基于化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)不同產(chǎn)地甘草的質(zhì)量評(píng)價(jià)

胡力飛，梅菊，吳濤，石榴花，殷濤，孫代華

1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院（武漢 430068）；2.勁牌持正堂藥業(yè)有限公司（黃石 435100）；3.勁牌有限公司（黃石 435100）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草Glycyrrhizɑ inflɑtɑBat.或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根和根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥的功效。甘草在我國(guó)藥用歷史悠久，有“十方九草”之說(shuō)，為常用的藥食同源中藥品種之一[1-4]。甘草含有三萜皂苷類、黃酮類、多糖等多種活性成分，具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌等多種功能[5-10]；甘草苷、甘草酸為《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）中的指標(biāo)成分[1]，其中甘草酸及其鹽類也是重要的藥品和天然甜味劑原料[11-12]。甘草因其功能特性，在國(guó)內(nèi)外被廣泛用于食品、藥品、化妝品、煙草等行業(yè)[13]。

甘草在我國(guó)主要分布于甘肅、內(nèi)蒙古、新疆等地，此試驗(yàn)根據(jù)《中國(guó)藥典》甘草項(xiàng)下要求，對(duì)甘肅（蘭州、白銀、武威、金昌、酒泉）、內(nèi)蒙古（鄂爾多斯）、新疆（阿克蘇、和田、巴音郭楞）共計(jì)29批次甘草進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，并進(jìn)行聚類分析、主成分分析及正交偏最小二乘分析，對(duì)不同產(chǎn)地甘草的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比分析，以期為甘草相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)過(guò)程中原料產(chǎn)地的選擇提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

UltiMate 3000高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；Sepax Amethyst C18-H液相色譜柱（美國(guó)賽分有限公司）；Agilent 7890B氣相色譜儀（美國(guó)安捷倫有限公司）；ICAP RQ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；XS-105DU電子分析天平（梅特勒托利多科技有限公司）；PHOENIX馬弗爐（美國(guó)CEM公司）；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；DFY-500C搖擺式高速粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；藥典三號(hào)篩（浙江上虞五四紗篩廠）。

甘草苷（批號(hào)111610-202209，95.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甘草酸銨（批號(hào)110731-202122，94.4%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；鉛鎘砷汞銅混合對(duì)照溶液（610014-201701，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；五氯硝基苯（批號(hào)：GSB05-1845-2016-2，1 000 μg/mL農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所）；乙腈（色譜級(jí)，美國(guó)Fisher chemical公司）；磷酸（色譜級(jí)，批號(hào)C12326362，上海麥克林生化科技股份有限公司）；其余試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。29批不同產(chǎn)地甘草藥材，由勁牌持正堂藥業(yè)有限公司采集，經(jīng)鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根，藥材產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。

表1 甘草樣品產(chǎn)地信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水分測(cè)定

取約2 g通過(guò)2號(hào)篩的甘草粉末，根據(jù)《中國(guó)藥典》通則水分測(cè)定法第二法測(cè)定，并計(jì)算供試品中的含水量（%）。

1.2.2 甘草苷、甘草酸含量測(cè)定

采用2020版《中國(guó)藥典》甘草含量測(cè)定項(xiàng)下要求進(jìn)行含量測(cè)定，所用色譜柱為Sepax Amethyst C18-H（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，圖1為對(duì)照品及甘草藥材HPLC色譜圖。

圖1 甘草苷、甘草酸銨對(duì)照品及甘草HPLC色譜圖

所有供試品甘草苷、甘草酸含量均以干燥品計(jì)。供試品含量=含量測(cè)定值×100/（100-水分測(cè)定值）。

1.2.3 總灰分、酸不溶性灰分、重金屬及有害元素、其他有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量、二氧化硫殘留量測(cè)定

總灰分、酸不溶性灰分、重金屬及有害元素、其他有機(jī)氯類農(nóng)藥（五氯硝基苯）殘留量、二氧化硫殘留量根據(jù)《中國(guó)藥典》通則灰分測(cè)定法、酸不溶性灰分測(cè)定法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量測(cè)定法、二氧化硫殘留量測(cè)定法（酸堿滴定法）測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 含量測(cè)定方法學(xué)確認(rèn)

根據(jù)1.2.2小節(jié)條件開(kāi)展甘草藥材含量檢測(cè)方法學(xué)確認(rèn)，結(jié)果表明，甘草苷、甘草酸的中間精密度SRSD分別為1.5%和1.8%，重復(fù)性SRSD分別為2.4%和1.1%，表明儀器的精密度及方法的重復(fù)性較好，檢測(cè)方法適宜性較好。

2.2 甘草樣品測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)按照《中國(guó)藥典》甘草項(xiàng)下要求對(duì)甘草苷、甘草酸、水分、總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷、汞、銅、五氯硝基苯、二氧化硫殘留量進(jìn)行了測(cè)定，29批甘草各指標(biāo)均符合《中國(guó)藥典》要求，其中五氯硝基苯、二氧化硫殘留量在各批次藥材中均未檢出，其他各項(xiàng)測(cè)定數(shù)據(jù)如表2所示。水分主要與藥材的干燥程度相關(guān)，此試驗(yàn)選取甘草苷、甘草酸、總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷、汞、銅共計(jì)9個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析，不同產(chǎn)地樣品測(cè)定值箱狀圖如圖2所示，各產(chǎn)地樣本測(cè)定值之間存一定的差異，可采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法開(kāi)展分析與評(píng)價(jià)。

圖2 不同產(chǎn)地甘草樣品檢測(cè)情況箱狀圖

表2 29批甘草樣品檢測(cè)結(jié)果

2.3 聚類分析（CA）

以甘草苷、甘草酸、總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷、汞、銅測(cè)定結(jié)果作為變量，采用Origin-Pro 2023軟件對(duì)以ward聚類方法結(jié)合Euclidean平方距離計(jì)算對(duì)29批甘草樣品進(jìn)行聚類分析，以ward聚類方法結(jié)合Pearson相關(guān)性對(duì)9個(gè)指標(biāo)變量進(jìn)行聚類分析，聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，當(dāng)判定距離為70時(shí)，甘草樣本可被分為2類，其中甘肅蘭州樣品與新疆樣本被聚為一類，甘肅省其他樣本與內(nèi)蒙古鄂爾多斯樣本聚為一類；當(dāng)判定距離為25時(shí)，甘草樣本可被分為6類，甘肅蘭州樣本被聚為一類，新疆樣本被聚為一類，甘肅白銀樣本被聚為一類，甘肅武威、金昌樣本被聚為一類，內(nèi)蒙古鄂爾多斯樣本被聚為一類，甘肅酒泉樣本被聚為一類。9個(gè)變量被聚為3類，甘草苷與甘草酸被聚為一類，汞與銅被聚為一類，總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷被聚為一類。從甘草聚類熱圖中可見(jiàn)，甘草原料的分類與各變量之間有一定相關(guān)性，可能與各種植地區(qū)的土壤、氣候等因素有關(guān)。

圖3 29批甘草樣本聚類分析熱圖

2.4 主成分分析（PCA）

采用Origin Pro 2023軟件對(duì)甘草苷、甘草酸、總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷、汞、銅測(cè)定結(jié)果進(jìn)行主成分分析，計(jì)算相關(guān)矩陣的特征值、特征向量和分值。確定了特征值＞1的3個(gè)主成分，3個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為66.62%，由相關(guān)矩陣的特征值所作碎石圖見(jiàn)圖4。第一主成分（PC1）解釋了總方差的31.62%，信息主要來(lái)自于灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘和砷且均呈正相關(guān)；第二個(gè)主成分（PC2）解釋了總方差的19.24%，信息主要來(lái)自于甘草苷和銅，并與甘草苷呈正相關(guān)，與銅呈負(fù)相關(guān)；第三個(gè)主成分（PC3）解釋了總方差的15.76%，信息主要來(lái)自于甘草酸和汞，并與甘草酸呈正相關(guān)，與汞呈負(fù)相關(guān)。以PC1，PC2和PC3得分及特征向量繪制29批次甘草樣本的雙標(biāo)圖如圖5所示，其中甘肅蘭州樣本（S1～S4）、甘肅白銀樣本（S5～S10）、新疆樣本（S25～S29）分布相對(duì)獨(dú)立；內(nèi)蒙古鄂爾多斯與甘肅武威、金昌、酒泉樣本較為相似且與甘肅白銀樣本相近，但也能得到有效區(qū)分；而各變量特征向量分布情況各異，與聚類分析中變量聚類情況相近。主成分分析與聚類分析結(jié)果相一致。

圖4 主成分分析碎石圖

圖5 29批甘草樣品主成分分析雙標(biāo)圖

2.5 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）

采用SIMCA14.1軟件對(duì)29批甘草進(jìn)行OPLS-DA分析，相關(guān)分析情況如圖6和圖7所示。結(jié)果表明，通過(guò)OPLS-DA可實(shí)現(xiàn)對(duì)組別1（蘭州）、組別2（白銀）、組別3（武威和金昌）、組別4（酒泉）、組別5（鄂爾多斯）、組別6（新疆）的有效區(qū)分，分析中的自變量擬合指數(shù)（R2X）為0.830，因變量擬合指數(shù)（R2Y）為0.719，模型預(yù)測(cè)指數(shù)（Q2）為0.550，R2和Q2均超過(guò)了0.5，表明該模型擬合結(jié)果可接受，同時(shí)通過(guò)200次置換檢測(cè)，Q2回歸線與縱軸的相交點(diǎn)小于0，說(shuō)明模型不存在過(guò)擬合，所建立的模型有效，認(rèn)為該結(jié)果可用于各產(chǎn)地甘草測(cè)定值的指標(biāo)對(duì)比分析。所生成的變量VIP圖如圖8所示，并以VIP大于1為閾值，篩選出5個(gè)貢獻(xiàn)值較大的成分，依次為砷、銅、總灰分、甘草苷和甘草酸，判斷其為區(qū)分6個(gè)組別樣本的代表性差異性成分。各項(xiàng)指標(biāo)差異可能與甘草的土壤和種植環(huán)境等因素相關(guān)。

圖6 OPLS-DA得分圖

圖7 OPLS-DA模型置換驗(yàn)證圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)甘肅、內(nèi)蒙古、新疆9個(gè)市/州共計(jì)29批甘草樣本進(jìn)行了采集，根據(jù)《中國(guó)藥典》甘草項(xiàng)下要求進(jìn)行了測(cè)定，所有樣本均符合《中國(guó)藥典》要求，因五氯硝基苯、二氧化硫均未檢出，結(jié)合測(cè)定結(jié)果選取甘草苷、甘草酸、總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷、汞、銅9個(gè)指標(biāo)作為變量進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)（CA、PCA及OPLS-DA）分析。聚類分析和主成分分析結(jié)果較為一致，樣本可被分為甘肅蘭州、新疆樣本、甘肅白銀樣本、甘肅武威及金昌樣本、內(nèi)蒙古鄂爾多斯樣本、甘肅酒泉樣本6個(gè)組別，其中甘肅蘭州樣本與新疆樣本較為相近，甘肅武威及金昌樣本、內(nèi)蒙古鄂爾多斯樣本、甘肅酒泉3組樣本較為相似且與甘肅白銀樣本相近；9個(gè)指標(biāo)則可被分為3類，甘草苷與甘草酸分為一類，汞與銅分為一類，總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷分為一類。結(jié)合各批次甘草分類情況進(jìn)行了正交偏最小二乘判別分析，可實(shí)現(xiàn)上述6個(gè)組別樣本的有效區(qū)分，砷、銅、總灰分、甘草苷和甘草酸為區(qū)分6個(gè)組別樣本的代表性差異性成分。試驗(yàn)結(jié)果可能與不同區(qū)域甘草的土壤、種植條件等因素有關(guān)。甘草在我國(guó)種植區(qū)域較廣且為多基原藥材，此試驗(yàn)采集的樣本均為甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.藥材，后期可進(jìn)一步加大樣本采集量，對(duì)3個(gè)不同基原的藥材成分和品質(zhì)進(jìn)一步開(kāi)展研究，以更加全面地了解甘草藥材的品質(zhì)情況。