基于化學計量學對不同產地甘草的質量評價

胡力飛，梅菊，吳濤，石榴花，殷濤，孫代華

1.湖北工業大學生物工程與食品學院（武漢 430068）；2.勁牌持正堂藥業有限公司（黃石 435100）；3.勁牌有限公司（黃石 435100）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草Glycyrrhizɑ inflɑtɑBat.或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根和根莖，始載于《神農本草經》，有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥的功效。甘草在我國藥用歷史悠久，有“十方九草”之說，為常用的藥食同源中藥品種之一[1-4]。甘草含有三萜皂苷類、黃酮類、多糖等多種活性成分，具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌等多種功能[5-10]；甘草苷、甘草酸為《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）中的指標成分[1]，其中甘草酸及其鹽類也是重要的藥品和天然甜味劑原料[11-12]。甘草因其功能特性，在國內外被廣泛用于食品、藥品、化妝品、煙草等行業[13]。

甘草在我國主要分布于甘肅、內蒙古、新疆等地，此試驗根據《中國藥典》甘草項下要求，對甘肅（蘭州、白銀、武威、金昌、酒泉）、內蒙古（鄂爾多斯）、新疆（阿克蘇、和田、巴音郭楞）共計29批次甘草進行質量評價，并進行聚類分析、主成分分析及正交偏最小二乘分析，對不同產地甘草的各項指標進行對比分析，以期為甘草相關產品開發過程中原料產地的選擇提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

UltiMate 3000高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；Sepax Amethyst C18-H液相色譜柱（美國賽分有限公司）；Agilent 7890B氣相色譜儀（美國安捷倫有限公司）；ICAP RQ電感耦合等離子體質譜儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；XS-105DU電子分析天平（梅特勒托利多科技有限公司）；PHOENIX馬弗爐（美國CEM公司）；101-2AB電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；DFY-500C搖擺式高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；藥典三號篩（浙江上虞五四紗篩廠）。

甘草苷（批號111610-202209，95.2%，中國食品藥品檢定研究院）；甘草酸銨（批號110731-202122，94.4%，中國食品藥品檢定研究院）；鉛鎘砷汞銅混合對照溶液（610014-201701，中國食品藥品檢定研究院）；五氯硝基苯（批號：GSB05-1845-2016-2，1 000 μg/mL農業部環境保護科研監測所）；乙腈（色譜級，美國Fisher chemical公司）；磷酸（色譜級，批號C12326362，上海麥克林生化科技股份有限公司）；其余試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。29批不同產地甘草藥材，由勁牌持正堂藥業有限公司采集，經鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根，藥材產地信息見表1。

表1 甘草樣品產地信息

1.2 試驗方法

1.2.1 水分測定

取約2 g通過2號篩的甘草粉末，根據《中國藥典》通則水分測定法第二法測定，并計算供試品中的含水量（%）。

1.2.2 甘草苷、甘草酸含量測定

采用2020版《中國藥典》甘草含量測定項下要求進行含量測定，所用色譜柱為Sepax Amethyst C18-H（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，圖1為對照品及甘草藥材HPLC色譜圖。

圖1 甘草苷、甘草酸銨對照品及甘草HPLC色譜圖

所有供試品甘草苷、甘草酸含量均以干燥品計。供試品含量=含量測定值×100/（100-水分測定值）。

1.2.3 總灰分、酸不溶性灰分、重金屬及有害元素、其他有機氯類農藥殘留量、二氧化硫殘留量測定

總灰分、酸不溶性灰分、重金屬及有害元素、其他有機氯類農藥（五氯硝基苯）殘留量、二氧化硫殘留量根據《中國藥典》通則灰分測定法、酸不溶性灰分測定法、電感耦合等離子體質譜法、有機氯類農藥殘留量測定法、二氧化硫殘留量測定法（酸堿滴定法）測定。

2 結果與分析

2.1 含量測定方法學確認

根據1.2.2小節條件開展甘草藥材含量檢測方法學確認，結果表明，甘草苷、甘草酸的中間精密度SRSD分別為1.5%和1.8%，重復性SRSD分別為2.4%和1.1%，表明儀器的精密度及方法的重復性較好，檢測方法適宜性較好。

2.2 甘草樣品測定結果

試驗按照《中國藥典》甘草項下要求對甘草苷、甘草酸、水分、總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷、汞、銅、五氯硝基苯、二氧化硫殘留量進行了測定，29批甘草各指標均符合《中國藥典》要求，其中五氯硝基苯、二氧化硫殘留量在各批次藥材中均未檢出，其他各項測定數據如表2所示。水分主要與藥材的干燥程度相關，此試驗選取甘草苷、甘草酸、總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷、汞、銅共計9個指標進行分析，不同產地樣品測定值箱狀圖如圖2所示，各產地樣本測定值之間存一定的差異，可采用化學計量學方法開展分析與評價。

圖2 不同產地甘草樣品檢測情況箱狀圖

表2 29批甘草樣品檢測結果

2.3 聚類分析（CA）

以甘草苷、甘草酸、總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷、汞、銅測定結果作為變量，采用Origin-Pro 2023軟件對以ward聚類方法結合Euclidean平方距離計算對29批甘草樣品進行聚類分析，以ward聚類方法結合Pearson相關性對9個指標變量進行聚類分析，聚類分析結果見圖3。結果表明，當判定距離為70時，甘草樣本可被分為2類，其中甘肅蘭州樣品與新疆樣本被聚為一類，甘肅省其他樣本與內蒙古鄂爾多斯樣本聚為一類；當判定距離為25時，甘草樣本可被分為6類，甘肅蘭州樣本被聚為一類，新疆樣本被聚為一類，甘肅白銀樣本被聚為一類，甘肅武威、金昌樣本被聚為一類，內蒙古鄂爾多斯樣本被聚為一類，甘肅酒泉樣本被聚為一類。9個變量被聚為3類，甘草苷與甘草酸被聚為一類，汞與銅被聚為一類，總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷被聚為一類。從甘草聚類熱圖中可見，甘草原料的分類與各變量之間有一定相關性，可能與各種植地區的土壤、氣候等因素有關。

圖3 29批甘草樣本聚類分析熱圖

2.4 主成分分析（PCA）

采用Origin Pro 2023軟件對甘草苷、甘草酸、總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷、汞、銅測定結果進行主成分分析，計算相關矩陣的特征值、特征向量和分值。確定了特征值＞1的3個主成分，3個主成分的累計方差貢獻率為66.62%，由相關矩陣的特征值所作碎石圖見圖4。第一主成分（PC1）解釋了總方差的31.62%，信息主要來自于灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘和砷且均呈正相關；第二個主成分（PC2）解釋了總方差的19.24%，信息主要來自于甘草苷和銅，并與甘草苷呈正相關，與銅呈負相關；第三個主成分（PC3）解釋了總方差的15.76%，信息主要來自于甘草酸和汞，并與甘草酸呈正相關，與汞呈負相關。以PC1，PC2和PC3得分及特征向量繪制29批次甘草樣本的雙標圖如圖5所示，其中甘肅蘭州樣本（S1～S4）、甘肅白銀樣本（S5～S10）、新疆樣本（S25～S29）分布相對獨立；內蒙古鄂爾多斯與甘肅武威、金昌、酒泉樣本較為相似且與甘肅白銀樣本相近，但也能得到有效區分；而各變量特征向量分布情況各異，與聚類分析中變量聚類情況相近。主成分分析與聚類分析結果相一致。

圖4 主成分分析碎石圖

圖5 29批甘草樣品主成分分析雙標圖

2.5 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）

采用SIMCA14.1軟件對29批甘草進行OPLS-DA分析，相關分析情況如圖6和圖7所示。結果表明，通過OPLS-DA可實現對組別1（蘭州）、組別2（白銀）、組別3（武威和金昌）、組別4（酒泉）、組別5（鄂爾多斯）、組別6（新疆）的有效區分，分析中的自變量擬合指數（R2X）為0.830，因變量擬合指數（R2Y）為0.719，模型預測指數（Q2）為0.550，R2和Q2均超過了0.5，表明該模型擬合結果可接受，同時通過200次置換檢測，Q2回歸線與縱軸的相交點小于0，說明模型不存在過擬合，所建立的模型有效，認為該結果可用于各產地甘草測定值的指標對比分析。所生成的變量VIP圖如圖8所示，并以VIP大于1為閾值，篩選出5個貢獻值較大的成分，依次為砷、銅、總灰分、甘草苷和甘草酸，判斷其為區分6個組別樣本的代表性差異性成分。各項指標差異可能與甘草的土壤和種植環境等因素相關。

圖6 OPLS-DA得分圖

圖7 OPLS-DA模型置換驗證圖

3 結論

試驗對甘肅、內蒙古、新疆9個市/州共計29批甘草樣本進行了采集，根據《中國藥典》甘草項下要求進行了測定，所有樣本均符合《中國藥典》要求，因五氯硝基苯、二氧化硫均未檢出，結合測定結果選取甘草苷、甘草酸、總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷、汞、銅9個指標作為變量進行化學計量學（CA、PCA及OPLS-DA）分析。聚類分析和主成分分析結果較為一致，樣本可被分為甘肅蘭州、新疆樣本、甘肅白銀樣本、甘肅武威及金昌樣本、內蒙古鄂爾多斯樣本、甘肅酒泉樣本6個組別，其中甘肅蘭州樣本與新疆樣本較為相近，甘肅武威及金昌樣本、內蒙古鄂爾多斯樣本、甘肅酒泉3組樣本較為相似且與甘肅白銀樣本相近；9個指標則可被分為3類，甘草苷與甘草酸分為一類，汞與銅分為一類，總灰分、酸不溶性灰分、鉛、鎘、砷分為一類。結合各批次甘草分類情況進行了正交偏最小二乘判別分析，可實現上述6個組別樣本的有效區分，砷、銅、總灰分、甘草苷和甘草酸為區分6個組別樣本的代表性差異性成分。試驗結果可能與不同區域甘草的土壤、種植條件等因素有關。甘草在我國種植區域較廣且為多基原藥材，此試驗采集的樣本均為甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.藥材，后期可進一步加大樣本采集量，對3個不同基原的藥材成分和品質進一步開展研究，以更加全面地了解甘草藥材的品質情況。