 mm、厚度20 mm）、壓力表、閥門和管路（直徑18 mm）組成。當流體流經孔板時，流速突然增大，壓力降低，當壓力低于該流體的飽和蒸汽壓時，流體汽化，同時溶解在流體中的氣體釋放產生大量空化泡，當空化泡隨流體進入下游壓力恢復區時，空化泡潰滅，從而產生空化效應。

圖1 水力空化結構裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of hydrodynamic cavitation device

1.3 方法

1.3.1 SPI-兒茶素復合物的制備

先將SPI和兒茶素分別充分溶解，然后將SPI分散液和兒茶素溶液混合，控制SPI質量濃度為10 mg/mL，兒茶素質量濃度分別為0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL，并調節pH值至7.0。混合液在室溫下持續攪拌30 min后用上述水力空化裝置處理30 min。以繼續磁力攪拌30 min、不進行水力空化處理的樣品作為實驗對照組。處理后，5 000 r/min離心15 min，將上清液用截留分子質量為8 000 Da的透析袋在純水條件下透析24 h，去除游離兒茶素，得到SPI-兒茶素復合物液體樣品，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 兒茶素與SPI結合量測定

參考金花等[17]的實驗方法，樣品（0.5 mL，SPI質量濃度0.1 mg/mL）與福林-酚試劑（2.5 mL，0.2 mol/L）避光反應5 min后，加入2 mL 81.08 mg/mL Na2CO3溶液，繼續避光反應2 h，測定760 nm波長處吸光度。以兒茶素為標準品，兒茶素質量濃度為橫坐標，紫外吸收強度為縱坐標，繪制標準曲線（y＝11.636x-0.008，R2＝0.999 4），根據標準曲線方程計算復合物中兒茶素的質量。兒茶素與SPI結合量用每克SPI結合兒茶素的質量表示，按式（1）計算。

1.3.3 紫外吸收光譜分析

將SPI-兒茶素復合物用去離子水稀釋至SPI質量濃度為0.4 mg/mL，利用紫外分光光度計在200～400 nm波長范圍內掃描，掃描速率為中速，得到光譜曲線。

1.3.4 熒光光譜分析

將SPI-兒茶素復合物用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.0）稀釋至SPI質量濃度為0.4 mg/mL，然后使用熒光光譜儀在室溫下進行熒光測定。參數設置如下：激發波長290 nm，發射波長300～400 nm，狹縫寬度5 nm。

1.3.5 游離巰基含量測定

參考李菊名[18]的實驗方法，將DTNB用Tris-Gly緩沖液（含0.09 mol/L Gly、0.086 mol/L Tris、4 mmol/L Na2EDTA、8 mol/L尿素，pH 8.0）配制成4 mg/mL的Ellman試劑，使用Tris-Gly緩沖液將SPI-兒茶素復合物稀釋至SPI質量濃度為3 mg/mL，然后將稀釋樣品（5 mL）與Ellman試劑（50 μL）室溫下避光反應1 h，測定412 nm波長處吸光度（A1）。用Tris-Gly緩沖液（50 μL）代替Ellman試劑（50 μL）作為對照組，測定412 nm波長處吸光度（A2），游離巰基含量按式（2）計算。

式中：13.6×104為摩爾吸光系數/（L/（mol·cm））；D為稀釋倍數；ρ為SPI質量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 游離氨基含量測定

參考賈士芳[19]的方法，采用OPA方法測定SPI-兒茶素復合物游離氨基含量。首先配制OPA試劑：取4 mL 40 mg/mL OPA溶液（溶劑為甲醇），加入100 mL 0.1 mol/L硼砂溶液、400 μL巰基乙醇和10 mL 250 mg/mL十二烷基硫酸鈉溶液，定容至200 mL，然后進行樣品測定。樣品溶液（400 μL，用去離子水調節SPI質量濃度至2 mg/mL）與OPA試劑（3 mL）于35 ℃恒溫水浴鍋中反應3 min，測定340 nm波長處吸光度。以標準品L-亮氨酸濃度為橫坐標，紫外吸收強度為縱坐標，繪制標準曲線（y＝0.789x+0.021，R2＝0.999 3），代入曲線方程計算得到游離氨基含量。

1.3.7 表面疏水性測定

參考劉紫薇等[20]的方法，用ANS作為熒光測定SPI-兒茶素復合物的表面疏水性。將SPI-兒茶素復合物用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.0）稀釋至SPI質量濃度為0.05～2.00 mg/mL。然后將稀釋樣品溶液（4 mL）與ANS溶液（20 μL，8 mmol/L）反應，測定其熒光強度。參數設置如下：激發波長390 nm，發射波長470 nm，狹縫寬度5 nm。

1.3.8 平均粒徑和Zeta電位測定

將SPI-兒茶素復合物用去離子水稀釋至SPI質量濃度為0.1 mg/mL，用0.45 μm濾膜過濾，然后用納米粒度及Zeta電位分析儀測定樣品的平均粒徑和Zeta電位。

1.3.9 圓二色光譜分析

將SPI-兒茶素復合物用去離子水稀釋至SPI質量濃度為0.05 mg/mL，然后在190～260 nm波長范圍掃描光譜曲線。掃描得到的光譜圖使用Pro-Data Chirascan軟件進行后續處理，并使用CDNN軟件對蛋白質的二級結構進行擬合。

1.3.10 抗氧化性測定

1.3.10.1 DPPH自由基清除率測定

參考Dai Shicheng等[4]的實驗方法，樣品（1 mL，SPI質量濃度0.1 mg/mL）與DPPH-乙醇（2 mL，0.175 mol/L DPPH，吸光度0.70以下）避光反應1 h，測定517 nm波長處吸光度A1。樣品與乙醇溶液（不添加DPPH）吸光度為A2，乙醇（不添加樣品）與DPPH-乙醇吸光度為A0。DPPH自由基清除率按式（3）計算。

1.3.10.2 ABTS陽離子自由基清除率測定

參考Jiang Lianzhou等[9]的方法，樣品（0.5 mL，SPI質量濃度0.1 mg/mL）與ABTS溶液（7 mmol/LABTS、2.45 mmol/LK2S2O8，pH 7.4，吸光度0.70±0.02）室溫反應18 min，測定734 nm波長處吸光度A1。樣品與磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）（不添加ABTS）吸光度為A2，磷酸鹽緩沖液（不添加樣品）與ABTS溶液吸光度為A0。ABTS陽離子自由基清除率按式（4）計算。

1.3.10.3 鐵離子還原能力測定

參考顧璐萍[21]的方法，充分混合樣品（0.3 mL，SPI質量濃度10 mg/mL）、磷酸鹽緩沖液（3.0 mL，0.2 mol/L，pH 6.6）和K3[Fe(CN)6]溶液（3.0 mL，10.1 mg/mL），于50 ℃水浴反應30 min，冷卻至室溫，加入三氯乙酸溶液（3.0 mL，111.11 mg/mL），混勻后靜置30 min，5 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，與去離子水（3.0 mL）、FeCl3溶液（0.5 mL，1.00 mg/mL）室溫下反應10 min，測定700 nm波長處吸光度。

1.4 數據處理與分析

實驗中圖表所示的數據均為3 次以上重復平行實驗取得，數據以平均值±標準差的形式表示，使用SPSS 26.0軟件進行數據分析，用方差分析中的鄧肯檢驗及配對樣品t檢驗計算數據間的差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著，并使用Origin 2021軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 兒茶素與SPI結合量

由圖2 可知，未經水力空化處理時，隨著兒茶素質量濃度的增加，SPI與兒茶素的結合量顯著增加（P＜0.05），這是因為蛋白質上的結合位點遠多于兒茶素分子的數量，所以兒茶素與SPI的結合量一直增加。當兒茶素質量濃度超過1.5 mg/mL，SPI與兒茶素的結合量不再發生顯著變化（P＞0.05），原因是此時蛋白質上的結合位點趨于飽和，SPI無法結合更多的兒茶素。Dai Shicheng等[4]研究也發現，當兒茶素分子數量低于SPI上的結合位點時，兒茶素與SPI的結合量增加；當兒茶素分子數量高于SPI上的結合位點時，兒茶素與SPI的結合量無明顯變化。

圖2 水力空化處理對兒茶素與SPI結合量的影響Fig.2 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the amount of catechin bound to SPI

在相同兒茶素質量濃度下，經水力空化處理后SPI與兒茶素的結合量較未處理組顯著增加（P＜0.05）。當兒茶素質量濃度為2.0 mg/mL時，水力空化處理能將兒茶素與SPI的結合量由處理前的（21.82±0.18）mg/g提高至（62.55±0.36）mg/g。原因是水力空化產生的剪切力等空化效應使SPI的結構展開，暴露出更多的活性基團，促進兒茶素與蛋白質的結合，從而提高兒茶素與SPI結合量。此外，水力空化能夠產生羥自由基，這些自由基一方面能使兒茶素氧化成醌，醌再與蛋白質氨基酸側鏈中的氨基或巰基反應形成C—N或C—S鍵，促進蛋白質與兒茶素的共價結合；另一方面，這些自由基也能使蛋白質側鏈上的氨基酸殘基被氧化，然后蛋白質分子上的自由基通過C—N或C—S鍵與兒茶素反應，形成SPI-兒茶素共價結合物[22]。

2.2 SPI-兒茶素復合物紫外吸收光譜

紫外吸收光譜可以反映蛋白質與兒茶素相互作用后的結構變化，由于蛋白質側鏈上的發色團如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等對紫外光有一定的吸收能力，而當蛋白質的空間構象發生變化時，發色團的微環境會發生一定程度的改變，從而影響紫外吸收峰[19]。

由圖3可知，添加兒茶素后，SPI-兒茶素復合物的紫外吸收強度增加，且隨著兒茶素質量濃度的增加，紫外吸收強度也明顯增加，這是因為兒茶素與SPI中的色氨酸和酪氨酸殘基間形成共軛體系，同時使π-π電子對能級發生躍遷，從而增強了紫外吸收強度。陳騏等[23]研究發現，黑米花青素作用于大豆7S/11S蛋白，使其紫外吸收強度增加。

圖3 水力空化處理對SPI-兒茶素復合物紫外吸收光譜的影響Fig.3 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the UV spectrum of SPI-catechin conjugates

同時，在相同兒茶素質量濃度下，水力空化處理后的SPI-兒茶素復合物的紫外吸收強度高于未處理組，原因是水力空化使SPI的結構展開，埋藏在蛋白分子內部的酪氨酸和色氨酸等發色基團暴露；同時，水力空化促進了蛋白質與兒茶素之間的結合，使二者間的作用力增強，SPI的構象發生變化，從而引起紫外吸收強度的變化。

2.3 SPI-兒茶素復合物熒光光譜

在激發波長290 nm下，色氨酸殘基可在300～400 nm的發射波長中產生熒光。色氨酸殘基熒光強度的變化反映蛋白質構象的變化，因此可以表征蛋白質三級結構的變化[24]。由圖4可知，添加兒茶素后，SPI-兒茶素復合物的熒光強度降低，且隨著兒茶素質量濃度的增加，熒光強度逐漸降低。發生這一現象的原因是蛋白質與兒茶素相互作用后，改變了蛋白質的空間構象，使色氨酸殘基的包埋程度增加，導致蛋白質的熒光猝滅[25]。同時，添加兒茶素后，蛋白質的最大吸收峰發生紅移，這是因為兒茶素是一種極性很強的分子，使色氨酸殘基周圍的微環境發生改變，變得更加親水，從而表現出明顯的紅移現象[26]。另外，經水力空化處理后，復合物的峰強度降低和紅移現象較未處理組更加明顯。這是因為水力空化處理促進了SPI與兒茶素的相互作用，使SPI結合了更多的兒茶素，導致熒光光譜的變化更明顯。

圖4 水力空化處理對SPI-兒茶素復合物熒光光譜的影響Fig.4 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the fluorescence spectrum of SPI-catechin conjugates

2.4 SPI-兒茶素復合物游離巰基和游離氨基含量

巰基和氨基對維持蛋白質分子的穩定性至關重要，還可能影響蛋白質的功能特性[27]。由表1可知，隨著兒茶素質量濃度的增加，SPI-兒茶素復合物的游離巰基和游離氨基含量顯著降低（P＜0.05）。由于在測定游離氨基和巰基時使用了可以破壞非共價鍵的變性劑，如尿素和十二烷基硫酸鈉，因此游離巰基和游離氨基含量的降低主要歸因于兒茶素與SPI在空氣中有氧的條件下通過C—N鍵和C—S鍵的共價結合。

表1 水力空化處理對SPI-兒茶素復合物游離巰基和游離氨基含量的影響Table 1 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on free sulfhydryl and amino group contents of SPI-catechin conjugates

在相同兒茶素質量濃度下，與未處理的SPI-兒茶素復合物相比，經水力空化處理的復合物游離巰基和游離氨基含量更低，其原因可能是由于水力空化能促進羥自由基的產生，因此，SPI中更多的游離巰基和氨基會被羥自由基氧化，使SPI成為活性蛋白，通過C—N鍵和C—S鍵與更多的兒茶素共價結合，導致游離巰基和游離氨基含量降低更多。

2.5 SPI-兒茶素復合物表面疏水性

蛋白質表面疏水性可以反映疏水性氨基酸殘基在蛋白質表面的分布，也可間接反映蛋白質結構的變化，是影響蛋白質功能特性的一個重要因素[28]。由圖5可知，隨著兒茶素質量濃度的增加，表面疏水性顯著降低（P＜0.05），這是由于添加兒茶素后，兒茶素與蛋白質的疏水性氨基酸殘基相互作用，占用ANS探針與SPI表面疏水基團的結合位點。這一結果與Xue Feng等[8]研究結果相似，該研究發現黑米花青素與SPI相互作用，能降低SPI的表面疏水性。Parolia等[29]研究也發現，槲皮素、蘆丁和鞣花酸均降低扁豆蛋白的表面疏水性。純SPI經水力空化處理后表面疏水性顯著增加（P＜0.05），這是由于水力空化產生強烈的剪切力，使蛋白質結構展開，疏水性氨基酸殘基暴露至蛋白質表面。但是，在相同兒茶素質量濃度下，水力空化處理后的SPI-兒茶素復合物的表面疏水性顯著低于未經水力空化處理的復合物，這是因為水力空化促進了蛋白質與更多兒茶素之間的結合，引入大量親水基團，從而使復合物的表面疏水性降低。

圖5 水力空化處理對SPI-兒茶素復合物表面疏水性的影響Fig.5 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the surface hydrophobicity of SPI-catechin conjugates

2.6 SPI-兒茶素復合物平均粒徑

由圖6可知，添加兒茶素后，未經水力空化處理的SPI-兒茶素復合物的平均粒徑顯著減小（P＜0.05），且隨著兒茶素質量濃度的增加，復合物的平均粒徑顯著減小（P＜0.05），這是由于未經水力空化處理的兒茶素與SPI間的相互作用增強，兒茶素與SPI主要以靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵等非共價的方式結合，形成了比較緊密的結構，從而使平均粒徑減小。這與Dai Shicheng等[4]的研究結果一致，蛋白質與兒茶素結合，復合物的平均粒徑減小。純SPI經水力空化處理后平均粒徑顯著減小（P＜0.05），原因是水力空化產生的剪切力或沖擊波等空化效應能破壞蛋白質分子間的相互作用，使大聚集體解聚，粒徑減小。但是在添加兒茶素后，隨著兒茶素質量濃度的增加，復合物平均粒徑顯著增加（P＜0.05），發生這一現象的原因是水力空化產生羥自由基，使SPI與兒茶素反應形成共價復合物，形成大聚集體，復合物的平均粒徑增大。

圖6 水力空化處理對SPI-兒茶素復合物平均粒徑的影響Fig.6 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the average particle size of SPI-catechin conjugates

2.7 SPI-兒茶素復合物Zeta電位

Zeta電位與蛋白質表面的電荷強度有關，反映靜電排斥或靜電吸引的強度[4]。由圖7可知，所有樣品都帶有負電荷，這是因為SPI帶有大量負電荷。純SPI經水力空化處理后Zeta電位絕對值顯著降低（P＜0.05），這說明水力空化處理使得蛋白質分子發生破碎，改變了蛋白質分子的電荷分布，蛋白質內帶正電荷的氨基酸（如賴氨酸、精氨酸）暴露，中和了蛋白質表面的負電荷[30]。隨著兒茶素質量濃度的增加，復合物的Zeta電位絕對值顯著增加（P＜0.05），其原因是兒茶素可以通過氫鍵和疏水相互作用等非共價鍵與SPI結合，也可以通過C—N鍵或C—S鍵等共價鍵與SPI結合，而兒茶素本身帶有負電荷，所以添加兒茶素增加了復合物所帶的負電荷。

圖7 水力空化處理對SPI-兒茶素復合物Zeta電位的影響Fig.7 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the zeta potential of SPI-catechin conjugates

2.8 SPI-兒茶素復合物圓二色光譜

圓二色光譜可以用于評價蛋白質的二級結構，蛋白質的二級結構依賴于氨基酸局部序列和分子不同部分之間的相互作用以及蛋白質分子內部疏水基團暴露程度[31]。由圖8可知，在190～260 nm波長范圍內，蛋白質的圓二色性發生改變，表明兒茶素復合物會導致SPI構象轉變。蛋白質分子中的二級結構（α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲）相對含量的變化可以反映蛋白質分子整體結構的變化[32]。

圖8 水力空化處理對SPI-兒茶素復合物圓二色光譜的影響Fig.8 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the circular dichroism spectrum of SPI-catechin conjugates

由表2可知，添加兒茶素使SPI-兒茶素復合物的α-螺旋和β-轉角相對含量增加，β-折疊相對含量減小，無規卷曲無明顯變化。這說明SPI與兒茶素相互作用后在一定程度上改變了蛋白質的二級結構，誘導多肽鏈二級結構單元間氫鍵發生重排，使蛋白質結構松動。這一結果與Zhou Siduo等[30]研究結果相似，該研究發現表沒食子兒茶素沒食子酸酯作用于SPI，使α-螺旋、β-轉角和無規卷曲相對含量增加，β-折疊相對含量減小。但是，金花等[17]研究發現，綠原酸作用于黑豆蛋白導致α-螺旋相對含量減小、無規卷曲相對含量增加。二級結構變化不一致主要是由于蛋白質和多酚的結構和種類不同，相互作用位點和模式也不同所導致的。

同時，在相同兒茶素質量濃度下，與未處理組相比，水力空化處理后SPI-兒茶素復合物α-螺旋、β-轉角和無規卷曲相對含量增加，β-折疊相對含量減小。這一結果是因為空化效應使得蛋白質結構展開，蛋白質與兒茶素之間的結合強度高于未經水力空化處理的強度，因此對蛋白質結構的影響更加顯著[33]。

2.9 SPI-兒茶素復合物抗氧化性

DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率和鐵離子還原能力是評價樣品抗氧化活性的常用方法[34]。由圖9可知，隨著兒茶素質量濃度的增加，復合物的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率以及鐵離子還原能力均顯著增加（P＜0.05）。這是因為兒茶素具有活性酚羥基，能作為H+與電子供體終止自由基鏈反應，與SPI結合后能賦予其自由基清除能力。另外，兒茶素也是一種具有強還原性的物質，其活性酚羥基可與鐵離子發生絡合作用，將Fe3+還原為Fe2+[35]，故復合物鐵離子還原能力也隨著兒茶素質量濃度的增加而增加。但是當兒茶素質量濃度超過1.5 mg/mL時繼續增加兒茶素用量，未經水力空化處理的SPI-兒茶素復合物的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率無顯著變化（P＞0.05）。這與兒茶素和SPI的結合量有關，圖2結果已表明，在兒茶素添加量為1.5 mg/mL時，二者的結合位點趨于飽和，因此，復合物的自由基清除率也趨于穩定。

圖9 水力空化處理對SPI-兒茶素復合物抗氧化活性的影響Fig.9 Effect of hydrodynamic cavitation on the antioxidant activity of SPI-catechin conjugates

此外，在相同兒茶素質量濃度下，水力空化處理后的SPI-兒茶素復合物的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率以及鐵離子還原能力顯著高于未處理組（P＜0.05），當兒茶素添加量為2.0 mg/mL時，DPPH自由基清除率由處理前的（48.64±1.24）%上升至（84.72±0.12）%，ABTS陽離子自由基清除率由（35.60±1.21）%上升至（75.51±0.79）%，鐵離子還原能力由0.81±0.02上升至1.52±0.05。這是因為經水力空化處理的復合物具有更高的兒茶素結合量，引入了更多的酚羥基，發揮出更強的抗氧化活性。

3 結論

水力空化產生的剪切作用能使SPI的分子結構展開，暴露出更多的結合位點，同時水力空化能夠產生羥自由基，這些自由基能使兒茶素氧化成醌，也能使蛋白質側鏈上的氨基酸殘基被氧化，促進兒茶素與SPI之間的共價相互作用，從而使更多的兒茶素與SPI結合。通過紫外吸收光譜、熒光光譜和圓二色光譜分析，證實水力空化處理能促進SPI-兒茶素復合物的形成，并使復合物的二級結構中α-螺旋、β-轉角和無規卷曲相對含量增加，β-折疊相對含量減小。同時，由于更多兒茶素的引入，經水力空化處理后的SPI-兒茶素復合物表現出更低的表面疏水性和游離氨基、巰基含量以及更高的抗氧化活性。可見，水力空化可作為一項有效的技術用于功能性食品蛋白質的開發。所制備的SPI-兒茶素復合物可用于構建抗氧化型乳液，實現食品中脂溶性易氧化營養與功能成分的有效載運與可控釋放。

另外，本研究雖然通過紫外光譜、熒光光譜和圓二色光譜等技術對SPI-兒茶素復合物的二級和三級結構進行表征，但是這些技術尚不能確定SPI與兒茶素之間具體的結合位點，下一步研究將通過分子模擬與對接技術來確定二者的結合位點，以更好地揭示它們之間的相互作用。