我國發酵魚制品菌群組成與風味代謝相關性研究進展

周冰倩，劉永樂，黃軼群，李向紅，王發祥，馬夏吟,*

（1.長沙理工大學食品與生物工程學院，湖南 長沙 410114；2.湖南省水生資源食品加工工程技術研究中心，湖南 長沙 410114）

發酵是一種古老的保存鮮魚的方法，通過發酵不僅可以延長魚肉的保藏期，還使魚肉的風味、質地、色澤及營養得到增強。發酵魚制品作為許多國家飲食文化的重要組成部分，深受國內外消費者喜愛，同時由于不同地區的發酵環境差異較大，發酵原料和工藝各具特色，因此各地的發酵魚制品風味迥異。根據不同分類標準，當前我國傳統發酵魚制品可以分為以下幾類（圖1）。根據發酵方式可分為傳統發酵和接種發酵。傳統發酵法利用環境所帶的微生物進行自然發酵，發酵魚產品品質受環境、季節和經驗等因素的影響較大，主要存在于家庭式小作坊中；而接種發酵通過添加微生物發酵劑，能夠穩定發酵魚中微生物組成、縮短發酵周期、提升風味品質，為傳統發酵魚制品提供工業化發展方向[1]。發酵原料中碳水化合物含量也會影響發酵過程中微生物代謝過程，如在酸魚和鲊魚的制作工藝中通常會添加熟制米粉，碳水化合物分解后產生的糖類為后續發酵提供能量，同時也產生特殊風味物質[2-3]。發酵魚中食鹽添加量對微生物菌群組成及風味形成有重要影響[2,4]。根據鹽添加量可將發酵魚分為高鹽發酵和低鹽發酵，高鹽發酵鹽添加量通常超過總質量的20%，而低鹽發酵鹽添加量占總質量的3%～8%[5]。在發酵過程中，多種微生物通過復雜的代謝過程促進了原料中碳水化合物、蛋白質及脂質的分解和氧化反應，從而產生了一系列低分子質量風味化合物，形成各地發酵魚獨特的風味[6]，而不同類型的發酵魚制品中微生物組成及代謝存在較大差異，且同一種發酵魚制品的菌群組成隨發酵時間的延長處于動態演變的過程中，因此探究不同發酵魚制品中微生物菌群組成及其與風味形成機制間的相關性是實現傳統發酵魚制品產業化的研究重點之一。

圖1 我國傳統發酵魚制品分類Fig.1 Classification of traditional fermented fish products in China

風味物質的形成與發酵魚中多種微生物的代謝活動相關，發酵魚制品中的微生物豐富多樣，可根據其對發酵的作用分為有益菌、致病菌和腐敗菌。當有益菌是優勢菌群時能夠抑制雜菌生長繁殖，同時促進良好風味物質產生，例如，乳酸菌在多種發酵魚制品中被鑒定為優勢發酵菌株，能有效抑制魏斯氏菌屬（Weissella）、毛殼菌屬（Chaetomium）等腐敗菌的生長，并產生令人愉悅的氣味[7]。隨著分子生物學技術的發展，宏基因組、宏轉錄組和宏蛋白組等多組學技術的聯用使人們對發酵魚中微生物的多樣性有了更多的認識[7]，而基于多維液相/氣相色譜-質譜及核磁共振技術的代謝組學技術推動了發酵魚中微生物代謝調控及特征風味的研究，進一步促進了發酵魚中微生物演替規律與風味物質形成相關性的研究[8]。不同發酵魚制品中揮發性風味物質的含量差別較大，據報道可將發酵魚中關鍵風味物質歸為醇類、醛類、酸類、酮類、酯類、酚類、含氮化合物、芳香化合物、含硫化合物、碳氫化合物等[9]。其中醇類化合物主要與碳水化合物、氨基酸和脂肪的代謝相關，具有蘑菇氣味[10-11]；醛類化合物是脂質氧化的降解產物或通過不飽和脂肪酸在微生物和酶的作用下降解產生[12]，具有令人愉快的氣味，如青草味、麥芽香味、水果香味和奶酪味[13-14]；酮類化合物是微生物發酵、氧化產生的多不飽和脂肪酸和氨基酸，具有甜味、花香和果香味[15]；酯類化合物通常是由醇和有機酸的非酶酯化反應或微生物的酶催化反應形成的，具有芳香氣味[16]。當前，標準化和規?；莻鹘y發酵魚制品的發展趨勢，因此對發酵過程進行規范化控制成為亟需解決的問題，而探究發酵魚中微生物菌落組成及其代謝與風味物質形成機制的相關性則是規范化控制的理論基礎。本文針對我國主要發酵魚制品的菌落組成、關鍵風味物質及其相關性的相關研究進行總結，為今后探索發酵魚風味形成機制及對發酵魚風味進行精準調控提供參考方向。

1 我國發酵魚制品菌群組成與風味代謝相關性

目前我國傳統發酵魚制品的種類約有8 種，其中關于酸魚、臭鱖魚、魚露及魚醬的研究報道較多，而魚茶、魚鲊等發酵魚制品的相關研究較少。由表1可知，在不同地區因原料不同導致在發酵過程中產生菌群也存在差異，因而每個地區發酵魚制品的風味獨具一格。

表1 我國常見傳統發酵魚制品Table 1 Common traditional fermented fish products in China

1.1 固態發酵魚

1.1.1 酸魚

酸魚是貴州省黔東南地區及江浙地區的一種傳統佳肴，根據食鹽添加量可將制作工藝分為高鹽發酵和低鹽發酵2 種。貴州地區的傳統高鹽發酵酸魚食鹽添加量約為20%，發酵條件為室溫（25 ℃左右）發酵4～7 個月，因其鹽含量較高，因此產品中生物胺、揮發性鹽基氮和丙二醛含量較低，具有較高安全性[17]。與高鹽發酵相比，低鹽酸魚食鹽添加量僅為2%～6%，更容易滋生腐敗微生物，因此在傳統發酵中往往通過控制發酵溫度或縮短發酵時間來提高酸魚品質，一般發酵條件為室溫（25 ℃左右）發酵4 周左右或在較低溫度（15 ℃左右）發酵24 d左右[4,18-19]。近年來采用低鹽與發酵劑結合強化發酵法制作酸魚，不僅能縮短發酵時間，還起到提升風味、提高產品安全性的作用[20]。

鹽含量及發酵條件的差異導致不同酸魚制品中微生物菌群出現差異。在高鹽發酵酸魚中常見報道的優勢細菌菌屬為植物乳植桿菌屬、四鏈球菌屬、葡萄球菌屬及魏斯氏菌屬[21-23]。其中植物乳植桿菌在發酵及風味形成中具有主導作用，且其耐鹽能力可達到20%左右[23]，其菌落數量與含鹽量具有顯著相關性[5]。四鏈球菌屬和葡萄球菌屬的耐鹽能力普遍較高，在30%鹽含量下仍然能生長[55]。而低鹽酸魚制品中菌群組成受發酵條件的影響較大。在Zang Jinhong等[24]的研究中，鯉魚肉經過3 g/100 mL鹽水腌制48 h、干燥3 h及與玉米粉混合后，在25 ℃條件下發酵4 周，期間酸魚中植物乳植桿菌和微球菌占主導地位，但其豐度在4 周內有較大的波動，此外葡萄球菌、乳酸乳球菌、明串珠菌、腸球菌及片球菌屬均占有一定的豐度；在Wang Zehan等[19]的研究中，鯉魚肉經過5%食鹽干腌、干燥、與香料混合后，在8%鹽含量下15 ℃發酵24 d，期間葡萄球菌在酸魚發酵前期及中期占絕對的主導地位，魏斯氏菌屬的豐度則在發酵后期（8～24 d）才逐漸由0.3%上升至46%左右，而植物乳植桿菌在其中占比非常少。除細菌外，酵母菌，如釀酒酵母、柯達酵母、結合酵母等，因其耐鹽性好且偏好在酸性環境中生長，也是酸魚中的常見微生物，與乳酸菌在酸魚風味的形成中起協同作用。相比自然發酵，接菌強化發酵對穩定酸魚中菌群組成起到了顯著作用[25]，微生物菌群的差異性及動態變化是造成酸魚制品間或發酵過程中風味物質差異性的主要原因，低鹽發酵酸魚因其微生物組成更為豐富，且符合當今減鹽發酵的健康理念，成為近年來的研究熱點。臧金紅[4]根據氣味活度值從傳統低鹽酸魚中篩選出乳酸乙酯、十六酸乙酯、4-乙烯基愈創木酚、2-辛烯醛、2-乙?；秽⑿了嵋阴ァ⒈郊兹┖彤愇焖岬汝P鍵風味物質。相關研究表明，醇類和酯類物質是低鹽酸魚風味組成中的重要部分，其中醇類物質在發酵初期含量較高，而酯類物質的含量在成熟期逐步升高[4,18-19]。Zang Jinhong等[24]通過層次聚類分析將酸魚的發酵過程分為3 個階段：第1階段（0 d）特征風味物質為1-辛烯-3-醇、丙酮、2-丁酮和2-乙基呋喃；第2階段（0～2 周）產生大量的酸、醛和醇類揮發性風味物質，奠定了酸魚的整體風味；第3階段（2～4 周）脂類大量產生，增加了酸魚的芳香氣味。脂類風味物質主要是通過酯化和醇解途徑生成的，可分為乙酸酯和脂肪酸乙酯2 類。風味物質的產生與發酵過程中微生物菌群演變密不可分，在植物乳植桿菌、木糖葡萄球菌及釀酒酵母混菌發酵的低鹽酸魚中，酵母菌豐度不斷降低，植物乳植桿菌豐度逐步提升，與之成正相關的乙酸異戊酯、乳酸乙酯及辛酸乙酯等酯類物質含量隨之增加[27]。在3 株菌單獨接種發酵中，植物乳植桿菌對酯類物質產生的促進作用最為顯著，而釀酒酵母對醇類物質含量的促進作用最為顯著[11]。同時Gao Pei等[26]對植物乳植桿菌、木糖葡萄球菌及釀酒酵母的脂肪代謝及乙酸酯合成能力進行考察，發現3 株菌均具有一定的酯酶活性，在低pH值和低水分活度條件下，植物乳植桿菌酯酶活性仍可以維持較高水平；此外，植物乳植桿菌產生乙酸酯的能力強于其余2 種發酵菌株，被認為是參與乙酸異戊酯生成的重要菌株[26]，主要通過堿性條件下酯化作用和酸性條件下醇解作用2 種途徑生成乙酸酯，其中涉及到的關鍵酶有羧酸酯酶、醇脫氫酶和醇?；D移酶[27]。以上研究表明釀酒酵母與酸魚前期醇類物質的產生相關，而植物乳植桿菌與酸魚發酵后期酯類風味物質的增加具有密切聯系。目前酸魚中菌群組成及特征風味物質如表2所示。

表2 不同發酵工藝酸魚中的優勢菌與特征風味物質Table 2 Dominant bacteria and characteristic flavor substances in traditional high-salt fermented fish produced by different fermentation processes

除發酵菌株對脂肪的利用外，微生物對碳水化合物、蛋白質的分解利用及相關風味物質的產生也受到越來越多關注[28]。酸魚發酵過程中肌漿、肌原纖維蛋白不斷分解成可溶性肽及游離氨基酸，使酸魚鮮味得到提升[29]，一方面有助于發酵有益菌（植物乳植桿菌和釀酒酵母）快速成為優勢菌株[30]，另一方面，游離氨基酸可作為前體物質通過微生物代謝為多種風味物質[31]。酸魚中高級醇、醛，如苯乙醇、苯甲醛和3-甲基-1-丁醇主要通過氨基酸代謝產生，涉及到的關鍵酶包括氨基酸脫羧酶、氨基酸轉移酶和酮酸脫羧酶，且分析表明，亮氨酸能夠在支鏈氨基酸轉氨酶和亮氨酸轉氨酶催化下生成3-甲基-1-丁醇，該代謝過程與葡萄球菌屬密切相關[25]。Zang Jinhong等[29]利用代謝組學分析酸魚發酵過程中風味物質形成的代謝途徑及與之相關聯的微生物，發現3 種酵母菌參與糖酵解過程，而隨后的丙酮酸代謝及混菌發酵過程由不同的微生物參與，其中植物乳植桿菌屬、片球菌屬及腸球菌屬參與乙酰輔酶A、有機酸、醇和醛生成的諸多過程，酸魚發酵中碳水化合物的利用過程不能由某一種屬的微生物單獨完成，即便是豐度較低的微生物也對發酵風味的形成有一定的貢獻，但是目前微生物利用碳水化合物及氨基酸產生風味物質的代謝途徑還有待深入研究。

1.1.2 臭鱖魚

臭鱖魚的傳統制作工藝分為干腌發酵法和水腌發酵法2 種：干腌法采用食鹽擦拭魚體，放入桶內自然發酵；而水腌發酵法則用淡鹽水噴灑魚體，層層鋪在容器內發酵，待魚鰓仍存淡紅、魚鱗未脫、魚肉散發出淡臭的風味但尚未變質時得到成品[32]。臭鱖魚的發酵過程是在低鹽（4%～8%）及厭氧條件下進行的短期發酵，發酵時間一般不超過8 d，參與發酵的微生物群落結構復雜且動態變化較大，因此掌控發酵程度，進行適度發酵才能產生似臭非臭的獨特風味[1]。對湖南、湖北和安徽地區14 個品牌的臭鱖魚進行研究發現，細菌群落結構差異顯著，漫游球菌屬、梭菌屬、嗜冷桿菌屬、植物乳植桿菌屬及肥大桿菌屬等在不同品牌臭鱖魚中占據優勢地位，而真菌菌群結構主要由霉菌構成，其中被孢霉門、毛殼霉菌屬、枝孢霉屬及赤霉菌屬的豐度較為相似[33-34]。另一方面，由于臭鱖魚多為整魚發酵，魚體背部與腹部的菌群組成也存在差異性，其中梭桿菌屬在臭鱖魚腹部的含量顯著高于其在背部魚肉中的含量，而變形菌屬含量則在魚肉腹部較高，這可能與腹部魚肉脂肪含量較高，更適合變形菌屬生長有關[35]。

目前臭鱖魚中微生物代謝與風味物質產生機制的相關研究多是通過多組學數據進行的相關性分析（表3），不同種類臭鱖魚風味物質鑒定結果表明，芳樟醇、醛類物質、吲哚及三甲胺等含氮物質是其中的特征風味物質[1,8,35-36]。其中含氮化合物是臭鱖魚特征性“臭味”主要來源，一些細菌，如希瓦氏菌、弧菌能在厭氧環境下將三甲胺氧化物還原為三甲胺[36]，梭菌屬則參與吲哚的產生，其前體物質可能為色氨酸[15]；嗜冷桿菌和弧菌可通過微生物酶的作用將脂肪氧化成脂肪醛類，從而促進己醛、庚醛、壬醛含量增多[9]；弓形菌屬、嗜冷菌屬和希瓦氏菌是鱖魚發酵產品中產生風味化合物芳樟醇、壬醛、三甲胺、D-檸檬烯、桉樹醇、己醛、1-辛烯-3-醇的主要微生物[37]；嗜冷桿菌、梭桿菌和氨基酸球菌有助于芳樟醇、三甲胺、吲哚和乙酸香葉酯等風味物質的形成，但嗜冷桿菌與梭桿菌的過度發酵可能會導致風味降低[9]。此外，Yang Daqiao等[8]通過多肽組學分析臭鱖魚風味肽形成過程中的蛋白酶，其中內肽酶主要為金屬內肽酶、天冬氨酸內肽酶和半胱氨酸內肽酶，而外肽酶主要為氨肽酶和羧肽酶，進一步通過代謝組學及相關性分析探究關鍵肽酶及風味肽的形成與漫游球菌、腸球菌、冷桿菌、乳球菌等菌屬之間的關系，與風味物質相關的具體微生物代謝通路尚有待實驗驗證。

表3 不同發酵工藝臭鱖魚中的優勢菌與特征風味物質Table 3 Dominant bacteria and characteristic flavor substances in stinky mandarin fish produced by different fermentation processes

不同于大部分酸魚制品中占優勢地位的乳酸菌，臭鱖魚中的優勢微生物多為腐敗菌或條件致病菌，如梭桿菌屬和嗜冷桿菌屬，這些微生物對臭鱖魚風味形成既有促進作用，同時也有負面影響，因此利用臭鱖魚中優勢菌屬進行強化發酵的相關研究較少，而接種乳酸菌發酵成為改善臭鱖魚口感和風味的方法[37]。Bao Ruiqi等[1]在臭鱖魚中接種乳酸乳球菌M10和食竇魏斯氏菌M3可縮短29%的發酵時間，且2 株菌能促進吲哚含量的增加。周迎芹等[34]發現，接種清酒乳桿菌SMF-L5發酵的臭鱖魚比自然發酵臭鱖魚具有更好的色澤、質構和風味品質，清酒乳桿菌SMF-L5可作為優良的乳酸菌發酵劑在臭鱖魚工業化生產上具有應用潛力。

1.2 半固態發酵魚

魚醬是一種深受我國消費者喜愛的半固體調味品，傳統制作方法需將魚塊與香辛料混合發酵1 年左右[39]，在發酵過程中，魚肉蛋白在內源酶及微生物蛋白酶的作用下發生水解，逐步由固體變成半固體狀，因此現代生產工藝中，往往通過破碎魚肉、添加外源蛋白酶或添加蛋白酶產量高的發酵劑加快蛋白的水解過程，縮短發酵周期至8 周左右[40]。研究表明，傳統發酵魚醬酸與采用現代發酵工藝制作的魚醬在菌群組成上具有顯著差異：雷山魚醬酸中占優勢地位的細菌菌屬為節桿菌屬（11.246%）和雷爾氏菌屬（10.929%）[41]；而在實驗室中自然發酵的魚辣椒醬優勢菌屬為乳桿菌（45.76%）和魏斯氏菌（36.49%）[41]，這可能與二者發酵環境及發酵時間的差異有關。

另一方面，傳統市售魚醬酸調味品的特征揮發性風味物質為酸類、烯萜類和酯類，這3 類風味物質含量占揮發性物質總量80%以上[41]，其中烯萜類物質大多數來自于香辛料和辣椒[41-42]，這類烯烴氣味強烈、閾值較低。在實驗室中，由具有較好蛋白分解能力的畢赤酵母、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌組成的混合發酵劑被用來制作魚醬[40,43-44]，發現經過強化發酵魚醬的風味組成發生變化：在揮發性風味物質中，酯類物質含量顯著提升，而醇類物質含量則減少，這與菌株的脂肪水解能力相關；氨基酸總量也顯著提升，其中甜味氨基酸（絲氨酸和甘氨酸）、鮮味氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）及風味物質前體氨基酸（支鏈氨基酸）含量與自然發酵組相比顯著增加[43]。在Zhou Yue等[45]對發酵魚醬的研究中，通過代謝組學分析發現，接種貝萊斯芽孢桿菌對氨基酸代謝通路的影響最為顯著，其中賴氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、支鏈氨基酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝均受到影響，氨基酸含量的增加不僅提供了甜味和咸味物質，同時氨基酸代謝的加強促進了琥珀酸、乙酸等風味物質生成。因此在魚醬的強化發酵中，菌株的酯酶活性和蛋白酶活性是首要考慮因素[45]，此外，還可以通過添加外源賴氨酸的方法提高發酵魚醬風味品質[46]。

1.3 液態發酵魚

魚露是一種由低值魚類及其加工副產物發酵制成的液體調味品，汁液呈棕紅色或紅褐色，不僅滋味鮮美且富含小分子、蛋白肽、礦物質元素、?；撬岬戎匾獱I養物質，是東南亞地區普遍使用的一種水產調味品。傳統魚露發酵方法是將原料與鹽混合，置于日光下，經過長時間腌漬和自然發酵后將發酵物進行過濾，再通過后期勾兌、煮沸滅菌等工藝得到成品[49]。傳統魚露發酵周期可長達2～3 年，因此食鹽添加量很高（可達20%）[50]，現代魚露在傳統工藝的基礎上，通過加曲、加酶、保溫等技術可達到縮短釀造周期、降低鹽度及減少腥味的目的[51-54]。傳統魚露發酵中占優勢地位的多為耐鹽能力較強的微生物，李春生等[52]研究魚露在12 個月發酵過程中的菌群演替規律，發現在前6 個月中鹽厭氧菌屬為主要優勢屬，其豐度從初期的3.08%增長至42.46%，但隨后鹽厭氧菌屬豐度有所下降，而發光桿菌屬、四聯球菌屬、鹽單胞菌屬的相對豐度增加，在發酵后期則以鹽單胞菌屬為主要優勢菌屬。Du Fangmin等[53]也有類似報道，在發酵后期四聯球菌屬代替鹽厭氧菌屬成為優勢菌屬。

目前已有研究報道了不同發酵工藝制作魚露中菌群組成及特征性風味物質，如表4所示。其中以耐鹽菌為主的發酵促使魚露形成了獨特的風味物質，在一些研究中3-甲硫基丙醛和1-辛烯-3-醇為魚露特征風味化合物[54-57]，其中3-甲硫基丙醛帶有土豆香味，1-辛烯-3-醇帶有蘑菇香味。通過代謝組學的相關性分析，發現3-甲硫基丙醛和1-辛烯-3-醇的產生與鹽厭氧菌具有正相關性[53]。此外，鹽厭氧菌屬還與魚露中三甲胺的產生具有正相關性，與乙酸乙酯的產生呈顯著負相關，尤其在發酵后期鹽單胞菌屬（Halomonas）對魚露的揮發性風味起到了重要的作用，從而抑制水果香味的形成，促進魚腥味的產生[54]。

表4 不同發酵工藝魚露中的優勢菌與特征風味物質Table 4 Dominant bacteria and characteristic flavor substances in fish sauce produced by different fermentation processes

研究發現，耐鹽菌體內的各種酶類在魚露的高鹽環境下也能保持活性，Wang Yueqi等[57]利用蛋白質組學方法分析魚露在12 個月發酵過程中的蛋白變化，發現在發酵中期（3～6 個月）魚露中的蛋白質含量最高、變化最大，而在所有鑒定的蛋白質中，氨基酸轉運與代謝相關的酶類蛋白質含量最高，肽酶在發酵過程中的變化較大。經過基因組比對分析，這些蛋白質多來自于鹽厭氧菌屬、嗜冷菌屬、發光桿菌屬和四聯球菌屬[58]。蛋白酶及肽酶水解蛋白質產生的氨基酸是多種風味物質前體，且研究[59]表明，魚露發酵過程中蛋白酶活性與風味物質呈正相關。

2 發酵魚中菌群組成與風味物質研究方法

2.1 發酵魚中風味物質的測定方法

風味在中文中是指嗅覺、味覺和三叉神經特性的復雜結合，包括滋味和氣味兩部分[60]，一直以來發酵食品的滋味和氣味都是研究熱點。因為發酵魚肉中揮發性風味物質的成分具有復雜性和不穩定性，不同提取方法、檢測方法及判斷標準得到的樣品中揮發性風味物質組成及含量可能存在差異。目前發酵魚制品揮發性風味物質提取及檢測鑒定的最常用方法為HS-SPME-GC-MS，該方法對大分子風味物質具有較高靈敏度，但對低分子質量及痕量化合物的分辨能力較弱[61]。一些研究中采用HS-GC-IMS方法測定揮發性風味物質，能夠顯著提高精確度和靈敏度，同時HS-GC-IMS可以清楚地反映發酵過程中魚肉風味物質組成變化，但是GC-IMS數據庫具有局限性，阻礙了對風味物質進一步定量分析[9]。人類嗅覺系統對不同的風味化合物存在不同的閾值，而GC-MS或GC-IMS只能通過數據庫鑒定出化合物的種類及含量，無法用于確定單一揮發性成分對最終整體風味的貢獻大小，因此，氣味活性值（odor active value，OAV）通常被用于評價風味物質對整體香氣的貢獻，對某種香氣物質而言，其OAV為含量與閾值的比值，OAV大于1時表明該物質是食品的關鍵風味成分[8,62]。在發酵食品中，一些含量較低的揮發性物質不能被GC-MS或GC-IMS檢測出，但其嗅覺閾值較低，OAV較高，可能是重要風味物質。隨著分子感官科學發展，GC-O逐步被用于發酵魚制品關鍵特征性風味物質的檢測中[31]。GC-O法是一種將嗅覺和儀器檢測結合起來的分析技術，利用人類嗅覺比任何儀器都要靈敏的特點，令嗅辨員在氣味儀出口處記錄所聞到的香氣，定性描述香氣信息及香氣強度[62]。此外，電子鼻是快速分析樣品中揮發性風味物質的一種方法，但該方法不能對風味物質進行準確的鑒定[63]。

以上所述的風味物質檢測方法各有優缺點，因此一些研究采用了多種方法結合的手段來準確、全面地分析發酵魚制品中的揮發性風味物質，如利用HS-SPME-GC-MS和GC-IMS結合、HS-SPME-GC-MS和電子鼻結合甚至3 種方法結合的手段鑒定風味物質。Nie Shi等[64]研究發酵鱸魚風味物質，分別利用GC-IMS和GC-MS鑒定出36、104 種風味化合物，其中20 種物質被2 種方法共同檢出，一些烴類化合物僅在GC-MS方法中被檢測到，這可能與GC-MS中采用了HS-SPME的提取方法從而獲得了更多的風味化合物有關。在對發酵草魚關鍵風味物質的研究中，利用HS-SPME-GC-MS和GC-O的方法分別鑒定出80、44 種風味化合物，共有21 種物質被2 種方法共同鑒定出來，其中OAV大于1的關鍵風味物質主要包括與水果香氣相關的乙酸乙酯、己酸乙酯等酯類，以及與刺激性氣味和不良風味相關的醛類（乙醛、己醛等）；此外，還可以將GC-O與GC-MS結合，采用GC-O-MS方法對特征風味物質進行定量描述[65]。

在對發酵魚制品非揮發性風味物質的研究中，探究游離氨基酸、游離脂肪酸及有機酸的組成及含量是分析影響發酵魚制品滋味的重要因素。此外，一些研究對樣品中可能的風味肽進行探究，Yang Daqiao等[8]通過組學技術研究表明，漫游球菌、消化鏈球菌、不動桿菌、嗜冷桿菌、腸球菌屬產蛋白酶微生物屬對鮮味肽的形成起主要作用。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，組學分析的方法越來越多地被用在發酵魚制品微生物組成及其代謝的研究中，代謝組學技術逐步被應用在發酵魚制品的風味物質檢測中，該技術能夠分析揮發性風味物質和非揮發性風味物質代謝物譜，并說明風味物質與非揮發性物質之間的相關性。

2.2 發酵魚中微生物菌群組成研究方法

復雜的微生物代謝是發酵魚制品風味形成的關鍵，因此，探究發酵魚制品中微生物菌群組成及其代謝網絡成為研究的熱點。近幾年，國內外對微生物的分析技術主要以高通量測序為主，由于細菌在發酵魚制品風味品質的形成中占主導作用，因此研究多針對細菌16S rRNA基因的V3～V4序列進行分析，探究發酵魚中細菌的菌群組成[19,36-37]；此外，發酵酸魚的研究中有學者以內部轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）序列為對象分析其中的真菌菌群組成[15]。除高通量測序以外，基質輔助激光解吸飛行時間質譜技術也被用來分析發酵魚制品中細菌的菌群組成[1]。以上2 種方法分別對發酵魚中的細菌和真菌菌群的組成及豐度進行分析，對樣品中全部微生物豐度進行分析的相關研究較少，而宏基因組學可以較好地解決該問題[19]。同時，宏基因組學能夠對環境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能進行分析，不僅能夠得到樣品中微生物菌群組成及豐度，還可以對微生物基因功能分布及次生代謝物生物合成途徑進行深入分析。

2.3 微生物代謝與風味物質形成的相關性研究

當前對發酵魚中微生物組成及代謝與風味物質形成之間的相關性，存在包括Spearman相關性分析、冗余分析、偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLS）分析、正交偏最小二乘回歸分析及雙向正交偏最小二乘（bidirectional orthogonal partial least squares，O2PLS）等多種分析方法。其中Spearman相關性分析僅能對2 組變量進行線性分析，而不能檢測多個變量之間的關系，一般用于微生物菌落與風味物質間相關性的初步分析[15,33-34,36]，此外，Yuan Li等[28]采用利氏腸球菌和乳酸腸球菌混合接種發酵，與自然發酵13 d的發酵魚進行研究，通過Spearman相關性分析表明蛋白酶活性和發酵魚質構與辛醛、壬醛等多種風味物質呈顯著正相關。更為常用的組學數據分析方法為PLS，PLS結合冗余分析不僅可用于微生物組學數據與關鍵風味化合物之間的相關性分析[10]，也可以用于多組風味化合物數據之間的比較分析[19]。而多組學數據之間的相關性常用O2PLS模型進行整合，O2PLS模型是偏最小二乘法的擴展，使用O2PLS模型進行組學相關性分析不僅可以獲得相關性系數，還可以獲得變量在模型中的權重變量投影重要性（variable important for the projection，VIP），該方法被廣泛應用于發酵魚制品中主要游離氨基酸、脂肪酸、特征性風味物質、關鍵微生物菌屬及關鍵酶類的預測。Yang Daqiao等[8]利用O2PLS模型，依據VIP≥1.2選取對臭鱖魚鮮味形成有貢獻的38 種鮮味肽，對臭鱖魚中產蛋白酶的10 株菌株與38 種鮮味肽進行Pearson相關性分析，得出漫游球菌屬、消化鏈球菌屬、不動桿菌屬、嗜冷桿菌屬、腸球菌屬對34 簇同源性基團鮮味肽的形成有重要作用。

3 結語

發酵魚制品因其較高的營養價值和感官、風味品質具有良好的市場前景和發展潛力，但發酵過程中微生物菌群組成的不確定性導致的風味品質不穩定是阻礙其市場化及規?；闹饕?，因此研究發酵魚制品微生物菌群組成與風味物質產生的相關性機制成為當前研究熱點。綜上所述，當前研究存在以下幾點問題：微生物菌群組成與風味物質形成的關系研究多是基于2 種或多種組學數據之間的相關性分析，結論多基于分析預測，缺少代謝通路、關鍵酶及關鍵基因在某類風味物質產生過程中的功能驗證等；得出的相關性分析結果未能反向指導發酵魚的生產過程，缺乏基于微生物菌群控制的發酵魚風味調控技術，相關理論有待進一步研究；利用優良菌株進行強化發酵是發酵魚產品工業化的發展方向，因此強化發酵條件下發酵劑對微生物菌群組成及風味物質代謝的影響機制有待進一步研究。