榛屬植物組織培養研究進展

摘要：對榛屬植物組織培養過程中的外植體選擇、外植體消毒、基本培養基確定、植物生長調節劑選擇等方面進行綜述，總結近年來榛屬植物組織培養技術的研究進展，提出未來的研究策略，以期為推動榛屬植物組織培養技術進一步發展提供參考。

關鍵詞：榛屬植物； 組織培養； 外植體； 植物生長調節劑

中圖分類號：S318 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2024）04-0019-04

榛屬植物隸屬于樺木科，在全球范圍內分布，約有20種不同的種類。在這些種類中，有13種被世界公認[1]，主要分布于北半球的溫帶地區。榛屬植物是重要的堅果和木本油料樹種，具有很高的營養價值和經濟價值。我國是榛屬植物的原產地之一，擁有8個種（平榛、毛榛、川榛、華榛、刺榛、滇榛、絨苞榛、維西榛）和2個變種（短柄川榛、藏刺榛）[2]。在國際上，歐洲榛是主要的栽培種類[3]，而我國主要栽培名為“達維”的平歐雜種榛。截至2020年，我國平歐雜種榛的栽培面積已達9.67萬hm2，主要集中在遼寧、吉林、黑龍江、山東等地區[4]。榛屬植物的繁育方法多樣，包括播種育苗、綠枝直立壓條育苗、組織培養快繁育苗、扦插繁殖和嫁接繁殖等[5-6]。在這些繁育方法中，組織培養技術不受地理環境和季節限制，能夠實現快速、高效繁殖，從而顯著提高繁殖系數。

1 外植體選擇

1993年，以體外培養的芽尖和節段作為外植體，在加入適量葡萄糖的培養基上，成功誘導出更多更長的不定芽[7]。2006年，以5月中旬采集的“魁香”幼嫩帶芽莖段作為外植體，在DKW基本培養基上的萌芽率為68.67%，同時期選取的“達維”莖段萌芽率僅為7.55%，說明不同基因型的榛屬植物存在微體繁殖的差異[8]。2009年，與傳統莖段外植體相比，以白色細嫩根蘗苗莖段作為外植體的污染率更低，存活率可達80.00％，并且萌發出的芽更健壯、生長速度更快，不會產生葉片黃化脫落現象[9]。2012年，以虎榛子嫩枝莖段作為外植體，在WPM培養基上的誘導率可達83.30%[10]。2022年，以盆栽植物帶有腋芽的莖段作為外植體，在改良的MS 培養基上成功取得生根[11]。2011年，以體外培養獲取的完整芽作為外植體，經適當濃度的BAP 處理，誘導產生3.5～3.8 個新芽，且新芽長度明顯增加[12]。通過誘導愈傷組織方式獲得再生的植株，其外植體通常選取榛屬植物的嫩梢、腋芽、葉片、子葉等。在平榛初代培養時，從外植體的分化效果看，頂芽明顯優于腋芽[13]。2015年，在以平榛雜交抗寒榛“84-226”子葉、葉片作為外植體的對比試驗中發現，以子葉作為外植體的愈傷組織誘導率達77.27%，而葉片愈傷組織誘導率為64.30%，原因是葉片污染率更高[14]。2019年，在以水培長出的葉片和組培苗的葉片作為外植體的對比試驗中發現，平歐雜種榛組培苗葉片在暗環境培養14 d，愈傷率達77.50%，而水培葉片在相同處理下，愈傷率達90.00%以上；相同暗處理下，組培苗葉片形成愈傷更快，且愈傷組織更為致密[15]。2016年，利用芽增殖周期結束時收集的葉片、葉柄、節間和托葉進行再生試驗，結果表明：在托葉形成的愈傷組織中沒有發現任何分化細胞的存在，而從葉片、節間和葉柄中獲得的愈傷組織中有許多管狀分子分化細胞，特別是能夠觀察到環狀或螺旋狀次生壁增厚的管狀細胞，從而證實外植體再生不定芽的可行性[16]。

2006 年，以未成熟果仁幼胚作為外植體，通過KT、2，4-D、NAA植物生長調節劑的配合使用，成功誘導出愈傷組織；同時發現，單獨使用6-BA或2，4-D不利于愈傷組織的誘導[8]。2010 年，花藥培養研究發現，在添加2，4-D、6-BA的MS培養基上，花藥愈傷組織的誘導率可達74.00%[17]。

外植體的取樣時間也會對榛屬植物組織培養結果產生影響。1997年，在針對“casina”品種的研究中發現，未成熟果實子葉表現出較高的胚性反應。同時研究表明，榛屬植物子葉內源激素平衡是決定其離體潛力的重要因素，可將IAA/ADA、IP型/Z型細胞分裂蛋白的比值作為衡量子葉外植體胚性發育能力的指標[18-19]。未成熟子葉胚性更強，會獲得更多的子葉外植體胚數[20]。2015年，發現5月份嫩枝的成活率顯著高于嫩梢和半木質化綠枝的成活率，其污染率（18.90%）、褐化率（26.70%）也最低，而4月份的嫩枝存在芽苗生長緩慢、新生和長大葉片畸形等現象[21]。上述研究結果顯示，榛屬植物組織培養可選取的外植體類型有莖段、葉片、芽、胚、子葉等，通過不同培養途徑均可獲得再生植株。在選取合適部位作為外植體時，應注意取樣時間。

2 外植體消毒

在榛屬植物組織培養過程中，選定合適的外植體后，以適宜的方法對外植體進行消毒顯得尤為重要。2008年，在芽的消毒過程中發現芽似乎對消毒產品特別敏感，存在組織壞死現象，這種現象在生長活躍的外植體中更為明顯。針對這一情況，有研究發現使用硫柳酸鈉比次氯酸鈉更有效，這是因為硫柳酸鈉能夠穿透細胞卻不引起壞死[22]。外植體消毒時間過長可以降低污染率，但也會降低誘導率。使用次氯酸鈉、氯化汞對外植體進行消毒，隨著消毒時間的延長，污染率下降，褐化率上升，這是因為消毒時間過長會加劇對芽苗的傷害[21]。對比使用0.1%氯化汞滅菌9 min與5%次氯酸鈉滅菌7 min對虎榛子外植體的污染率影響無差異，但前者平均發芽率和平均成活率更高[10]。2022年，在含苯扎氯銨的1%抗菌肥皂溶液中對外植體進行攪拌，再使用無菌蒸餾水沖洗，然后依次使用70% 乙醇、5.25% 次氯酸鈉、20 μL/100 mL吐溫-80進行浸泡，最后添加0.1%植物防腐劑混合溶液，外植體未污染率可達100%[11]。1975年，使用次氯酸鈣對未成熟的榛子種子進行表面滅菌，成功誘導出愈傷組織并獲得體細胞胚[23]。上述研究結果顯示，在榛屬植物組織培養過程中，可選取的外植體消毒試劑主要為乙醇、次氯酸鈉、氯化汞、硫柳酸鈉等。具體操作為：先使用一定濃度的乙醇短時間消毒，再選取合適濃度的次氯酸鈉、氯化汞溶液進行消毒，最后使用無菌蒸餾水沖洗[9，14-15，24-25]。根據外植體的不同來選擇合適的消毒劑、濃度及對應的消毒時間，是榛屬植物組織培養取得成功的關鍵。

3 培養條件

3.1 基本培養基選擇

在榛屬植物組織培養過程中，確定適宜的培養基是基礎條件。同時，不同基因型、不同部位外植體的基本培養基選擇，也是榛屬植物組織培養研究的核心內容。

張玲[14]研究發現，平歐雜種榛“84-226”在MS培養基上加入一定濃度的NAA、6-BA可獲得更多數量的可繼代苗。使用DKW培養基經幾次繼代后會出現“褐化”現象，導致生長緩慢甚至停止生長。對比MS 培養基，WPM培養基上的增殖率更低，但增殖過程中易形成愈傷組織。與張玲的研究結果不同，有學者在對“達維”“遼榛3號”“84-69”的研究中發現，MS培養基不適于榛子組培，適于培養壯苗的培養基是DKW 培養基，適于增殖培養的培養基是NRM 培養基[21]。2013年，在DKW、NRM、WPM及改良NRM等4 種培養基對比試驗中發現，改良NRM培養基更適于“遼榛7號”的生長，可作為其繼代培養的基本培養基[26]。“達維”初代培養最適宜的培養基為NRM+0.01mg/L IBA+0.10 mg/L GA3+5.00 mg/L 6-BA[15]。DKW 培養基對平榛萌芽率的影響顯著，培養25 d萌芽率可達84.85%，相同培養條件下MS培養基的平榛萌芽率為72.73%[13]，這與程云清等[27]的研究結果一致。虎榛子在WPM培養基上誘導率可達83.30%，顯著優于MS和1/2 MS培養基[10]。

1993 年，在對意大利圓形堅果“Tonda GentileRomana”和美國當地品種“Nonpareil”的芽培養研究中發現，DKW培養基在芽增殖、伸長和外觀方面優于WPM和Anderson培養基[7]。2020年，研究3種基本培養基（MS、NRM、DKW）對愈傷組織生長速率和褐變的影響發現，在初代培養中MS的生長速率最高，而在繼代培養中NRM的生長速率、增長率最高[28]。何偉[29]研究發現，適于平榛生根的培養基是1/2 MS培養基，經NAA處理后平榛生根率可達70.00%，且根系長勢粗壯。“魁香”試管苗在1/2 MS培養基上的生根率更高，生根數量更多，根系更為粗壯[8]。戰靜宜[15]研究發現，1/2 NRM 相對于1/2 DKW、1/2 MS培養基更適于榛子組培苗生根。榛屬植物組織培養常用的基本培養基有1/2 MS、MS、WPM、NRM、DKW培養基，其中DKW、NRM 培養基更適于榛屬植物的增殖培養，1/2 MS培養基更適于榛屬植物的生根。根據榛屬植物組織培養目標，選擇適宜的培養基能夠更好地保證榛屬植物組織培養的進行。

3.2 培養環境

溫度、光照時間等環境因子對榛屬植物組織培養影響顯著。1983 年，在空調室內黑暗培養20 d，60% 的外植體可在培養基上實現胚胎發生[25]。在25 ℃黑暗中培養，僅使用1.00 mg/L BA 就能誘導出52.50%的胚性子葉[20]。2022年，相同處理下，不同基因型生根結果不同。針對同種基因型的榛屬植物，培養50 d時，暗處理下平均生根數量是光處理下生根數量的4 倍[11]，這與MARDANI 等[30]的研究結果一致。此外，大部分學者[9，12，14，17]選擇榛屬植物組織培養環境為12～16 h的光周期。

4 植物生長調節劑選擇

4.1 對不定芽直接誘導途徑的影響

在NRM培養基上加入適當濃度的6-BA、IBA、腐胺、亞精胺、精胺，可以促進芽體的萌發與莖的伸長生長[9]。在添加0.50 mg/L 6-BA+0.03 mg/L NAA 的WPM培養基上，虎榛子芽的增殖率可達436.70%，增殖形成的苗莖粗壯，葉大而綠，生長狀況良好[10]。通過對比試驗可以看出，TDZ、BA、ZT這3種細胞分裂素中，TDZ對榛子芽苗的增殖效果最佳，對腋芽的增殖作用也最明顯，最優培養基濃度配比為DKW+1.50 mg/L TDZ+0.01mg/L IBA。將增殖較好的芽苗進行1～2次繼代后，應及時適當降低TDZ濃度或直接去除，防止TDZ的積累對其產生抑制作用[8]，這與宗長玲等[13]的研究結果一致。當TDZ濃度為0.20 mg/L 時，增殖系數可達2.2，葉片形態好，莖段粗，長勢強[29]。周亞琦等[26]研究發現，適當濃度的6-BA、IBA 組合更有利于促進榛子苗的增殖，單獨添加多胺對莖段增殖的效果明顯好于GA3，還能顯著增加單株芽苗芽數。

國外學者研究發現，玉米素能夠有效促進原始外植體的伸展生長，而BA則使新長出的嫩枝伸長最好。中等濃度（5.00 mg/L）BAP和高濃度（10.00 mg/L）BAP分別誘導產生3.8和3.5個新芽，且能增加新芽長度[12]。天然芳香細胞分裂素mT能夠促進柱狀莖的體外增殖和品質提升，對柱狀莖的離體生根和離體馴化不具有負面的攜帶效應，可作為6-BA的替代品[31]。常用于不定芽直接誘導的植物生長調節劑有6-BA、NAA、TDZ等。

4.2 對愈傷組織誘導與分化途徑的影響

以子葉作為外植體，愈傷組織誘導率可達58.30%，此情況下培養基濃度配比為MS 培養基+0.50 mg/L 2，4-D+1.00 mg/L 6-BA＋2.00 mg/L KT。對于花藥愈傷組織來說，在MS培養基+1.00 mg/L 2，4-D+1.00 mg/L 6-BA 上愈傷組織的誘導率最高[17]。將處理后的葉面向下接種于1/2 NRM 培養基+2.50 mg/L TDZ+0.50 mg/L IBA+0.10 mg/L GA3培養基上進行暗培養14 d，愈傷率可達90.00%[15]。在添加2.00 mg/L BAP+0.50 mg/L NAA 的誘導培養基上，可以明顯觀察到早期愈傷組織的形成，但只有在添加1.00 mg/L BAP+0.50 mg/L IBA+2.00 mg/L Kin 誘導培養基上才形成結節，推測這是一種分化標志[32]。常用于榛屬愈傷組織誘導與分化的植物生長調節劑有2，4-D、6-BA、BAP、KT等。

4.3 對體胚發生途徑的影響

研究發現，以MS 為基本培養基，KT、2，4-D 和NAA配合使用，更有利于誘導榛屬植物胚性愈傷組織，而單獨使用6-BA或2，4-D的效果不理想。適于誘導胚性愈傷組織的培養基濃度配比為MS培養基+0.50 mg/L KT+0.20 mg/L NAA +0.50 mg/L 2，4-D 和MS培養基+1.00 mg/L KT +0.50 mg/L NAA +0.20 mg/L2，4-D。還有研究發現，在培養基上單獨加入或不加入2，4-D均未能誘導出愈傷組織，這說明在平歐雜種榛從外植體誘導愈傷組織而獲得胚胎的過程中，2，4-D十分必要，且應與其他生長調節劑配合使用[8]。在不加入6-BA的培養基上，體細胞胚胎的誘導率非常低。研究發現，NAA+6-BA 的組合誘導體胚數量比2，4-D+6-BA組合誘導多。濃度為0.10～1.00 mg/L 的 NAA 中加入1.00～2.00 mg/L 6-BA 的子葉外植體產生體胚的比例超過15.00%。濃度為0.10～2.00 mg/L 的2，4-D培養基上存在6-BA時，體胚子葉外植體的萌發率較低，均在15.00%以下[20]。常用于榛屬誘導體胚的生長調節劑有6-BA、2，4-D、NAA等。

4.4 對生根的影響

增加NAA濃度會顯著提高榛屬植物的生根率。NAA濃度為0.20 mg/L時，生根率最高可達100.00%，且根的各項生長指標良好[10]。2020 年，研究發現，“Gercheh”生根的最佳處理為1.00 mg/L IBA+1.00 mg/LNAA；“gerdoyi”生根的最佳處理為50.00 mg/L IBA+0.50 mg/ L NAA[30]。此外，1.00 mg/L腐胺與1.00 mg/LIBA 聯合使用對“Tonda Gentile delle”生根具有促進作用。榛屬植物生根培養基一般選擇1/2 MS 培養基，并且附加一定濃度的IBA、NAA。

5 煉苗方法

將生根苗的瓶蓋打開，置于室外散射光下煉苗3～4 d，將試管苗洗凈根部后移植于蛭石∶草炭為1∶1 的基質中，移栽至大田成活率可達90.00％以上[9]。試管苗用水洗凈后浸入多菌靈溶液中消毒20 min，栽植于裝有蛭石∶草炭為1∶1的滅菌基質的營養缽中，成活率達90.00%[18]。平榛組培苗移栽至裝有滅菌河沙的育苗盤中，產生新根后再移栽至裝有腐殖土∶蛙石為3∶1 的基質營養缽中，移栽成活率達52.00%[29]。在榛屬植物組培煉苗、移栽過程中，常用蛭石、草炭等作為栽培基質。

6 展望

榛屬植物具有很高的營養價值和經濟價值，隨著對榛屬植物組織培養技術研究的不斷深入，大部分榛屬植物的組織培養已有一定的研究基礎，但尚不夠系統。對組織培養中常見的褐化、污染、玻璃化等問題的解決方法不夠清晰。就目前榛屬植物組織培養技術的研究情況來看，多數研究以榛屬植物不定芽直接誘導途徑為主，而愈傷組織誘導分化途徑、體胚發生途徑生成再生植株的方式還不夠成熟，存在分化困難的問題。同時，針對品種的研究還不夠徹底，如目前我國主栽品種“達維”的組織培養研究還有較大的發展空間。可將組織培養技術與生理、生化及分子生物學等進行融合，并在單倍體育種、種質資源保存、細胞突變體篩選等方面加以運用，以提高其利用價值。

參考文獻

[1] 馬慶華，楊振，姜磊.世界栽培榛發展現狀及在我國的引種利用[J].植物遺傳資源學報，2023，24（3）：599-614.

[2] 張宇和，柳鎏，梁維堅，等.中國果樹志·板栗榛子卷[M].北京：中國林業出版社，2005.

[3] MEHLENBACHER S A.Advances in genetic improvement of hazelnut[C]//Samsun （Turkey）：IX International Congress on Hazelnu，2017.

[4] 馬慶華，梁維堅，解明，等.平歐雜種榛良種“遼榛1號”的選育[J].果樹學報，2020，37（8）：1268-1270.

[5] 王貴禧.中國榛屬植物資源培育與利用研究（Ⅲ）——育種、育苗與栽培[J].林業科學研究，2018，31（1）：122-129.

[6] 劉庚，任軍，馮博，等.平歐雜種榛無性繁殖技術研究進展[J].吉林林業科技，2019，48（6）：5.

[7] YU X，REED B M.Improved shoot multiplication of mature hazelnut（Corylus avellana L.）in vitro using glucose as a carbon source[J].Plant Cell Reports，1993，12（5）：256-259.

[8] 劉家寧.平歐雜交榛莖段與胚培養技術體系的研究[D].烏魯木齊：新疆農業大學，2006.

[9] 劉劍鋒，程云清，陳智文，等.平歐雜交榛組織培養與快速繁殖技術研究[J].園藝學報，2009（3）：6.

[10] 薛麗寧，趙慧英，姚慶智，等.虎榛子組織培養及其菌根化技術研究[J].中國農學通報，2012，28（19）：17-21.

[11] PINCELLI-SOUZA P R，MOREIRA L S，COHEN J D.Improvements for the micropropagation of hybrid hazelnut（C. americana× C.avellana）[J].Horticulturae，2022（8）：849.

[12] THOMSON G E，DEERING T D.Effect of cytokinin type and concentration on in vitro shoot proliferation of hazelnut（Corylus avellana L.）[J].New Zealand Journal of Crop amp; Horticultural Science，2011，39（3）：209-213.

[13] 宗長玲，樸日子，曹后男，等.平榛離體培養技術的研究[J].遼寧林業科技，2009（5）：18-21.

[14] 張玲.抗寒雜交榛子微體繁殖技術研究[J].植物研究，2015，35（1）：146-149.

[15] 戰靜宜.優良榛資源組培快繁技術和葉片再生體系的進一步研究[D].沈陽：沈陽農業大學，2019.

[16] SILVESTRI C，CRISTOFORI V，CECCARELLI M，et al.Adventitious shoot organogenesis from leaf and petiole explants of European hazelnut[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture（PCTOC），2016（126）：59-65.

[17] 邵紅，李秀霞，肖志堅，等.雜交榛愈傷組織誘導和原生質體分離[J].東北林業大學學報，2010，38（10）：23-26.

[18] 劉家寧，高遐虹，秦嶺.平歐雜交榛的組織培養與植株再生[J].植物生理學報，2006（2）：260.

[19] CENTENO M L，RODRíGUEZ R，BERROS B，et al.Endogenous hormonal content and somatic embryogenic capacity of Corylus avellana L. cotyledons[J].Plant Cell Reports，1997，17（2）：39-144.

[20] AYGüN A，SAN B，ERDO?AN V.Induction of somatic embryogenesis from immature cotyledons in \"Tombul\" hazelnut[J].Tarim Bilimleri Dergisi，2009（15）：113-118.

[21] 胡愛雙，趙玉輝，劉鎮東，等.優良榛資源快繁體系的建立與優化[J].沈陽農業大學學報，2015，46（4）：476-480.

[22] BACCHETTA L.In Vitro propagation of traditional italian hazelnut cultivars as a tool for the valorization and conservation of local genetic resources[J].Hortscience A Publication of the American Society for Horticultural Science，2008，43（2）：59.

[23] RADOJEVI?L J，VUJI?I? R，NE?KOVI? M.Embryogenesis in tissue culture of Corylus avellana L[J].Zeitschrift für Pflanzenphysiologie，1975，77（1）：33-41.

[24] YU X，REED B M.Improved shoot multiplication of mature hazelnut（Corylus avellana L.）in vitro using glucose as a carbon source[J].Plant cell reports，1993（12）：256-259.

[25] PEREZ C，FERNANDEZ B，RODRIGUEZ R.In vitro plantlet regeneration through asexual embryogenesis in cotyledonary segments of Corylus avellana L[J].Plant cell reports，1983（2）：226-228.

[26] 周亞琦，梁麗松，黃綿佳，等.平歐雜種榛的繼代培養條件優化研究[J].中國農學通報，2013，29（1）：17-23.

[27] 程云清，劉劍鋒，陳智文.平榛組織培養與快速繁殖[J].林業科學，2008，44（12）：57-61.

[28] SHIRAZI M，RAEISPOUR S，ZOLALA J.A new approach to prevent hazelnut callus browning by modification of sub-culture[J].Biologia plantarum，2020，64（1）：417-421.

[29] 何偉.平榛優系的篩選及組培快繁技術的研究[D].延吉：延邊大學，2009.

[30] MARDANI N，KHADIVI A，VATANPOUR-AZGHANDI A.Micropropagation of three commercial cultivars of hazelnut（Corylus avellana L.）[J].Gesunde Pflanzen，2020（72）：41-46.

[31] GENTILE A，FRATTARELLI A，NOTA P，et al.The aromatic cytokinin meta-topolin promotes in vitro propagation， shoot quality and micrografting in Corylus colurna L[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture（PCTOC），2017（128）：693-703.

[32] SILVESTRI C，CRISTOFORI V，CECCARELLI M，et al. Adventitious shoot organogenesis from leaf and petiole explants of European hazelnut[J].Plant Cell Tiss Organ Cult，2016（126）：59-65.