院內多重耐藥鮑曼不動桿菌分子流行病學和耐藥性研究

劉麗娟,陳秀美,張 敏,翟 偉,任玉國

(濟南市人民醫院 檢驗科,山東 濟南271100)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii,AB)是重要的條件致病菌,屬于非發酵革蘭陰性球桿菌,較強的獲得性耐藥和克隆性傳播的能力,致使多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDRAB)在院內各類重癥監護病房廣泛流行[1]。雖然其毒力、致病性不強,但其極高的檢出率和耐藥率,極易引起爆發流行。一旦由條件致病菌轉化為致病菌,給臨床抗感染治療帶來極大困擾。掌握院區內MDRAB的耐藥機制、傳播途徑及方式對規范應用抗菌藥物、預防控制MDRAB的院內爆發流行極為重要。本研究運用多位點序列分型(MultilocusSe-quenceTyping,MLST)和脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)同時對醫院臨床及環境分離的MDRAB菌株間的進化關系及院內主要流行克隆進行綜合分析,為預防控制MDRAB的院內爆發流行提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2020年5月至2021年4月院內臨床及環境分離出的非重復MDRAB菌株 34株。PFGE標準菌株為布倫鄧祿普沙門菌H9812(山東省CDC提供)。

1.2 細菌鑒定及藥物敏感試驗

BD Phoenix NMIC-413復合板進行菌種鑒定及藥物敏感性試驗,執行2020CLSI標準。另外頭孢哌酮/舒巴坦敏感性試驗執行CLSI中頭孢哌酮的標準,替加環素敏感性試驗執行FDA的標準(S≤2 mg/L,I=4 mg/L,R≥8 mg/L),多黏菌素執行2020 USCAST的折點(S≤2 mg/L,R≥4 mg/L)。大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853作為質控菌株。

1.3 耐藥基因檢測

采用煮沸法提取細菌DNA模板,多聚酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法對β-內酰胺酶耐藥基因blaKPC、blaNDM-1、blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-51-like、blaOXA-58-like、blaOXA-143-like、CTX、TEM、DHA等進行檢測,引物參照文獻[2-5]。對部分陽性基因PCR產物進行測序,并將測序結果在GenBank網上查詢。

1.4 多位點序列分型

選擇 Oxford方案對鮑曼不動桿菌7個管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD進行序列擴增并測序。將測序結果提交到網站(http://pubmlst．org/abaumannii)進行在線序列比對,確定其等位基因型及ST型。再用eBURST軟件進行菌株親緣性分析,其中7個位點中有6個及6個以上位點相同即定義為遺傳相關克隆[6-7]。

1.5 脈沖場凝膠電泳

將37℃ 24 h血平皿培養的MDRAB配制成濃度為3.0～3.5個麥氏單位的菌懸液。瓊脂糖凝膠包被,蛋白酶K裂解消化,ApaI限制性內切酶于37℃酶切,1%瓊脂糖凝膠,電壓為 6.0 V/cm,電場夾角為 120°,進行19 h電泳。EB染色后成像。用BioNumerics軟件對電泳圖譜進行數據分析。PFGE結果按照Tenovel等[8]推薦方法判讀,圖譜完全一致為同一型,1～3個條帶不同者為同一型的不同亞型,差異3個條帶以上者為另一型。PFGE 條帶相差≥7條為不同克隆。

1.6 統計學分析

用WHONET5.6軟件對MDRAB菌株資料進行耐藥性分析。

2 結果

2.1 科室及標本分布

收集2020年5月至2021年4月非重復MDRAB菌株34株,臨床標本25株,環境標本9株。25株臨床標本科室分布:重癥醫學科病房13株,呼吸重癥科病房5株,神經外科病房2株,急癥科病房2株、關節運動科、脊柱外科病房、新生兒科病房各1株。9株環境MDRAB菌株均來源于重癥醫學科病房。標本來源:病房環境采樣9株、血液8株、痰液7株、灌洗液5株、穿刺液4株、尿液1株。見表1。

表1 MDRAB科室及標本的分布

2.2 抗菌藥物敏感試驗MIC值

34株MDRAB對頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、環丙沙星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南均100%耐藥;氨基糖苷類阿米卡星的耐藥率為55.9%(19/34)、妥布霉素的耐藥率均為82.4%(28/34);復方新諾明的耐藥率為88.2%(30/34);沒有出現對米諾環素和替加環素耐藥的菌株,但中介率分別為41.2%(14/34)和14.7%(5/34);對多黏菌素100%敏感。見表2。

表2 MDRAB抗菌藥物的MIC值(μg/mL)

2.3 β-內酰胺類耐藥基因及測序結果

34株MDRAB blaOXA23、blaOXA-51及blaOXA64gp基因PCR擴增均為陽性。TEM基因PCR擴增陽性率為85.3%(29/34),未檢出blaOXA-24、blaOXA-58、blaOXA-143、blaKPC、blaNDM-1、CTX、DHA等β內酰胺酶基因。blaOXA-51-Like+blaOXA-23-like+blaTEM三聯碳青霉烯耐藥模式為85.3%。隨機抽取陽性基因擴增產物進行測序,結果分別為blaOXA23、blaOXA-51、blaOXA64及TEM。部分產物擴增及測序見圖1～3。

注:Marker為DNA標志物;泳道1～34為臨床blaOXA23基因陽性菌株

注:Marker為DNA標志物;泳道1～3,9,14為臨床blaTEM-1基因陰性菌株;泳道4～8,10～13,15～34為臨床blaTEM-1

圖3 OXA23基因PCR產物測序圖

2.4 MLST分子分型及PFGE同源性分析結果

25株臨床MDRAB用MLST和PFGE進行同源性分析,結果得到7個ST序列類型:依次為ST540(10/25)、ST195(5/25)、ST369(3/25)、ST208(2/25)、ST381(2/25)、ST938(2/25)和ST451(1/25);6個克隆群:分別為A群(9/25)、D群(8/25)、C群(4/25)、F群(2/25)、E群(1/25)、G群(1/25)。ST540和ST195是主要流行的序列類型,A群、B群是主要流行的克隆群。9株環境MDRAB MLST和PFGE同源性監測得到2個ST序列類型:ST208(8/9)、ST540(1/9);2個克隆群:B群(8/9)、C群(1/9)。見表1及圖4。

圖4 34株MDRAB PFGE聚類分析

3 討論

MDRAB是院內感染的重要病原菌,尤其在重癥監護病房。本研究25株臨床MDRAB菌株20株來源于重癥監護病房,其中重癥醫學科13株、呼吸重癥病房5株,急癥科監護病房2株。重癥醫學科及院內各專業重癥監護病房患者大部分伴有嚴重基礎疾病,免疫力差、住院時間長、具有多種抗菌藥物應用史,伴有侵入性操作,原定植于呼吸道的MDRAB菌株極易隨著侵襲性操作發生位置的遷移,由定植菌轉化為致病菌。25株MDRAB菌株主要來源于呼吸道標本(11/25)和血液標本(8/25)。文獻顯示鮑曼不動桿菌逐漸成為醫院獲得性血流感染常見病原菌,有報道在中國西部地區鮑曼不動桿菌已經成為醫院獲得性血流感染第六位常見病原菌[9],這多與重癥監護患者接受侵入性操作是相關的[10]。

CRAB最主要的耐藥機制是產生能夠水解碳青霉烯的OXA型的D類β-內酰胺酶,包括6個家族:OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-51-like、OXA-58-like、OXA-143-like和OXA-235-like。OXA-51-like酶是鮑曼不動桿菌本身固有,其他耐藥基因均為外界獲得的。其中OXA-23型酶最常見,可同時存在于染色體和質粒中,是與CRAB 院內感染暴發相關最常見的耐藥基因。本研究34株MDRAB 100%攜帶blaOXA23、blaOXA-51、blaOXA64基因,TEM-1基因的攜帶率為85.3%(29/34),未檢出blaOXA-24、blaOXA-58、blaOXA-143、blaKPC、blaNDM-1、CTX、DHA等β-內酰胺酶基因。blaOXA23為院內MDRAB菌株攜帶的最主要的碳青霉烯酶,是導致耐藥性傳播的主要基因型。blaOXA-51-Like+blaOXA-23+blaTEM-like是院內主要碳青霉烯耐藥模式,高達85.3%(29/34)。對臨床常用β-內酰胺類及加酶抑制劑藥物均表現出了多重耐藥的特征,與課題組以往研究一致[11]。沒有出現對米諾環素和替加環素耐藥的菌株,但中介率分別為41.2%(14/34)和14.7%(5/34),對多黏菌素100%敏感。提示多黏菌素和替加環素已取代碳青霉烯類抗生素成為院內治療鮑曼不動桿菌的最后一道防線。但是有研究[12]提示,臨床分離的對多黏菌素敏感鮑曼不動桿菌,異質性耐藥率高達83%,臨床應高度重視抗生素的規范化應用。

MLST和PFGE是菌株同源性分析常用的方法,其中PFGE被譽為細菌分子分型技術的“金標準”,在識別和追蹤感染暴發或流行中被廣泛應用[13-14]。從25株臨床MDRAB MLST和PFGE同源性監測結果來看,2020年至2021年院內臨床流行的MDRAB序列類型為ST540(10/25)和ST195(5/25),主要的克隆群為A群(9/25)、D群(8/25);2020年和2021年院內MDRAB流行的主要ST序列型及克隆群存在一定的差異。2020年以ST195(5/16)、D克隆群(8/16)為主,2021年以ST540(7/9)、A克隆群(5/9)為主,ST540、A克隆群貫穿2020年至2021年且在多個重癥監護病區播散流行。與環境MDRAB的主要ST208(8/9)和克隆群B群(8/9)不一致。25號感染患者監測到的MDRAB為ST540序列 、G1克隆群與其周圍環境MDRAB的ST208和B克隆群完全不同。環境中MDRAB檢測到的B克隆群2年內均未在臨床MDRAB菌株內流行過。與相關研究重癥監護室中鮑曼不動桿菌的感染暴發與其環境傳播密切相關[15]不一致。這可能和臨床及環境MDRAB標本的采樣時間段及標本量的代表性存在一定關系。需要在今后的研究中進一步證實。

綜上所述,院內MDRAB主要來源于重癥監護病房,blaOXA-51-Like+blaOXA-23+blaTEM-like是院內主要碳青霉烯耐藥模式。院內臨床流行的主要序列類型為ST540和ST195,主要的克隆群為A群、D群。ST540、A克隆群MDRAB貫穿整個研究階段且在多個重癥監護病區播散流行。臨床與環境MDRAB主要流行的ST序列型和克隆群不一致。下一步研究需要進一步規范對臨床及環境樣本采集量、方式及時間點,對菌株進行同源性分析,識別和追蹤感染暴發或流行的根源,從而預防和控制MDRAB的進一步傳播。