冠心病患者微小RNA及外周血T細胞表達對斑塊穩定性的影響

齊貴彬,高建步,張明磊,張永杰,王 星,解莉莉,李京倡,劉 琳

(河南大學附屬南陽市中心醫院 心血管內科,河南 南陽473009)

動脈粥樣硬化主要累及大、中動脈,是一種慢性血管炎性疾病[1]。目前研究認為,動脈粥樣硬化的主要病理機制為血管內皮功能異常導致血管壁粥樣硬化斑塊沉積,引發血管狹窄和閉塞[2]。微小RNA(miRNA,miR)能夠誘發血管平滑肌細胞向增殖狀態轉化,同時促進血管平滑肌細胞向內膜遷移,參與動脈粥樣硬化斑塊的形成和發展[3]。近年來動物實驗中發現的可能與動脈粥樣硬化有關的3種miRNA包括miR-126、miR-221、miR-155[4]。CD4+調節性T細胞在維持免疫平衡狀態方面發揮重要作用,細胞高表達的CD25+Foxp3+是CD4+調節性T細胞特異性標志[5]。脂質核心、表面內皮、外周纖維帽共同構成了動脈粥樣硬化斑塊,可分為脂質成分較少,周圍以膠原組織和平滑肌細胞為主的穩定斑塊;以及脂質松軟且較多,斑塊纖維帽很薄,平滑肌細胞較少的不穩定斑塊[6]。動脈粥樣硬化斑塊的穩定性直接影響到冠心病患者繼發性血栓的形成風險,因此本研究探討冠心病患者miR-126、miR-221、miR-155及外周血T細胞表達對斑塊穩定性的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年2月至2020年6月間河南大學附屬南陽市中心醫院心內科收治的冠心病患者138例。入選標準:冠狀動脈造影顯示1支及以上的主要冠脈狹窄程度達到III級。排除標準:①有PCI手術、球囊擴張術治療史的患者;②合并感染性疾病,自身免疫性疾病,惡性腫瘤,肝、腎功不全的患者。其中男性90例,女性48例;年齡49～67歲,平均年齡(57.28±6.50)歲。選取健康志愿者60例為對照組,男性41例,女性19例;年齡48～65歲,平均年齡(56.94±5.63)歲。一般資料在各組間比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。此項研究經醫院倫理委員會審批通過,患者的家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1血管內超聲檢查 向冠脈造影顯示的管腔直徑狹窄程度50%及以上的冠脈中注入200U硝酸甘油,使用超聲診斷儀和冠脈超聲成像導管,在X線透視下將超聲探頭導管沿著導引絲放入冠脈。到冠脈狹窄病變處遠端,以0.5 mm/s的速度回撤超聲探頭導管,采集影像數據,通過虛擬組織學技術評價斑塊性質,將冠心病患者分為穩定斑塊組56例,不穩定斑塊組82例。

1.2.2外周循環miR-126、miR-221、miR-155檢測 采集冠心病患者和對照組受試者清晨空腹外周靜脈血6 ml,抗凝處理后取其中4 ml分離血清和血漿,-80℃保存待測。采用實時熒光定量PCR技術檢測血漿miR-126、miR-221、miR-155表達水平,PCR擴增引物由上海一研生物科技有限公司設計合成。miR-126上游引物:5′-TAATAATGAGTGCCATGCTGAGCTC-3′,下游引物:5′-GTAATACAGTGCCATGCTTTCGAA-3′。miR-221上游引物:5′-GG AACCTGCCATAACGGACAGTCACTTTAT-3′,下游引物:5′-GAGAGCTATAA AGGCGCCACTACTATTTGA-3′。miR-155上游引物:5′-TAGAGACGGGGCG GAGACGAGCTA-

GTAA-3′,下游引物:5′-AGTATATAACCTTGTAACATTTGG TATAG-3′。人snRNAU6(內參)上游引物:5′-TGGAGCCTGGGACGTGACCAG -3′,下游引物:5′-CGACGGCTTCGCTCGTGGGGCT-3′。PCR擴增參數:95℃ 預變性5 min、95℃ 變性30 s、60℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30個循環。計算miR-126、miR-221、miR-155的相對表達量。

1.2.3外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞檢測 取另外2 ml抗凝處理后的空腹外周靜脈血,Ficoll密度梯度離心分離單個核細胞,除去黏附細胞后得到總T細胞,光學顯微鏡下調整細胞密度為1×105個/ml,使用PerCP-抗CD3、FITC-抗CD4、PE-抗CD25標記T細胞,4℃靜置30 min,使用含10%胎牛血清的磷酸緩沖液洗滌3次,加入1 ml磷酸緩沖液重懸,CD3+設門,流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞占CD4+細胞的比例。

1.2.4血脂4項和血清γ干擾素(IFN-γ)水平測定 取血清標本,全自動生化分析儀測定總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平,檢測試劑購于美康生物科技有限公司;酶聯免疫吸附法檢測血清IFN-γ水平,試劑盒購于北京邁瑞達科技有限公司。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組miR-126、miR-221、miR-155表達水平比較

miR-126、miR-221、miR-155表達水平在對照組、穩定斑塊組、不穩定斑塊組之間比較差異均有統計學意義(P<0.05);與對照組比較,穩定斑塊組、不穩定斑塊組患者miR-126表達水平明顯降低,miR-221、miR-155表達水平明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);不穩定斑塊組患者miR-126表達水平明顯低于穩定斑塊組,miR-221、miR-155表達水平明顯高于穩定斑塊組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-126、miR-221、miR-155表達水平比較

2.2 各組CD4+調節性T細胞及IFN-γ水平比較

CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞占CD4+細胞的比例、血清IFN-γ水平在對照組、穩定斑塊組、不穩定斑塊組之間比較差異均有統計學意義(P<0.01);與對照組相比,穩定斑塊組、不穩定斑塊組患者CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞占CD4+細胞的比例明顯降低,血清IFN-γ水平明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);不穩定斑塊組患者CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞占CD4+細胞的比例明顯低于穩定性斑塊組,血清IFN-γ水平明顯高于穩定性斑塊組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組CD4+調節性T細胞及IFN-γ水平比較

2.3 各組血脂水平比較

與對照組相比,穩定斑塊組、不穩定斑塊組患者總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平明顯升高,高密度脂蛋白膽固醇水平明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05);不穩定斑塊組患者總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平明顯高于穩定斑塊組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組血脂水平比較

2.4 冠心病患者miR-126、miR-221、miR-155表達水平與血脂4項和CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞占CD4+細胞比例的相關性分析

Pearson相關性分析顯示,冠心病患者miR-126表達水平與總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平呈負相關,與CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞占CD4+細胞的比例呈正相關。冠心病患者miR-221、miR-155表達水平與總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平呈正相關,與CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞占CD4+細胞比例呈負相關。見表4。

表4 冠心病患者miR-126、miR-221、miR-155表達水平與血脂4項的相關性分析

2.5 冠心病患者CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞占CD4+細胞的比例與血脂4項的相關性分析

Pearson相關性分析顯示,冠心病患者CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞占CD4+細胞的比例與總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平無明顯相關性(r=-0.265、-0.207、-0.319、0.224,均P>0.05)。

3 討論

相關研究顯示,血管內皮細胞中miR-126高表達與血管重塑明顯相關,能夠調控單核細胞趨化蛋白、血管細胞黏附因子等靶基因的表達[7]。在大腦中動脈閉塞大鼠模型中血清miR-126表達水平明顯降低[8]。研究認為miR-221的生物學功能存在細胞特異性,在血管內皮細胞中能夠抑制細胞增殖和凋亡,但在血管平滑肌細胞中能夠促進細胞增殖和凋亡[9]。血管內皮細胞中miR-221高表達與血管重塑明顯相關,能夠調控單核細胞趨化蛋白等靶基因表達,促進不穩定斑塊的形成[10]。miR-155與免疫系統功能和內皮細胞炎性應答明顯相關,其高表達能夠抑制內皮細胞一氧化氮合酶(NOS)生成,進而降低血管內皮的舒張功能,促進動脈粥樣硬化斑塊形成[11]。對動脈粥樣硬化小鼠模型研究顯示,敲除miR-155后能夠明顯縮小硬化斑塊,抑制不穩定斑塊形成[12]。本研究結果顯示,穩定斑塊組、不穩定斑塊組患者miR-126表達明顯降低,miR-221、miR-155表達明顯升高;其中不穩定斑塊組患者改變較穩定斑塊組更明顯。提示miR-126低表達,miR-221、miR-155高表達可能促進不穩定斑塊的形成。

慢性炎癥反應貫穿動脈粥樣硬化發生、發展至不穩定斑塊形成的整個過程[13]。本研究結果顯示,穩定斑塊組、不穩定斑塊組患者CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞占CD4+細胞的比例明顯低于對照組,不穩定斑塊組患者CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞占CD4+細胞的比例明顯低于穩定斑塊組。提示CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的免疫調控機制參與冠心病患者動脈粥樣硬化斑塊形成過程。近年來對動脈粥樣硬化炎性反應的T細胞研究發現,IFN-γ作為免疫活化因子,在動脈粥樣硬化發生與進展過程中起著重要作用,包括促進巨噬細胞分化,抑制內皮細胞增長、平滑肌細胞的膠原合成等[14]。本研究中穩定斑塊組、不穩定斑塊組患者血清IFN-γ水平明顯高于對照組;不穩定斑塊組患者血清IFN-γ水平明顯高于穩定斑塊組。提示IFN-γ分泌量增加可能是影響斑塊穩定性的一個重要因素。相關性分析顯示,冠心病患者miR-126表達水平與CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞占CD4+細胞的比例呈正相關;miR-221、miR-155表達水平與CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞占CD4+細胞比例呈負相關。提示miR-126可能正向調節CD4+調節性T細胞表達,miR-221、miR-155負向調節CD4+調節性T細胞表達,進而通過調節性T細胞的免疫抑制作用來降低冠脈中斑塊的炎癥反應,減緩斑塊向不穩定狀態的進展。

相關研究顯示,斑塊穩定性與內部脂質含量水平密切相關,降低LDL-C水平能夠有效穩定斑塊[15]。本研究結果顯示,穩定斑塊組、不穩定斑塊組患者總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平明顯高于對照組,不穩定斑塊組患者總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平明顯高于穩定斑塊組,與上述研究結論一致。相關性分析顯示,冠心病患者miR-126表達水平與總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平呈負相關;miR-221、miR-155表達水平與總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平呈正相關。提示miR-126、miR-221、miR-155在影響血管內皮細胞、單核細胞趨化蛋白、血管細胞黏附因子、調節性T細胞等表達同時,還可能通過影響冠心病患者的血脂水平來影響斑塊穩定性,具體的分子通路仍需進一步深入研究。