高氧誘導(dǎo)大鼠肺泡Ⅱ型細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬與其功能的關(guān)系

劉嘉璐,于愷華,郭 鴻,姚 瑩,鮑振星,施華清,李玉蘭,3*

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州730000;2.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州730000;3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 麻醉科,甘肅 蘭州730000)

全身麻醉或ICU(Intensive care unit)患者高氧血癥發(fā)生率高達(dá)83%[1],高氧可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用[2]。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial type Ⅱ cell,AECⅡ)是高氧介導(dǎo)肺損傷的關(guān)鍵細(xì)胞[3],AECⅡ分泌的二棕櫚酰卵磷脂(DPPC),是肺表面活性物質(zhì)的主要成分,對(duì)維持肺泡形態(tài)穩(wěn)定具有重要作用[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白合成、分泌的場(chǎng)所,也是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、提高細(xì)胞適應(yīng)性的物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬(endoplasmic reticulum autophagy,ER-phagy)是細(xì)胞自噬的一種類型,在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)、緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、防御細(xì)菌和病毒感染的過程中發(fā)揮重要作用[6]。有研究表明細(xì)胞自噬參與了慢性阻塞性肺疾病(COPD)、特發(fā)性肺纖維化、急性肺損傷等肺部疾病的調(diào)節(jié)[7]。肺細(xì)胞的自噬不足或過度均可引起或加重肺損傷[8-10]。高氧肺損傷過程是否誘發(fā)了AECⅡ內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬對(duì)AECⅡ產(chǎn)生表面活性物質(zhì)的功能有無(wú)影響,目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)建立AECⅡ高氧模型,研究不同時(shí)長(zhǎng)高氧條件下AECⅡ內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬及其DPPC產(chǎn)生的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 RLE-6TN購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院,為永生化大鼠 AECⅡ。

1.1.2主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、鏈霉素、青霉素、0.25%胰酶、引物均購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(TB Green○RPremix Ex TaqTMII)購(gòu)自Takara Bio寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;DPPC酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海源桔生物科技公司;ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62抗體及GAPDH抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組 RLE-6TN細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37℃、5% CO2的常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶80%～90%時(shí),用胰酶消化并傳代,2～3 d傳代1次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)48 h不分段后采用隨機(jī)數(shù)字表法將細(xì)胞分為對(duì)照組(C組,21% O2常規(guī)培養(yǎng)72 h) 、高氧12、24、48、72 h組(H1、H2、H3、H4組,95% O2分別培養(yǎng)12、24、48、72 h)。

1.2 方法

1.2.1qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 收集各組細(xì)胞,采用Trizol 法提取總RNA,紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)。PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(TB Green○R Premix Ex TaqTMII)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR測(cè)定。以GAPDH作為內(nèi)參,擴(kuò)增基因?yàn)镕AM134B、SEC62、ATL3、RTN3、CCPG1。反 應(yīng) 程 序:95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s 和 60 ℃ 30 s,40 個(gè)循環(huán)s。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2.2Western blotting檢測(cè)CCPG1、FAM134B蛋白相對(duì)表達(dá) 利用 BSA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量,不同樣品取等量的蛋白質(zhì)(20 μg);6% SDS-Page變性膠電泳,條件為80 V,30 min后,將電壓調(diào)至120 V,繼續(xù)電泳90 min;恒流250 mA轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉1 h后,孵育使用相關(guān)一抗,4℃振搖過夜;次日5% PBST洗膜,10 min,4次;孵育對(duì)應(yīng)的二抗,振搖1 h,5% PBST洗膜,10 min,3次;暗房曝光顯影,采用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3ELISA法檢測(cè)DPPC水平 將細(xì)胞用RIPA裂解離心后取上清液,加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,37℃溫育30 min;洗板5次,加入酶標(biāo)試劑,37℃溫育30 min;洗板5次,加入顯色液A、B,37℃溫育30 min;加入終止液;15 min之內(nèi)讀取OD值。測(cè)定DPPC濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 GraphPad Prism 9.5.0軟件進(jìn)行分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間采取單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行比較。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA表達(dá)

如圖1所示:與C組相比,H1組ATL3、SEC62的mRNA水平下降(P均<0.05),CCPG1、FAM134B、RTN3的mRNA水平顯著下降(P均<0.01);H2組ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);H3、H4組ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA水平顯著下降(P均<0.01)。與H1組相比,H2組CCPG1、FAM134B的mRNA水平顯著升高(P均<0.01);H3組RTN3的mRNA水平下降(P<0.05);H4組ATL3的mRNA水平下降(P<0.05),RTN3的mRNA水平顯著下降(P<0.01)。與H2組相比,H3組、H4組ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3的mRNA水平顯著下降(P均<0.01);H4組SEC62的mRNA水平下降(P<0.05);其余各組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

圖1 高氧處理的各組細(xì)胞ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA表達(dá)

2.2 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

如圖2所示:與C組相比,H1組CCPG1的蛋白水平下降(P<0.05),ATL3、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P<0.01);H2組ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);H3組和H4組ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P均<0.01)。與H1組相比,H2組ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著增高(P<0.01);H3組ATL3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P<0.01),RTN3的蛋白水平下降(P<0.05);H4組ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P<0.01),CCPG1的蛋白水平下降(P<0.05),其余各組的蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與H2組相比,H3組ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P<0.01),CCPG1、FAM134B的蛋白水平下降(P<0.05);H4組ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P<0.01)。與H3組相比,H4組ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P<0.01)。其余各組的蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

圖2 高氧處理的各組細(xì)胞Western blotting檢測(cè)ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62蛋白表達(dá)

2.3 ELISA法檢測(cè)DPPC含量

如圖3所示:與C組相比,H1組DPPC產(chǎn)量下降(P<0.05);H2組DPPC產(chǎn)量增高(P<0.05);H3、H4組DPPC產(chǎn)量下降(P均<0.01)。與H1組相比,H2組DPPC產(chǎn)量顯著增高(P<0.01);H3組、H4組DPPC產(chǎn)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與H2組相比,H3組、H4組DPPC產(chǎn)量顯著下降(P<0.01),其余各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 高氧處理的各組細(xì)胞DPPC產(chǎn)量

3 討論

本研究基于大多數(shù)ICU重癥患者吸氧治療時(shí)間[11],探究不同時(shí)間高氧暴露對(duì)AECⅡ內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬與肺泡表面活性物質(zhì)產(chǎn)生功能之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,高氧12 h后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體水平下降,自噬蛋白ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62表達(dá)下降,DPPC產(chǎn)量也隨之下降;高氧24 h后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體mRNA恢復(fù)到基礎(chǔ)水平,ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62蛋白表達(dá)也得到恢復(fù),此時(shí)DPPC產(chǎn)量達(dá)到峰值;高氧48 h后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體mRNA水平、ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62蛋白表達(dá)、DPPC產(chǎn)量再次下降;高氧72 h后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體mRNA水平、ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62蛋白表達(dá)、DPPC產(chǎn)量仍保持較低水平。這些數(shù)據(jù)表明高氧12 h可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平,并影響DPPC產(chǎn)生;高氧24 h后,隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平的恢復(fù),DPPC產(chǎn)量升高并且達(dá)到了峰值;高氧48～72 h后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平和DPPC產(chǎn)量再一次下降并維持在較低水平。因此,AECII內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬與肺泡表面活性物質(zhì)產(chǎn)生功能之間有密切的關(guān)系。

氧療是治療肺部疾病最常用的方法,短期內(nèi)可能有益,但長(zhǎng)期來看并非沒有風(fēng)險(xiǎn),它會(huì)導(dǎo)致高氧肺損傷(HALI)[12],HALI的機(jī)制非常復(fù)雜,至今尚未完全清楚,其特征是嚴(yán)重的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和AECⅡ的死亡。AECⅡ具有合成分泌表面活性物質(zhì)、肺水轉(zhuǎn)運(yùn)和免疫防御的功能,與肺損傷及其修復(fù)有著密切的關(guān)系[13]。肺泡表面活性物質(zhì)是磷脂(PL)和蛋白質(zhì)(SP)的混合物,可降低肺泡氣液界面的表面張力,避免液體外滲進(jìn)入肺泡發(fā)生肺泡積液,保持肺中的液體平衡。它由大約70%至80%的PL組成,主要成分是DPPC,還有10%的SP-A、B、C和D(肺表面活性蛋白A、B、C、D)以及10%的中性脂質(zhì)[4]。DPPC已被證明可以調(diào)節(jié)肺部炎癥反應(yīng)[14],但在高氧肺損傷中的作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)中,高氧12 h后,DPPC產(chǎn)量開始下降,24 h DPPC產(chǎn)量達(dá)到峰值,說明適度的自噬能夠調(diào)節(jié)AECII細(xì)胞加強(qiáng)功能,產(chǎn)生更多的表面活性物質(zhì)以保護(hù)高氧對(duì)肺泡的損傷。但高氧48 h后,DPPC產(chǎn)量再次下降,72 h DPPC產(chǎn)量仍在較低值。說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬代償調(diào)節(jié)能力已達(dá)到極限,AECII產(chǎn)生DPPC的能力不再恢復(fù)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的主要功能是降解多余的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及有毒的蛋白聚集體,從而控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體積,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[15]。同時(shí)也是宿主細(xì)胞清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中病毒或細(xì)菌的一種積極防御機(jī)制,在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[16]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬相關(guān)受體,包括ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62[17]。ATL3特點(diǎn)是具有GTP 酶(GTPase)活性,并參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化[17]。CCPG1為細(xì)胞周期進(jìn)展基因1,通過去除部分?jǐn)y帶不溶性蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),局部限制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白穩(wěn)態(tài)[18]。在正常生理狀態(tài)下,FAM134B 蛋白通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周轉(zhuǎn)參與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[19]。了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體對(duì)于揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的生理意義至關(guān)重要。而在某些環(huán)境下,如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)缺乏、錯(cuò)誤折疊蛋白的積累或病原體攻擊時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平顯著增加[17]。在本研究中,CCPG1、FAM134B在mRNA水平表達(dá)最為敏感,與高氧12 h相比,高氧24 h CCPG1、FAM134B mRNA水平顯著上調(diào),但CCPG1、FAM134B在蛋白水平并未升高,這可能與轉(zhuǎn)錄后翻譯的時(shí)間不一致有關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān),包括神經(jīng)退行性病變、過敏性鼻炎、惡性腫瘤、糖尿病及傳染性疾病等[20-22]。相關(guān)研究表明,細(xì)胞自噬是一種保護(hù)機(jī)制,以防止高氧引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷,使用自噬激動(dòng)劑可以緩解過度氧化引起的變化并起到保護(hù)作用[23]。ZHANG等[24]發(fā)現(xiàn)高氧24 h通過JNK信號(hào)介導(dǎo)的Atg7上調(diào)引發(fā)自噬,導(dǎo)致SP-C在AECⅡ中積累,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其類似。在高氧環(huán)境下AECⅡ內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在12 h時(shí)開始下降,表面活性物質(zhì)產(chǎn)生功能也隨之下降;當(dāng)在高氧環(huán)境下24 h時(shí),AECⅡ內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬反應(yīng)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平,可能由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬發(fā)生代償?shù)脑駾PPC的產(chǎn)量明顯增加;高氧48 h后,AECⅡ內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬再次下降,由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬無(wú)法持續(xù)代償,導(dǎo)致DPPC的產(chǎn)量下降。

綜上,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高氧環(huán)境12 h ACEⅡ內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平與DPPC產(chǎn)量同時(shí)下降,24 h ACEⅡ內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平代償上調(diào)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平,且ACEⅡ中DPPC產(chǎn)量達(dá)到最高,48 h后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平與DPPC產(chǎn)量再次下降,72 h內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平與DPPC產(chǎn)量仍保持較低水平。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬與ACEⅡ細(xì)胞功能密切相關(guān),臨床高濃度氧療時(shí)間不宜超過24 h。