杏蘇止咳顆粒質量標準研究*

姚 蓉，于 勇，劉代群，陳謝華，羅疆南

（1.湖南食品藥品職業(yè)學院，湖南長沙 410208； 2.湖南省藥品檢驗檢測研究院，湖南長沙 410001）

杏蘇止咳顆粒為國家醫(yī)保乙類中成藥，由苦杏仁、陳皮、紫蘇葉、前胡、桔梗、甘草6味藥對組方，具有宣肺散寒、止咳祛痰功效，常用于治療風寒感冒咳嗽和氣逆［1］。方中，苦杏仁和紫蘇葉共為君藥，前胡和桔梗共為臣藥，陳皮為佐藥，甘草為使藥。杏蘇止咳顆粒現行質量標準收載于2020 年版《中國藥典（一部）》，目前僅采用薄層色譜（TLC）法對紫蘇葉、甘草進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定橙皮苷含量，而未對方中君藥苦杏仁、臣藥前胡和桔梗進行質量控制。苦杏仁含脂肪油較高，易泛油［2-4］，常見其含量不合格；桔梗常見摻白礬增重、水分超標、浸出物不合格等問題；前胡用藥情況復雜，常以紫花前胡等其他前胡類混淆［5-7］。因此，為確保該制劑安全、有效，對制劑中苦杏仁、前胡和桔梗進行質量控制十分必要。本研究中建立了對前胡、陳皮、桔梗進行定性鑒別的TLC 法，以及測定白花前胡甲素含量的HPLC法?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695e 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；AUW220D 型電子分析天平（日本Shimadzu 公司，精度為0.01 mg）；KQ-500DE型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；薄層自動成像系統(tǒng)（瑞士Camag公司）。

1.2 試藥

杏蘇止咳顆粒（集安市某藥廠，批號為220125；廣東省某藥廠，批號分別為220308，211205；沈陽市某藥廠，批號為20220101；通化市某藥廠，批號為20220302）；白花前胡甲素對照品（批號為111711-201703，含量為100%），橙皮苷對照品（批號為110721 - 202220，含量為100%），前胡對照藥材（批號為120951-201706），陳皮對照藥材（批號為120969 - 202011），桔梗對照藥材（批號為121028 - 202113），均購自中國食品藥品檢定研究院；預制硅膠G 板（200 mm × 200 mm，德國Merck公司）；甲醇（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司）；乙醇等其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

前胡［1，8-9］：取樣品15 g，研細，加甲醇50 mL，超聲45 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL 使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2 次，每次30 mL，水液備用，合并乙酸乙酯提取液，濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取前胡對照藥材1 g，加甲醇15 mL，超聲處理45 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為對照藥材溶液。按杏蘇止咳顆粒的制備工藝制備不含前胡的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗［10］，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

1.陰性對照品溶液 2 - 6.供試品溶液 7.對照藥材溶液 8.對照品溶液A.前胡 B.陳皮 C.桔梗圖1 薄層色譜圖（365 nm）1.Negative reference solution 2 - 6.Test solution 7.Reference medicinal material solution 8.Reference solutionA.Peucedani Radix B.Pericarpium Citri Reticulatae C.Platycodonis RadixFig.1 TLC chromatograms（365 nm）

陳皮［11-13］：取前胡鑒別項下供試品溶液制備中備用的水液，置分液漏斗中，加水飽和的正丁醇，振搖，提取2 次，每次30 mL，合并上層液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取適量橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。取陳皮對照藥材1 g，加甲醇15 mL，超聲45 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為對照藥材溶液。按杏蘇止咳顆粒的制備工藝制備不含陳皮的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述4 種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁試液，加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液和對照藥材溶液色譜相應位置均顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

桔梗［14］：取桔梗對照藥材0.5 g，加甲醇15 mL，超聲45 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為對照藥材溶液。按杏蘇止咳顆粒制備工藝制備不含桔梗的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取陳皮TLC 鑒別項下的供試品溶液及上述2 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯- 甲醇- 水（1∶4∶3∶1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇試液，加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

2.2 HPLC 法測定白花前胡甲素含量

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido Capcell C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（65∶35，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：321 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取白花前胡甲素對照品10.28 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得質量濃度為0.205 6 mg/mL的對照品貯備液。精密吸取對照品貯備液10 mL，置100 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得質量濃度為0.020 56 mg/mL的對照品溶液。取樣品3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 甲醇，密塞，稱定質量，超聲45 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取前胡TLC 鑒別項下不含前胡的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取2.2.2 項下3 種溶液各10 μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定。結果供試品溶液色譜圖中，白花前胡甲素與其他成分分離較好，分離度為6.9，理論板數為11 784，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

線性關系考察：精密吸取2.2.2項下白花前胡甲素對照品貯備液0.5，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 mL，分別置50 mL 容量瓶中，加甲醇定容，制成不同質量濃度的系列對照品溶液，精密吸取10 μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以對照品溶液質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=3 546.5X-3 000.9（r=0.999 9，n=6）。結果表明，白花前胡甲素質量濃度在2.056～51.4 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限確定：取2.2.2項下白花前胡甲素對照品溶液適量，倍比稀釋，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S/N）為3∶1時的質量濃度為檢測限。結果白花前胡甲素的檢測限為1.028 μg/mL。

精密度試驗：取2.2.2 項下對照品溶液適量，按2.2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果白花前胡甲素峰面積的RSD為0.78%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為211205）6 份，精密稱定，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，計算白花前胡甲素的含量。結果白花前胡甲素平均含量為0.121 6 mg/ g，RSD為2.12%（n=6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取重復性試驗項下供試品溶液適量，分別于0，2，4，8，10，12 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果峰面積的RSD為1.37%（n=6），表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為211205）6 份，每份1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入白花前胡甲素貯備液1 mL，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n = 6）

2.2.4 樣品含量測定

取5 批樣品，分別按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，平行測定3 次，記錄峰面積，并計算含量。結果見表2。

表2 樣品中白花前胡甲素含量測定結果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of the content determination of praeruptorin A in samples（mg / g，n = 3）

3 討論

3.1 TLC 鑒別

TLC鑒別前胡時，比較了乙酸乙酯和水飽和正丁醇2 種溶劑的萃取效果，發(fā)現乙酸乙酯萃取的供試品溶液主斑點顏色較水飽和正丁醇萃取的斑點明顯，且無背景干擾，故選擇乙酸乙酯為萃取溶劑。TLC鑒別陳皮時，展開系統(tǒng)比較了甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1，V/V/V/V）的上層溶液和乙酸乙酯- 甲醇- 水（100∶17∶13，V/V/V），兩者分離效果接近，考慮到甲苯的毒性較大，故選擇乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13，V/V/V）為展開劑。TLC 鑒別桔梗時，展開系統(tǒng)比較了甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（1∶4∶3∶1，V/V/V/V），三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0.5，V/V/V），三氯甲烷-乙醚（2∶1，V/V），結果斑點分離效果較差，經多次試驗發(fā)現，環(huán)己烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 水（1∶4∶3∶1，V/V/V/V）為展開劑時的分離效果較好，確定為展開劑。比較了在日光和紫外光（365 nm）下的斑點顯色情況，結果熒光斑點更清晰。另外，對該制劑中的苦杏仁進行了TLC 鑒別，發(fā)現斑點不明顯，故未納入本研究。

3.2 含量測定研究

指標性成分選擇：前期試驗中，采用HPLC 法同時測定該制劑中苦杏仁苷、白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量，結果苦杏仁苷和白花前胡乙素含量均極低，且苦杏仁苷有干擾，故本研究中只測定了白花前胡甲素的含量。前胡為該制劑的臣藥，前胡屬植物種類較多，外觀形態(tài)相似，極易混淆。前期試驗中，對市售的14 批前胡藥材進行了含量測定，結果不同批次前胡飲片含量差異較大，合格率較低，前胡藥材中白花前胡甲素的含量在0～1.61%之間［15］。本研究中測定了4 個廠家生產的5 批杏蘇止咳顆粒中白花前胡甲素的含量，結果差異較大，可能與生產時使用的前胡藥材的質量關系較大。因此，有必要測定該制劑中白花前胡甲素的含量，以控制杏蘇止咳顆粒中前胡的投料。

溶液制備方法選擇：考察了不同提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、甲醇、70%乙醇、乙醇）的提取效果，結果甲醇的提取效果最好，故選擇提取溶劑為甲醇?？疾炝顺暫突亓? 種提取方法，結果提取效率相當，因超聲操作更簡便，故選擇超聲提取?？疾炝顺?0，45，60 min時的提取效果，結果超聲45 min 時基本提取完全，故選擇超聲提取45 min。

色譜條件選擇：參考文獻［16 - 18］，經多次試驗，最終采用甲醇-水（65∶35，V/V）為流動相，白花前胡甲素的出峰時間適當，分離度也達到要求。

3.3 方法評價

本研究中建立的方法操作簡單、重復性好、結果準確，可用于杏蘇止咳顆粒的質量控制。