根皮素對肺癌細胞增殖與凋亡的影響

宮慧，張藝藍，劉政，王會

錦州醫科大學食品與健康學院（錦州 121001）

肺癌是一種嚴重危害人群身體健康的且有很高死亡率的疾病，目前居我國癌癥死亡的第一位[1]。從天然植物中尋找高效、低毒、安全的抗肺癌藥物是目前抗癌研究的熱點。根皮素（Phloretin）在自然界中廣泛存在于草莓、梨、蘋果等水果的根皮與果皮中，是一種帶有二氫查耳酮結構的黃酮類化合物，化學結構中存在多個羥基，其結構式如圖1所示。根皮素具有多種生物學活性，能夠抑制皮膚中黑色素生成和聚合，具有增白效果[2-3]，能夠清除生物體內自由基，具有抗氧化功能[4]，能夠調節血管的張力，具有保護血管作用[5]。根皮素具有對前列腺癌、乳腺癌、消化道腫瘤等多種腫瘤的抑制作用[6-8]，目前有關根皮素對肺癌細胞增殖及凋亡的研究較為少見。此試驗研究了根皮素對肺癌細胞A549的增殖及凋亡的影響，為進一步研究根皮素誘導肺癌細胞凋亡的分子機制提供試驗依據。

圖1 根皮素的結構式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肺癌A539細胞（中國農業科學院北京畜牧獸醫所遺傳資源實驗室）；根皮素（純度≥99.99%）、喜樹堿（純度≥98.0%）：Sigma公司；胎牛血清、DMEM高糖培養基（美國GIBCO有限公司）；碘化丙啶（propidium iodide，PI，美國Sigma公司）；Fluo-3/AM（美國Invitrogen公司）；JC-1探針、Annexin V-TIC Apoptosis Density試劑盒（美國BD有限公司）。

Multiskan FC酶標儀（美國Thermo fisher公司）；BB15 CO2培養箱（德國Heraeus公司）；FC-500流式細胞儀（美國Beckman公司）；IX-71倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養

A549細胞培養于DMEM高糖培養基（含10%胎牛血清）中，培養環境為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。使用0.25%的胰酶對匯合度為70%～80%細胞進行消化后按1∶2或1∶3的比例傳代培養。

1.2.2 藥物配制

使用二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解喜樹堿和根皮素配制成儲備原液，于-20 ℃保存。進行試驗時，儲備原液分別溶解于DMEM培養基中（DMSO終濃度小于0.05%），使得培養基中根皮素質量濃度分別為10，20，40和80 μg/mL，喜樹堿質量濃度分別為6，12和24 μg/mL。

1.2.3 細胞毒性分析

將常規消化細胞制成單細胞懸液，細胞（濃度為3×104個/mL）接種于96孔培養板，每孔180 μL。在細胞內進入對數生長期之后，分別換用含有10，20，40和80 μg/mL根皮素的培養基培養，并設有空白對照組（含終濃度為 0.05% DMSO的培養基處理）和陽性對照組（分別用6，12和24 μg/mL喜樹堿處理），每組設5個復孔。培養時間分別為12，24，36和48 h，每孔添加20 μL 5 mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT），繼續培養4 h，吸出孔中的液體。將200 μL DMSO注入96孔板的每個孔中，采用酶標儀測定吸光度，波長設置為490 nm。

1.2.4 細胞形態學觀察

在六孔板中接種細胞懸液，密度為3.0×105個/孔，待細胞貼壁進入對數生長期，每孔分別用含10，20，40和80 μg/mL根皮素的培養基處理細胞24 h，同時設置空白對照組（用含濃度為0.5% DMSO的培養基處理）和陽性對照組（24 μg/mL喜樹堿處理細胞）。倒置相差顯微鏡觀察。

1.2.5 Annexin V-FITC及PI 染色測定凋亡率

采用常規方法收集處理組（根皮素處理質量濃度10，20，40和80 μg/mL）、陽性對照組（喜樹堿處理質量濃度27.84 μg/mL）及空白對照組（用含濃度0.5%DMSO的培養基處理）分別處理12，24，36和48 h的細胞，稀釋細胞使其濃度為5.0×105細胞/樣品，每個樣品加入100 μL緩沖液重懸，同時加入5 μL AnnexinVFITC及5 μL PI，混勻。避光孵育15 min，應用流式細胞儀定量檢測。

1.2.6 細胞周期檢測

采用常規方法收集處理組（根皮素處理質量濃度10，20，40和80 μg/mL）及空白對照組（用含濃度0.5% DMSO的培養基處理）處理24 h的細胞，稀釋細胞使其濃度為5.0×105細胞/樣品，在4 ℃條件下用70%無水乙醇處理細胞12 h。經PBS漂洗，加入0.5 mL PI染液處理8 min，應用流式細胞儀檢測。

1.2.7 線粒體膜電位檢測

采用常規方法收集處理組（根皮素處理質量濃度10，20，40和80 μg/mL）及空白對照組（用含濃度0.5% DMSO的培養基處理）處理24 h的細胞，稀釋細胞使其濃度為5.0×105細胞/樣品，加入0.5 mL JC-1染液，于37 ℃孵育10 min，經PBS洗滌、懸浮，應用流式細胞儀檢測。

1.2.8 細胞內鈣離子濃度的測定

采用常規方法收集處理組（根皮素處理質量濃度10，20，40和80 μg/mL及空白對照組（用含濃度0.5%DMSO的培養基處理）處理24 h的細胞，稀釋細胞使其濃度為5.0×105細胞/樣品。加入Fluo-3/Am（終濃度為7 μmol/L），于37 ℃孵育25 min，設置陰性對照（無Fluo-3/Am處理）。經PBS漂洗、重懸，應用流式細胞儀檢測。

1.2.9 數據處理

應用SPSS 17.0統計軟件對數據進行統計分析，正態計量數據用“X±S”表示，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 細胞毒性分析

MTT法是細胞毒性分析的經典方法，可以準確檢測細胞存活和增殖情況。A490值反映活細胞數量，A490值小指示活細胞少。根皮素對A549細胞生長的影響如表1所示。根皮素處理細胞12 h，處理組與空白對照組比較，80 μg/mL處理組A490值減小，差異顯著（P＜0.05）。40 μg/mL處理組A490值大于20 μg/mL處理組，組間比較差異不顯著，20 μg/mL處理組A490值大于10 μg/mL處理組，組間比較差異不顯著，推測出現這種現象的原因可能是12 h處理時間內兩個濃度的根皮素未對細胞產生差異的毒性影響。根皮素處理細胞24 h，40和80 μg/mL處理組與空白對照組比較，A490值減小，差異顯著（P＜0.05）。根皮素處理細胞36、48 h，20，40，80 μg/mL處理組分別與空白對照組相比，A490值均減小，差異極顯著（P＜0.01）。在相同處理時間，隨著處理組濃度增大其A490值逐漸減小，指示活細胞數下降，呈現濃度相關性。喜樹堿處理的陽性對照組細胞A490值也呈現量效關系。根皮素處理組與陽性對照組比較，具有較強的細胞毒性，為凋亡作用研究奠定基礎。

表1 根皮素對A549細胞生長的影響（，n=3）

表1 根皮素對A549細胞生長的影響（，n=3）

2.2 細胞形態學觀察

對照組細胞貼壁生長，胞體飽滿、排列緊密，立體感、折光度好，邊緣清晰。80 μg/mL根皮素處理組胞體皺縮，出現空泡，胞間連接消失，出現細胞碎片，部分細胞表現出凋亡晚期甚至壞死特征。陽性對照喜樹堿24 μg/mL處理組細胞凋亡情況與根皮素80 μg/mL處理組相近（圖2）。

圖2 根皮素處理細胞A549 48 h細胞形態（40×）

2.3 細胞凋亡率的測定

應用流式細胞術結合Annexin V-FITC/PI雙標記法定量分析細胞凋亡。

細胞經處理12 h，40和80 μg/mL根皮素處理組與空白對照組相比，凋亡率增高，差異極顯著（P＜0.01）。細胞處理24和36 h時，20 μg/mL根皮素處理組與空白對照組比較，凋亡率上升，差異顯著（P＜0.05）。40和80 μg/mL根皮素處理組與空白對照組相比，凋亡率上升，差異極顯著（P＜0.01）。細胞處理48 h時，20，40和80 μg/mL根皮素處理組與空白對照組相比，凋亡率上升，差異極顯著（P＜0.01）。根皮素濃度和凋亡率之間呈濃度依賴性。各處理時長的80 μg/mL根皮素處理組凋亡率小于陽性對照喜樹堿24 μg/mL處理組（表2），根皮素表現出良好的誘導A549細胞凋亡的作用。

表2 根皮素處理A549細胞凋亡率（，n=3）單位：%

表2 根皮素處理A549細胞凋亡率（，n=3）單位：%

2.4 細胞周期檢測

細胞周期是細胞生命活動的重要事件之一，其時相紊亂會影響細胞增殖進程從而擾亂生命活動，藥物對細胞周期的影響具有時相特異性。此研究通過PI標記結合流式細胞法測定細胞周期的變動，結果顯示，根皮素作用細胞24 h，20 μg/mL根皮素處理組和空白對照組相比，在G1期細胞中的數目增加，差異顯著（P＜0.05）。處于S期細胞的數目減少，差異顯著（P＜0.05）。40和80 μg/mL根皮素處理組和空白對照組相比，在G1期細胞的數目增加，差異極顯著（P＜0.01）。處于S期細胞的數目減少，差異極顯著（P＜0.01）。80 μg/mL根皮素處理組與空白對照組相比，在G2期細胞的數目減少，差異極顯著（P＜0.01）。細胞在經根皮素處理后周期停滯于G1期，從而阻滯了DNA合成，并呈現出劑量依賴性（表3）。

表3 根皮素處理A549細胞24 h，細胞周期的變化（，n=3）單位：%

表3 根皮素處理A549細胞24 h，細胞周期的變化（，n=3）單位：%

2.5 線粒體膜電位檢測

線粒體對細胞凋亡起著重要的作用，線粒體膜電位的降低是細胞凋亡過程的早期事件。細胞經根皮素處理24 h，20，40和80 μg/mL根皮素處理組與空白對照相比，線粒體膜電位降低差異極顯著（P＜0.01）（表4）。根皮素處理濃度與線粒體膜電位呈現量效關系。

表4 根皮素處理A549細胞24 h，線粒體膜電位變化（，n=3）

表4 根皮素處理A549細胞24 h，線粒體膜電位變化（，n=3）

2.6 細胞內游離鈣離子測定

鈣離子作為第二信使影響細胞的增殖、死亡等一系列生命現象，細胞內游離鈣離子被認為可以啟動細胞凋亡。細胞經根皮素作用24 h，10 μg/mL根皮素處理組與空白對照比較，胞內游離鈣離子濃度升高差異顯著（P＜0.05）。20，40和80 μg/mL根皮素處理組與空白對照比較，胞內游離鈣離子濃度升高，差異極顯著（P＜0.01）（表5）。根皮素處理濃度與胞內游離鈣離子濃度呈現量效關系。

表5 根皮素處理A549細胞24 h，胞內Ca2+濃度的變化（，n=3）

3 討論與結論

多基因調控失調使得細胞增殖失控和凋亡受阻是腫瘤的發生和發展的本質。細胞凋亡是生物體在生理或病理情況下，為了維持內環境穩態，由基因控制的自發性的有序的細胞死亡。對凋亡機制研究發現，引起癌癥細胞凋亡是防治癌癥的有效手段之一。根皮素是一類有抑制癌細胞增殖潛力的類黃酮物質，可誘發癌細胞凋亡[9]。

先前研究表明根皮素可以抑制肝癌細胞增殖，且抑制作用呈現劑量依賴性[10-11]，此研究表明與先前研究相似，根皮素抑制肺癌細胞A549生長，并呈現濃度依賴性，凋亡率測定結果與細胞形態學分析及細胞毒性研究結果一致。

研究表明細胞無限增殖、惡性轉化是導致腫瘤發生的原因之一[12]，因此，利用藥物影響細胞周期進程抑制細胞增殖、促使細胞凋亡是抗癌癥作用的突破口之一。研究結果表明：根皮素使得A549細胞周期進程發生改變，細胞停滯在G1期，導致細胞無法進入S期與G2期，細胞分裂受阻，發生凋亡作用。先前研究表明，根皮素可以干預白血病K562細胞周期，抑制細胞增殖，從而引起白血病細胞的凋亡[13]。

線粒體是能夠進行氧化磷酸化的半自主性細胞器，是細胞的能量工廠，線粒體功能對細胞乃至整個機體具有重要意義。線粒體和細胞凋亡之間存在著密切的關聯，其功能失調可引發細胞凋亡，如膜電位的降低就導致了膜通透性轉運孔打開，這也是細胞凋亡級聯反應中較早出現的生物化學反應，此后，線粒體中的細胞色素C，凋亡誘導因子如AIF等進入胞質，便開啟了凋亡過程[14]。根皮素是一類解偶聯劑，能夠控制線粒體的氧化磷酸化過程，ATP合成被干擾，無法產生能量，從而導致細胞壞死[15]。文章中線粒體膜電位檢測結果表明，根皮素作用A549細胞使得線粒體膜電位下降，且根皮素處理濃度與線粒體膜電位下降呈現量效關系。

在生理狀態下胞內大部分Ca2+與蛋白質結合形成結合鈣，存在線粒體與內質網中，只有很少一部分游離Ca2+。當細胞受到外界刺激時結合鈣轉變為游離Ca2+作為第二信使，在機體生命活動的細胞的反應、基因的表達等多方面發揮重要作用，游離Ca2+的大量聚集是導致細胞凋亡發生的原因之一[16]。

此研究結果顯示，當根皮素處理A549細胞時，胞內游離Ca2+濃度增多，鈣穩態被打破，根皮素誘導A549細胞發生了凋亡作用。同時檢測到線粒體膜電位下降，推斷胞質內游離Ca2+來源之一為內質網內結合鈣，但其具體機制有待進一步的研究。

綜上所述，根皮素可抑制肺癌A549細胞增殖、促進其凋亡，其機制可能為打破正常的細胞周期進程與鈣離子穩態從而誘導細胞凋亡的。