Box-Behnken Design 響應(yīng)面法優(yōu)化銀杏葉提取物醇提水沉工藝*

畢艷艷，姜佳峰，孫紹明，劉 健，郭田甜，孫 艷，張 蘭，郝大偉△

（1.經(jīng)方與現(xiàn)代中藥融合創(chuàng)新全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東臨沂 276006； 2.魯南厚普制藥有限公司，山東臨沂 276006； 3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東臨沂 276006）

銀杏葉提取物是從天然藥材銀杏葉中提取、分離并富集得到的一類有效物質(zhì)，主要成分為總黃酮醇苷、萜類內(nèi)酯、多糖類、銀杏酸等［1-2］，已成為治療心腦血管疾病、癡呆癥、糖尿病并發(fā)癥等的重要藥物［3-7］。參考2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》銀杏葉提取物制備方法，采用稀乙醇回流提取［8］，根據(jù)總黃酮醇苷、萜類內(nèi)酯等有效成分與色素、鞣質(zhì)、樹(shù)脂等雜質(zhì)在水中的溶解度差異，通過(guò)低溫水沉方法進(jìn)行分離［9］，去除部分雜質(zhì)，純化銀杏葉提取物。本研究中通過(guò)Box - Behnken Design（BBD）響應(yīng)面法優(yōu)化銀杏葉提取物的醇提水沉工藝［8，10-15］，為后續(xù)提取放大生產(chǎn)及大孔樹(shù)脂柱層析純化銀杏葉提取物提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；UltiMate 3000型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo 公司）；R-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（瑞士Buchi 公司）；XS204 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬(wàn)分之一）；GZX -9240MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；DTC-15F 型超聲波清洗儀（鼎泰<湖北>生化科技設(shè)備制造有限公司，頻率為50 kHz）。

1.2 試藥

銀杏葉采集于山東臨沂郯城，經(jīng)魯南厚普制藥有限公司范建偉高級(jí)工程師鑒定為銀杏科植物銀杏的干燥葉，總黃酮醇苷含量為1.00%，萜類內(nèi)酯含量為0.38%；槲皮素對(duì)照品（批號(hào)為100081 - 201610，純度為99.10%），山柰酚對(duì)照品（批號(hào)為110861 - 202214，純度為97.4%），異鼠李素對(duì)照品（批號(hào)為110860 -201811，純度為99.1%），銀杏內(nèi)酯A 對(duì)照品（批號(hào)為110862 - 202213，純度為94.7%），銀杏內(nèi)酯B 對(duì)照品（批號(hào)為110863 - 201611，純度為95.6%），銀杏內(nèi)酯C對(duì)照品（批號(hào)為110864-201809，純度為94.0%），白果內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為110865-202108，純度為99.8%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；95%乙醇（食品級(jí)，費(fèi)縣大成酒業(yè)有限公司）；磷酸、鹽酸（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，天津鑫彩華豪化工有限公司）；四氫呋喃（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 銀杏葉提取物制備

取500 g 銀杏葉藥材，粉碎，按液料比8∶1（V/m）加入50%乙醇，提取3次，每次1.0 h，回收溶劑，將銀杏葉提取液濃縮為原藥材質(zhì)量的3 倍，得稀膏。取1 000 mL稀膏，加3倍純化水，攪勻，置冷庫(kù)（0～10 ℃）靜置冷沉，取上清液，抽濾，得銀杏葉提取物水沉液。

2.2 總黃酮醇苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件［8］

色譜柱：Agilent 20RBAX EXtend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50，V/V）；流速：0.8 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取槲皮素對(duì)照品31.30 mg，山柰酚對(duì)照品30.49 mg，異鼠李素對(duì)照品20.57 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，冷卻，定容，混勻，取5.0 mL，置100 mL容量瓶中，定容，即得對(duì)照品溶液Ⅰ。

精密移取稀膏或水沉液15.0 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加25%鹽酸溶液- 甲醇（1∶4，V/V）25 mL，超聲使溶解，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，85 ℃水浴加熱回流0.5 h，迅速冷卻，用甲醇轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，定容，搖勻，過(guò)濾，取濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 總黃酮醇苷含量測(cè)定

分別精密吸取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液Ⅰ和供試品溶液各10 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算槲皮素、異鼠李素和山柰酚的含量。按公式（1）計(jì)算醇提水沉工藝下銀杏葉總黃酮醇苷含量，按公式（2）（3）計(jì)算總黃酮醇苷轉(zhuǎn)移率。

2.3 萜類內(nèi)酯含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件［8］

色譜柱：Agilent 20RBAX EXtend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-四氫呋喃-水（25∶10∶65，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 溶液制備

取銀杏內(nèi)酯A對(duì)照品18.25 mg，銀杏內(nèi)酯B對(duì)照品8.16 mg，銀杏內(nèi)酯C對(duì)照品10.09 mg，白果內(nèi)酯對(duì)照品21.18 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，冷卻，定容，即得對(duì)照品溶液Ⅱ。

精密移取稀膏或水沉液20.0 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加甲醇適量溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，超聲0.5 h，取出，放冷，定容，搖勻，靜置；精密移取5.0 mL上清液，上樣于酸性氧化鋁柱，用25 mL甲醇洗脫，接收洗脫液，旋干，分次用甲醇5 mL 轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加4.5 mL 水，超聲0.5 h，取出，放冷，定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.3.3 含量測(cè)定

分別精密吸取2.3.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液Ⅱ10 μL 和20 μL 及各供試品溶液10 μL，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程分別計(jì)算醇提水沉工藝下銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯的含量，按公式（4）（5）計(jì)算萜類內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率。

2.4 干物質(zhì)測(cè)定

參考2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0831 干燥失重測(cè)定法［16］測(cè)定干物質(zhì)。精密量取稀膏或水沉液10 mL，置蒸發(fā)皿中，稱定質(zhì)量，100 ℃水浴蒸干，105 ℃干燥箱中干燥至恒定質(zhì)量，干燥器中冷卻30 min，稱定質(zhì)量，得干物質(zhì)。按公式（6）（7）計(jì)算稀膏和水沉液中干物質(zhì)得率。

2.5 醇提工藝單因素試驗(yàn)

液料比：按2.1 項(xiàng)下提取方法，按不同液料比4∶1、6∶1、8∶1、10∶1（V/m）加入50%乙醇，提取3 次，每次1.0 h，結(jié)果見(jiàn)表1。綜合考慮，選擇液料比為6∶1、8∶1、10∶1（V/m）進(jìn)行BBD響應(yīng)面法優(yōu)化醇提工藝。

表1 液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)醇提工藝的影響（%）Tab.1 Effects of liquid - solid ratio，extraction time，and extraction times on alcohol extraction process（%）

提取時(shí)間：按2.1 項(xiàng)下提取方法，按液料比為8∶1（V/m）加入50%乙醇，提取3次，每次提取0.5，1.0，1.5，2.0 h，結(jié)果見(jiàn)表1。綜合考慮，選擇提取時(shí)間為0.5，1.0，1.5 h進(jìn)行BBD響應(yīng)面法優(yōu)化醇提工藝。

提取次數(shù)：按2.1 項(xiàng)下提取方法，按液料比為8∶1（V/m）加入50%乙醇，分別提取1次、2次、3次、4次，每次1.0 h，結(jié)果見(jiàn)表1。綜合考慮，選擇提取次數(shù)為2 次、3 次、4次進(jìn)行BBD響應(yīng)面法優(yōu)化醇提工藝。

2.6 BBD 響應(yīng)面法優(yōu)化銀杏葉提取物醇提工藝

2.6.1 方案設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)原理［17］，以總黃酮醇苷轉(zhuǎn)移率（R1）、萜類內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率（R2）、干物質(zhì)得率（R3）的綜合評(píng)分（R綜）為響應(yīng)值，以液料比（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）為考察因素，優(yōu)化銀杏葉提取物醇提工藝。因素與水平見(jiàn)表2。2020年版《中國(guó)藥典（一部）》銀杏葉提取物測(cè)定項(xiàng)中的規(guī)定，總黃酮醇苷含量≥24%，萜類內(nèi)酯含量≥6%［8］。故工藝中總黃酮醇苷、萜類內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率越高，提取物中總黃酮醇苷、萜類內(nèi)酯含量就越高，權(quán)重系數(shù)均設(shè)為40%；干物質(zhì)得率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為20%。按公式（8）計(jì)算綜合評(píng)分（R綜）。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 醇提工藝因素與水平Tab.2 Factors and levels of alcohol extraction process

表3 醇提工藝方案設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Design scheme and results of alcohol extraction process

采用Design-Expert v8.0.6軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立回歸模型擬合方程R綜= -83.58+28.08A+ 49.24B+ 19.67C+ 1.64AB+ 0.38AC+2.11BC-1.83A2-28.57B2-3.92C2，R2= 0.986 5。結(jié)果模型P<0.000 1，表明醇提工藝模型回歸極顯著；失擬項(xiàng)P=0.379 7>0.05，表明失擬項(xiàng)結(jié)果不顯著。結(jié)果顯示，回歸模型擬合度高，合理可行，可用于對(duì)醇提工藝綜合評(píng)分（R綜）的預(yù)測(cè)和分析；因素A，B，A2，B2，C2的P值均小于0.01，因素C、交互項(xiàng)AB的P值均小于0.05，表明對(duì)醇提工藝的綜合評(píng)分（R綜）影響顯著。詳見(jiàn)表4。

表4 醇提工藝方差分析結(jié)果Tab.4 Results of analysis of variance of alcohol extraction process

2.6.2 等高線圖與響應(yīng)面圖分析

采用Design - Expert v8.0.6 軟件繪制各因素交互作用對(duì)醇提工藝綜合評(píng)分（R綜）影響的等高線圖和響應(yīng)面圖（圖1）。由圖1 A 可知，液料比（A）與提取時(shí)間（B）作用的等高線呈明顯的橢圓形，且響應(yīng)面坡度較陡峭，表明2個(gè)因素具有較強(qiáng)交互作用，對(duì)醇提工藝綜合評(píng)分（R綜）影響較顯著；由圖1 B和圖1 C可知，液料比（A）與提取次數(shù)（C）、提取時(shí)間（B）與提取次數(shù)（C）作用的等高線呈近圓形，且響應(yīng)面坡度較平緩，表明各因素交互作用弱，對(duì)醇提工藝綜合評(píng)分（R綜）影響不顯著。可見(jiàn)，對(duì)綜合評(píng)分（R綜）影響的順序從小至大依次為提取次數(shù)（C）<提取時(shí)間（B）<液料比（A）。

A.液料比- 提取時(shí)間 B.液料比- 提取次數(shù) C.提取時(shí)間- 提取次數(shù)圖1 各因素交互作用對(duì)醇提工藝綜合評(píng)分影響的等高線圖與響應(yīng)面圖A.Liquid - solid ratio - extraction time B.Liquid - solid ratio - extraction times C.Extraction time - extraction timesFig.1 Contour and response surface plots of the effects of interaction of various factors on the comprehensive score of alcohol extraction process

2.6.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)模型分析得到優(yōu)化的醇提工藝為液料比8.55∶1（V/m），提取1.23 h，提取3.26 次，結(jié)果總黃酮醇苷轉(zhuǎn)移率為95.91%，萜類內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率為92.45%，干物質(zhì)得率為32.54%，綜合評(píng)分為98.74。綜合成本及實(shí)際情況，將醇提工藝優(yōu)化為液料比8∶1（V/m），提取3次，每次1.0 h。按優(yōu)化工藝，完成3批驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果綜合評(píng)分為97.81，RSD為0.67%（n= 3），與預(yù)測(cè)值98.74 基本一致。

2.7 水沉工藝單因素試驗(yàn)

濃縮倍數(shù)：按2.1 項(xiàng)下處理方法，提取液濃縮1 倍、2 倍、3 倍、4 倍，加水倍數(shù)3 倍，冷沉?xí)r間24.0 h 進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。綜合考慮，選擇濃縮倍數(shù)為2 倍、3 倍、4倍進(jìn)行BBD響應(yīng)面法優(yōu)化水沉工藝。

表5 濃縮倍數(shù)、加水倍數(shù)、冷沉?xí)r間對(duì)水沉工藝的影響（%）Tab.5 Effects of concentration times，water addition times，and cryoprecipitation time on water precipitation process（%）

加水倍數(shù)：按2.1 項(xiàng)下處理方法，提取液濃縮倍數(shù)3 倍，冷沉?xí)r間24.0 h，分別加水1 倍、2 倍、3 倍、4 倍進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。綜合考慮，選擇加水倍數(shù)為2 倍、3倍、4倍進(jìn)行BBD響應(yīng)面法優(yōu)化水沉工藝。

冷沉?xí)r間：按2.1 項(xiàng)下處理方法，提取液濃縮倍數(shù)3 倍，加水倍數(shù)3 倍，分別冷沉12.0，24.0，36.0，48.0 h進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。綜合考慮，選擇冷沉?xí)r間為12.0，24.0，36.0 h進(jìn)行BBD響應(yīng)面法優(yōu)化水沉工藝。

2.8 BBD 響應(yīng)面法優(yōu)化水沉工藝

2.8.1 方案設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)BBD 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)原理［17］，以銀杏葉總黃酮醇苷轉(zhuǎn)移率（Y1）、萜類內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率（Y2）及干物質(zhì)得率（Y3）的綜合評(píng)分（Y綜）為響應(yīng)值，以提取液濃縮倍數(shù)（D）、加水倍數(shù)（E）及冷沉?xí)r間（F）為考察因素，權(quán)重系數(shù)分別設(shè)定為40%，40%，20%，優(yōu)化銀杏葉提取物水沉工藝。按公式（9）計(jì)算綜合評(píng)分（Y綜），因素與水平見(jiàn)表6，方案設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 水沉工藝因素與水平Tab.6 Factors and levels of water precipitation process

表7 水沉工藝方案設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Design scheme and results of water precipitation process

采用Design - Expert v8.0.6 軟件對(duì)表7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立二次回歸模型方程Y綜= -96.80+80.79D+ 36.87E+ 0.78F- 0.39DE+ 0.11DF-0.05EF-13.13D2-5.48E2-0.02F2，R2= 0.992 4。結(jié)果模型P<0.000 1，表明水沉工藝模型回歸極顯著；失擬項(xiàng)P=0.492 7>0.05，表明失擬項(xiàng)結(jié)果不顯著。結(jié)果顯示，回歸模型擬合度高，合理可行，可用于對(duì)水沉工藝綜合評(píng)分（Y綜）的預(yù)測(cè)和分析。因素D，E，F(xiàn)，D2，E2，F(xiàn)2的P值均小于0.01，交互項(xiàng)DF的P值小于0.05，表明對(duì)水沉工藝綜合評(píng)分（Y綜）的影響顯著。詳見(jiàn)表8。

2.8.2 等高線圖與響應(yīng)面圖分析

采用Design - Expert v8.0.6 軟件繪制各因素交互作用對(duì)水沉工藝綜合評(píng)分（Y綜）影響的等高線圖和響應(yīng)面圖（圖2）。由圖2 A 可知，濃縮倍數(shù)（D）與冷沉?xí)r間（F）作用的等高線呈明顯橢圓形，且響應(yīng)面坡度較陡峭，呈馬鞍形，表明具有較強(qiáng)交互作用，對(duì)水沉工藝綜合評(píng)分（Y綜）的影響較顯著；由圖2 B 和圖2 C 可知，濃縮倍數(shù)（D）與冷沉?xí)r間（F）、加水倍數(shù)（E）與冷沉?xí)r間（F）作用的等高線呈近圓形，且響應(yīng)面坡度較平緩，表明各因素交互作用弱，對(duì)水沉工藝綜合評(píng)分（Y綜）的影響不顯著。可見(jiàn)，對(duì)水沉工藝綜合評(píng)分（Y綜）的影響從小至大依次為冷沉?xí)r間（F）<加水倍數(shù)（E）<濃縮倍數(shù)（D）。

A.濃縮倍數(shù)- 加水倍數(shù) B.濃縮倍數(shù)- 冷沉?xí)r間 C.加水倍數(shù)- 冷沉?xí)r間圖2 各因素交互作用對(duì)水沉工藝綜合評(píng)分影響的等高線圖與響應(yīng)面圖A.Concentration times - water addition times B.Concentration times - cryoprecipitation time C.Water addition times - cryoprecipitation timeFig.2 Contour and response surface plots of the effects of interaction of various factors on the comprehensive score of water precipitation process

2.8.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)模型分析得到優(yōu)化的水沉工藝為濃縮倍數(shù)3.15倍，加水倍數(shù)3.14倍，冷沉?xí)r間27.73 h，結(jié)果總黃酮醇苷轉(zhuǎn)移率為92.96%，萜類內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率為90.87%，干物質(zhì)得率為87.21%，綜合評(píng)分為99.15。綜合成本及實(shí)際情況，將水沉工藝優(yōu)化為濃縮倍數(shù)為3 倍，加水倍數(shù)為3 倍，冷沉?xí)r間為28.0 h。按優(yōu)化工藝，完成3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，綜合評(píng)分為98.94，RSD為0.82%（n=3），與預(yù)測(cè)值99.15基本一致。

3 討論

3.1 BBD 響應(yīng)面法指標(biāo)選擇

目前，關(guān)于銀杏葉提取物的提取工藝研究多以總黃酮醇苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化得到最佳工藝，但不夠全面。本研究中以總黃酮醇苷轉(zhuǎn)移率、萜類內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率及干物質(zhì)得率為綜合考察指標(biāo)，通過(guò)BBD 響應(yīng)面法綜合考察銀杏葉提取物的最佳提取工藝，確定整個(gè)區(qū)域中因素的最佳組合和響應(yīng)的最優(yōu)值。

3.2 提取方法選擇

有關(guān)銀杏葉提取物提取方法的報(bào)道較多，如使用硫酸銨、鹽酸、丙酮等試劑的提取方法［12，18］，但不符合2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》的要求，也不適合工業(yè)化大生產(chǎn)。按《中國(guó)藥典》的規(guī)定，采用稀乙醇回流提取，更適合工業(yè)化大生產(chǎn)，影響因素為液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)，通過(guò)BBD響應(yīng)面法優(yōu)化得到液料比8∶1（V/m），提取時(shí)間1.0 h，提取次數(shù)3 次，優(yōu)化的工藝將進(jìn)一步通過(guò)中試放大試驗(yàn)加以驗(yàn)證，可用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

3.3 水沉方法選擇

后續(xù)研究中將采用大孔樹(shù)脂柱層析純化銀杏葉提取物［18-19］，但實(shí)際生產(chǎn)中大孔樹(shù)脂易被污染、板結(jié)，導(dǎo)致樹(shù)脂柱堵塞等問(wèn)題，主要原因?yàn)樯蠘右何刺幚砀蓛簦^多雜質(zhì)吸附在大孔樹(shù)脂上。本研究中采用加水冷沉的方法盡可能地去除銀杏葉提取液中的雜質(zhì)，提高大孔樹(shù)脂的使用次數(shù)，為后續(xù)的工業(yè)化大生產(chǎn)節(jié)約成本。通過(guò)BBD 響應(yīng)面法對(duì)銀杏葉提取物水沉工藝中提取液濃縮倍數(shù)、加水倍數(shù)、冷沉?xí)r間進(jìn)行了優(yōu)化，得到濃縮倍數(shù)為3 倍，加水倍數(shù)為3 倍，冷沉?xí)r間為28.0 h，可提高有效物質(zhì)轉(zhuǎn)移，為后續(xù)大孔樹(shù)脂純化銀杏葉提取物提供了數(shù)據(jù)支持。