基于PI3K/Akt/p53信號通路探討白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物誘導急性髓系白血病細胞凋亡的作用

陳 智,林圣云,熊 昊,王 卓,付 強,楊 李,裘 玫

(1. 華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院,湖北 武漢 430016;2. 浙江中醫藥大學附屬第一醫院,浙江 杭州 310006;3. 湖北中醫藥大學中醫臨床學院,湖北 武漢 430061)

急性髓系白血病(AML)為血液系統惡性腫瘤,在兒童期發病率較高,約占兒童白血病的15%～20%,主要特征是造血干細胞異常增殖分化、凋亡受阻,導致正常血細胞減少[1],并通常伴有致癌信號通路的持續激活[2]。近些年,隨著造血干細胞移植技術的不斷進步、新型靶向藥物的廣泛應用、細胞免疫療法的飛躍發展,AML的治療效果有所提升,但難治高危的AML患兒的緩解率仍不足35%,長期預后并未得到明顯改善[3-4]。因此,對于AML發病機制的進一步研究和有效抗白血病藥物的持續開發十分必要。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/p53信號通路在促進細胞生長、繁殖和免疫功能調控等方面具有至關重要的意義[5],調控該信號通路可能是有效治療白血病的可行途徑。白花蛇舌草是茜草科耳草屬植物,是治療惡性腫瘤常用的中草藥。白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物(EAEHDW)是從白花蛇舌草中提取到的主要活性物質,有抗氧化、抗菌、抗突變、抑制腫癌細胞生長等活性[6]。本研究觀察了EAEHDW對AML細胞株Kasumi-1的作用及對細胞中PI3K/Akt/p53信號通路蛋白和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族蛋白表達的影響,以期為研發治療AML的新藥物提供基礎和理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗細胞 白血病Kasumi-1細胞株購自美國標準生物品收藏中心。

1.2實驗藥物 EAEHDW由浙江省中醫院中藥制劑室從白花蛇舌草中提煉得到。提煉方法[7]:將200 g干燥的白花蛇舌草全草粉碎后,放入80%乙醇中浸泡30 min,接著在80 ℃條件下濃縮烘干,得到提取物后溶解并用乙酸乙酯進行液-液萃取,萃取物再用蒸餾水和乙醇(體積分數60%)持續洗脫,洗脫物干燥處理后,制備出濃度12 mg/mL的藥物原液, 20 ℃冷凍保存(純度在98%以上,單體成分為對香豆酸和反式6-O-對香豆酰雞屎藤苷甲酯,獲批專利號:201410324070.2)。

1.3實驗試劑 甲基噻唑基四唑(MTT)試劑、碘化丙啶(PI)檢測盒購自Sigma-Aldrich公司;流式檢測盒購自Biouniquer公司;ECL試劑購自Biological Industries公司;二甲基亞砜(DMSO)購自浙江杭州化學試劑公司;PI3K、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、p53、磷酸化p53(p-p53)、鼠雙微染色體2(MDM2)、磷酸化MDM2(p-MDM2)、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、細胞色素C(Cyto-C)、細胞中多聚ADP核糖聚合酶(PARP)抗體購自Cell Signaling 公司;β-actin抗體購自Santa Cruz公司。

1.4細胞株培養 Kasumi-1細胞株用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養在37 ℃、含有5%CO2的細胞培養箱中,密度為(5～10)×105/mL,每隔2 d更換1次培養液。

1.5實驗組設置 用對數生長期Kasumi-1細胞株進行實驗操作,EAEHDW的濃度先按照0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL進行設置,篩選出合適實驗濃度后進入下一步實驗研究。每次實驗都設空白組,不加藥物樣品。

1.6檢測指標及方法

1.6.1細胞存活情況 采用MTT法檢測:取對數生長期的Kasumi-1細胞,調整細胞濃度為1×105/mL,接種于96孔培養板,分別加入終濃度為0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的EAEHDW(除外空白組),經過24 h和48 h孵育后,每孔避光加入20 μL MTT溶液,再培養4 h后離心棄上清液,每孔加DMSO 200 μL,震蕩10 min后等藍紫色甲臜充分溶解,用紫外分光光度儀檢測570 nm波長的各孔OD值,計算細胞存活率:細胞存活率(%)=(試驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。實驗重復3次取平均值為最后結果,用Logit法計算半數抑制濃度(IC50)。

1.6.2細胞凋亡情況 利用Annexin V-FITC/PI檢測:取對數生長期的Kasumi-1細胞,調整細胞濃度為1×105/mL,接種于6孔培養板中,再加入終濃度為0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的 EAEHDW處理24 h(除外空白組),收集細胞后用冷PBS洗滌,離心后棄上清液,用500 μL Annexin V Binding buffer重懸細胞液,分別加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI,完全混勻后,室溫避光孵育10 min,然后再用流式細胞儀檢測,結果用Cellquest 1.2分析軟件分析。

1.6.3細胞中Caspase家族蛋白和PI3K/Akt/p53通路相關蛋白表達情況 利用Western blot法檢測:調整Kasumi-1細胞密度為1×105/mL,加入0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL的EAEHDW(除外空白組),作用24 h后用蛋白裂解液提取細胞總蛋白。采用BCA法檢測蛋白含量,獲取標本后,進行蛋白變性處理,用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,將不同目的片段通過電泳轉移至PVDF膜上,室溫封閉1 h,加入一抗稀釋液(1∶1 000),緩慢搖動,4 ℃孵育過夜后,用TBST洗滌,加入二抗稀釋液(1∶2 000),室溫孵育1 h后,再次用TBST洗滌。以β-actin作為內參照,使用ECL檢測盒進行顯影,用IPP光密度分析軟件進行分析,各實驗均重復3次。蛋白條帶掃描后用Imagequant 5.1軟件進行量化分析,以目的條帶與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達量。

2 結 果

2.1Kasumi-1細胞存活率 不同濃度的EAEHDW干預后,細胞存活率較空白組明顯降低,且隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加,細胞存活率下降更明顯,差異均有統計學意義(P均<0.05),呈現時間-濃度依賴性(r=0.962,P<0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物干預不同時間后Kasumi-1細胞存活率

2.2Kasumi-1細胞凋亡率 0.02mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的 EAEHDW干預24 h后,細胞凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡)分別為(7.99±0.45)%、(10.22±0.32)%、(20.10±1.99)%、(28.66±0.67)%、(33.24±0.41)%,均明顯高于空白組的(5.33±0.41)%,且隨著藥物濃度的增加,細胞凋亡率升高更明顯,差異均有統計學意義(P均<0.05),呈現劑量依賴性(r=0.385,P<0.05)。見圖2。

圖2 不同濃度白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物干預24 h后Kasumi-1細胞凋亡情況

2.3Kasumi-1細胞中Caspase家族蛋白和PI3K/Akt/p53通路相關蛋白表達情況 與空白組比較,不同濃度的 EAEHDW作用于Kasumi-1細胞后,細胞中PI3K蛋白相對表達量均無明顯變化(P均>0.05);細胞中PARP、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Cyto-C、p53蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05),Akt、p-Akt 、MDM2、p-MDM2蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05),且隨著藥物濃度的增加,上述蛋白表達變化更明顯。見圖3及圖4。

圖3 不同濃度白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物干預24 h后Kasumi-1細胞中Caspase家族相關蛋白表達情況

圖4 不同濃度白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物干預24 h后Kasumi-1細胞中PI3K/Akt/p53信號通路蛋白表達情況

3 討 論

AML早期表現特異性大,遺傳學特征也存在很大個體差異,因此治療和預后大不相同[8]。化療治療AML的完全緩解率約為50%～70%,長期無病生存率僅為25%～30%[9]。造血干細胞移植是目前治愈高危AML的唯一有效手段,但移植后復發率仍達20%～60%[10],并且理想的供體來源受限,治療費用昂貴,因此開發新的抗白血病藥物意義重大。植物提取物已被證明在多種疾病的治療中具有積極作用[11],近年來抗癌中草藥中提取的有效抗腫瘤活性成分聯合經典或者新的靶向藥物治療AML是探索的熱點。

本研究結果顯示, EAEHDW作用于Kasumi-1細胞株后,細胞存活率明顯降低,并且隨藥物劑量增加和作用時間延長,細胞存活率越來越低,說明EAEHDW可抑制白血病細胞增殖;凋亡檢測發現,隨著EAEHDW濃度的增加,細胞凋亡率越來越高,提示EAEHDW抑制Kasumi-1細胞增殖的作用很可能是通過促進細胞凋亡來實現的。

細胞凋亡也叫Ⅰ型程序性死亡,在正常細胞適應內外環境和發生死亡過程中發揮重要作用[12],而惡性腫瘤發生的主要病理基礎為增殖信號對細胞的持續刺激和細胞對凋亡過程的抵抗,因此現階段對惡性腫瘤的主要治療策略為抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡。細胞凋亡主要是通過內源性途徑(線粒體通路途徑)和外源性途徑(死亡受體通路途徑)發生的[13],無論何種途徑誘導的細胞凋亡,都會激活Caspase家族的蛋白。Caspases家族在細胞凋亡過程中扮演著至關重要的角色,它們不僅能夠傳遞凋亡誘導信號,還能夠激活Caspases級聯反應,啟動下游效應因子。在細胞中,Caspases家族蛋白酶以酶原形式存在,但在細胞凋亡過程中可以被激活[14]。當上游的Caspase-8和Caspase-9被激活后,會激活下游的Caspase-3,然后誘導細胞骨架蛋白水解[15],同時它作為細胞凋亡的最終執行者,受到外界因素影響后被激活,在大量自由基和氧化劑存在的前提下,激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1),導致ATP的過度消耗,誘導細胞發生凋亡[16]。本實驗發現,不同濃度的EAEHDW作用于Kasumi-1細胞后,細胞中PARP、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Cyto-C蛋白相對表達量均明顯升高,且隨著藥物濃度的增加,上述蛋白表達變化更明顯,表明EAEHDW是通過同時影響細胞凋亡內外兩個通路,共同激活Caspase蛋白酶級聯反應,最終起到誘導Kasumi-1細胞凋亡的作用。

PI3K/Akt信號通路為細胞內信號轉導通路之一,不僅可以影響正常細胞的發育和分化,還能夠激活眾多的下游效應分子,影響腫瘤細胞的凋亡、轉錄、翻譯、代謝等,該信號通路的異常激活是包括AML在內許多腫瘤預后不良的標志之一,抑制該通路活化能直接加速白血病細胞的凋亡[17-19]。Akt是PI3K信號轉導途徑中重要的下游靶激酶,是一種抗凋亡信號分子[20],其表達受到抑制時,能減弱對MDM2的激活,MDM2可結合p53并抑制 p53 轉錄活性[21],而p53為重要的腫瘤抑制因子,其可抑制腫瘤細胞的增殖,誘導細胞凋亡[22]。p-Akt能通過調節糖代謝影響蛋白質合成,激活腫瘤細胞的生長、繁殖[23]。本研究發現EAEHDW能明顯下調Akt、p-Akt 、MDM2、p-MDM2蛋白表達,上調p53蛋白表達,提示EAEHDW通過對PI3K/Akt 信號通路的抑制作用,減少MDM2的激活,從而增加促凋亡蛋白p53的表達,最終起到誘導Kasumi-1細胞凋亡的作用。

綜上所述,EAEHDW可以顯著抑制Kasumi-1細胞的生長增殖,并誘導其凋亡,分析與阻斷PI3K/Akt信號通路,激發促凋亡蛋白p53表達有關。但EAEHDW是否能在體內發揮與體外實驗相同的抗AML作用,有待在動物模型中進行驗證,以為臨床AML的治療提供更多藥物選擇。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。