后縱韌帶骨化癥患者基因變異及表型分析

陳欣，張立，周非非，趙衍斌，刁垠澤，潘勝發(fā)，王少波，張鳳山，孫宇

后縱韌帶骨化癥（ossification of the posterior longitudinal ligament, OPLL）是以后縱韌帶異常增生并骨化為特點(diǎn)的疾病，可壓迫神經(jīng)根導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙甚至高位截癱。中國(guó)人頸椎OPLL 和胸椎OPLL 的患病率分別為4.1%和2.25%[1]。流行病學(xué)和家系研究均表明遺傳因素參與OPLL 的發(fā)生與發(fā)展[2]。陳振等[3]也發(fā)現(xiàn)頸椎OPLL 家族聚集性人群OPLL 發(fā)生率較普通人群明顯升高，提示遺傳因素在頸椎OPLL發(fā)生機(jī)制中占重要地位[3]。雖然利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome wide association study,GWAS）[4]、連鎖分析和病例-對(duì)照相關(guān)性研究[5]已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與OPLL 相關(guān)的基因/基因座，但其中僅有Enpp1基因純合缺陷小鼠[6-7]出現(xiàn)了類(lèi)似于人類(lèi)OPLL 的表型。有報(bào)道ENPP1基因變異可導(dǎo)致全身性嬰兒動(dòng)脈鈣化（OMIM：#208000）和低磷血癥性佝僂病（OMIM：#613312），其中個(gè)別病例伴有OPLL 的發(fā)生，呈常染色體隱性遺傳[8]。然而，最近有報(bào)道ENPP1單等位基因變異也可導(dǎo)致OPLL 的發(fā)生[9]。本研究通過(guò)對(duì)OPLL 患者進(jìn)行全外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing, WES），明確其可能的致病原因。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床癥狀、體格檢查及脊柱正側(cè)位X 線(xiàn)片診斷為OPLL；②簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①正在參加其他干預(yù)性臨床試驗(yàn)者；②有精神障礙或認(rèn)知障礙者；③內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病患者；④心肺疾病患者；⑤神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者；⑥嚴(yán)重的肝腎疾病、腫瘤患者。

2017年1月至2019年12月北京大學(xué)第三醫(yī)院收治OPLL 患者125 例，依據(jù)上述納入與排除標(biāo)準(zhǔn)選取93 例患者進(jìn)行WES。其中男56 例，女37 例，年齡33～75歲，平均（52.1±11.0）歲。

本研究經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（IRB00006761-2015029），所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 基因組DNA提取

取患者EDTA 抗凝外周靜脈血2 mL，采用QIAamp 全血DNA 提取試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司）提取基因組DNA。

1.3 WES

將基因組DNA 打斷、純化，使用Agilent SureSelect Human All Exome V6 試劑盒（加拿大Agilent Technologies公司）進(jìn)行全基因組外顯子捕獲，應(yīng)用Illumina Hiseq X Ten測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行讀長(zhǎng)為150 bp的雙端高通量測(cè)序，測(cè)序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制，運(yùn)用序列比對(duì)軟件Burrows-Wheeler Aligner（BWA）[10]與GRCh37/hg19人類(lèi)參考基因組進(jìn)行比對(duì)，利用ANNOVAR[11]進(jìn)行變異位點(diǎn)注釋。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用千人基因組、dbSNP、gnomAD和ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)分析變異頻率，如果變異為雜合，濾掉次等位基因頻率＞0.005 的普遍變異，如變異為純合或同一基因中有2個(gè)或以上雜合變異，濾掉次等位基因頻率＞0.02的普遍變異。利用預(yù)測(cè)軟件SIFT、Polyphen-2、Mutation Taster、CADD 等進(jìn)行變異的有害性預(yù)測(cè)。篩選出剪接位點(diǎn)變異、移碼變異、無(wú)義變異及至少2個(gè)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)為有害的錯(cuò)義變異。選擇GWAS、連鎖分析和病例-對(duì)照相關(guān)性研究得到的OPLL 相關(guān)基因，從過(guò)濾后的變異中篩選患者中出現(xiàn)的OPLL 相關(guān)基因變異。查閱在線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM）、ClinVar、人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Gene Mutation Database,HGMD）是否收錄該變異，利用UCSC（http://genome.ucsc.edu）對(duì)變異進(jìn)行同源序列保守性分析，利用InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）進(jìn)行變異位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域分析，利用UCSF chimera[12]進(jìn)行蛋白三維結(jié)構(gòu)分析，綜合判斷變異的致病性。

1.5 ENPP1基因變異患者臨床表型分析

根據(jù)影像學(xué)表現(xiàn)對(duì)OPLL 進(jìn)行分型[13]。手術(shù)前后采用日本骨科協(xié)會(huì)（Japanese Orthopedic Association, JOA）評(píng)分評(píng)估患者神經(jīng)功能。對(duì)患者進(jìn)行全身體檢，明確有無(wú)佝僂病表型。血清生化檢查測(cè)定血清鈣、磷、堿性磷酸酶水平。

2 結(jié)果

2.1 WES結(jié)果

選擇GWAS 研究得到的基因（HAO1、RSPO2、EIF3E、EMC2、CCDC91、EIF3H、CDC5L、SUPT3H）[4]及連鎖分析和病例-對(duì)照相關(guān)性研究得到的基因（TLR5、RXRB、COL11A2、RUNX2、IL1B、ENPP1、ESR1、IL15RA、BMP9、VDR、BMP4、TGFB3、TGFB1、BMP2、COL6A1）[5]作為OPLL相關(guān)基因。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，在2 例OPLL 患者中發(fā)現(xiàn)了ENPP1基因變異。其中，在患者1 中發(fā)現(xiàn)了ENPP1基因的1 個(gè)雜合錯(cuò)義變異c.T802C（p.Tyr268His），在患者2中發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)ENPP1基因的雜合錯(cuò)義變異c.T253C（p.Cys85Arg）和c.T802C（p.Tyr268His），其中ENPP1c.T802C（p.Tyr268His）在2 例患者中均被發(fā)現(xiàn)。患者1和患者2均未發(fā)現(xiàn)其他OPLL相關(guān)基因的罕見(jiàn)變異。

圖1 ENPP1基因變異位點(diǎn)保守性分析

2.2 變異致病性分析

ENPP1錯(cuò)義變異c.T253C（p.Cys85Arg）在4 個(gè)人群數(shù)據(jù)庫(kù)（千人基因組、dbSNP、gnomAD、ExAC）中均未被收錄。3 個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM、ClinVar、HGMD）均未收錄該變異。多種蛋白預(yù)測(cè)軟件SIFT、Polyphen-2、Mutation Taster 均預(yù)測(cè)該變異有害或可能有害，CADD評(píng)分為25.9分。

ENPP1錯(cuò)義變異c.T802C（p.Tyr268His）在千人基因組頻率為0.000 2，gnomAD 數(shù)據(jù)庫(kù)人群頻率為8.57×10-5，ExAC 數(shù)據(jù)庫(kù)人群頻率為7.9×10-5，dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)收錄該變異（rs17847050）。OMIM、ClinVar、HGMD 數(shù)據(jù)庫(kù)均未收錄該變異。多種蛋白預(yù)測(cè)軟件SIFT、Polyphen-2、Mutation Taster 均預(yù)測(cè)該變異有害，CADD評(píng)分為25.6分。

ENPP1基因c.T253C（p.Cys85Arg）和c.T802C（p.Tyr268His）變異位點(diǎn)在不同物種中均具有高度保守性（圖1）。

ENPP1基因在結(jié)構(gòu)上分為N-末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、串聯(lián)生長(zhǎng)介素B 樣結(jié)構(gòu)域1、串聯(lián)生長(zhǎng)介素B 樣結(jié)構(gòu)域2、磷酸二酯酶催化結(jié)構(gòu)域、L1接頭、L2接頭、C-末端核酸酶樣結(jié)構(gòu)域[14]。ENPP1c.T253C（p.Cys85Arg）位于跨膜結(jié)構(gòu)域，c.T802C（p.Tyr268His）位于磷酸二酯酶催化結(jié)構(gòu)域（圖2）。利用UCSF chimera 軟件分析ENPP1 蛋白三維結(jié)構(gòu)（PDB ID：6WFJ），評(píng)估氫鍵形成及氨基酸之間的距離，發(fā)現(xiàn)268 位的酪氨酸（Tyr268）殘基可以與His500、Glu565、Arg888、Asp891 之間形成極性相互作用。賴(lài)氨酸殘基轉(zhuǎn)化為組氨酸（His268）使其與His500、Glu565、Arg888、Asp891 的極性相互作用消失，與Glu270之間形成新的極性相互作用（圖3）。

圖2 OPLL蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖

圖3 ENPP1蛋白三維結(jié)構(gòu)示意圖

圖4 患者1影像學(xué)表現(xiàn)

圖5 患者2影像學(xué)表現(xiàn)

2.3 2例ENPP1基因變異患者臨床表型與實(shí)驗(yàn)室檢查

患者1表現(xiàn)為頸椎OPLL、胸椎OPLL、胸椎黃韌帶骨化癥（圖4），頸椎OPLL分型為節(jié)段型（C3～C7），無(wú)身材矮小和佝僂病表型，身高181 cm，血清鈣、磷和堿性磷酸酶水平正常，分別為2.23 mmol/L、0.98 mmol/L、61 U/L，頸椎JOA 評(píng)分8 分。患者無(wú)高血壓、糖尿病（表1）。

表1 OPLL患者臨床表型分析

患者2 表現(xiàn)為頸椎OPLL、胸椎OPLL、胸椎黃韌帶骨化癥（圖5），OPLL分型為混合型（連續(xù)型C2～C5，局灶型C6、C7，連續(xù)型C7～T2），無(wú)身材矮小和佝僂病表型，身高170 cm，血清鈣水平正常，為2.35 mmol/L，血清磷水平在正常低限，為0.86 mmol/L，血清堿性磷酸酶水平升高，為160 U/L。頸椎JOA評(píng)分2.5分。患者伴有2型糖尿病和高血壓（表1）。

3 討論

OPLL 的發(fā)病與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。一項(xiàng)GWAS 研究表明多個(gè)促進(jìn)骨化的基因如HAO1、RSPO2和CCDC91等與OPLL 發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[4]。另外，連鎖分析和病例-對(duì)照相關(guān)性研究也發(fā)現(xiàn)了一些與OPLL 相關(guān)的基因/基因座，包括編碼核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1 的基因（ENPP1）、編碼細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的基因（COL11A2、COL6A1）、編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白的基因（BMP2、BMP4、BMP9），以及編碼TGF-β 信號(hào)通路蛋白的基因（TGFB1、TGFB3）等[5]。陳振等[3]對(duì)家族性O(shè)PLL 的研究發(fā)現(xiàn)，家族性O(shè)PLL在同輩中的發(fā)生率為50.0%（13/26），符合常染色體顯性單基因遺傳病在患者同胞中的發(fā)病率，表明一部分OPLL的發(fā)病可能是由單個(gè)基因變異引起。

ENPP1基因編碼核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1），定位于染色體6q23.2 上，由編碼925 個(gè)氨基酸的25個(gè)外顯子組成。ENPP1 是一種膜結(jié)合糖蛋白，通過(guò)水解細(xì)胞外三磷酸核苷酸（nucleotide triphosphates,NTP）產(chǎn)生無(wú)機(jī)焦磷酸（pyrophosphate, PPi）。正常水平的PPi 可以防止軟組織和血管鈣化[15]，ENPP1 功能障礙導(dǎo)致PPi 產(chǎn)生減少，從而導(dǎo)致異位鈣化的發(fā)生。具有Enpp1基因p.Gly568X 純合變異的ttw小鼠表現(xiàn)出脊柱韌帶的異位骨化，這種表型類(lèi)似于人類(lèi)OPLL[6]。然而，ENPP1基因變異導(dǎo)致OPLL 的報(bào)道較為少見(jiàn)[8-9,16-17]。

本研究通過(guò)WES 和生物信息學(xué)分析，在2 例OPLL 患者中發(fā)現(xiàn)了ENPP1基因的2 個(gè)錯(cuò)義變異，其中患者1 攜帶c.T802C（p.Tyr268His）雜合變異，患者2 攜帶c.T253C（p.Cys85Arg）雜合變異和c.T802C（p.Tyr268His）雜合變異。由于沒(méi)有患者父母的血液樣本，無(wú)法驗(yàn)證患者2中發(fā)現(xiàn)的2個(gè)ENPP1變異是否為復(fù)合雜合變異。c.T253C（p.Cys85Arg）和c.T802C（p.Tyr268His）變異位點(diǎn)在不同物種中均具有高度保守性，多種蛋白預(yù)測(cè)軟件均預(yù)測(cè)變異有害和可能有害。

2 例患者均攜帶的變異c.T802C（p.Tyr268His）位于磷酸二酯酶催化結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)ENPP1催化活性的結(jié)構(gòu)域[18]。ENPP1 包括8 個(gè)結(jié)構(gòu)域，目前已報(bào)道的140 個(gè)ENPP1基因變異大多數(shù)集中在磷酸二酯酶催化結(jié)構(gòu)域和核酸酶樣結(jié)構(gòu)域，分別占所有變異的49.3%和27.1%[19]。蛋白三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該變異可能影響其與周?chē)被嶂g的極性相互作用，從而影響酶活性，導(dǎo)致OPLL 的發(fā)生。Ferreira等[8]曾報(bào)道1 例患者攜帶c.T802C（p.Tyr268His）相同位置不同氨基酸改變c.803A＞G（p.Tyr268Cys）。該患者攜帶ENPP1c.803A＞G（p.Tyr268Cys）和c.2596G＞A（p.Glu866Lys）的復(fù)合雜合變異，出現(xiàn)了全身性嬰兒動(dòng)脈鈣化、低磷血癥性佝僂病和OPLL（C2～C3 和C3～C4），并伴有腎病、糖尿病、高血壓和高脂血癥。這些發(fā)現(xiàn)支持ENPP1c.T802C（p.Tyr268His）可能是2例患者出現(xiàn)椎旁韌帶骨化癥的原因。ENPP1c.T802C（p.Tyr268His）在gnomAD 和ExAC 數(shù)據(jù)庫(kù)的頻率分別為8.57×10-5和7.9×10-5，然而在gnomAD 東亞人群和ExAC 東亞人群數(shù)據(jù)庫(kù)的頻率分別為0.001 和0.000 7，通過(guò)查詢(xún)中國(guó)人群全基因測(cè)序“女?huà)z”數(shù)據(jù)資源[20]，發(fā)現(xiàn)ENPP1c.T802C（p.Tyr268His）在中國(guó)人群中的頻率為0.001 8（11/5 998），顯著高于其他人種，說(shuō)明該變異有可能是中國(guó)人群OPLL高發(fā)的原因之一。

除了c.T802C（p.Tyr268His），本研究還發(fā)現(xiàn)患者2攜帶ENPP1的另一個(gè)雜合變異 c.T253C（p.Cys85Arg）。c.T253C（p.Cys85Arg）位于跨膜結(jié)構(gòu)域。目前僅有c.241G＞T（p.Val81Leu）、c.272T＞C（p.Leu91Pro）和c.275G＞A（p.Gly92Asp）這3個(gè)錯(cuò)義變異被報(bào)道位于跨膜結(jié)構(gòu)域[19]。其中c.241G＞T（p.Val81Leu）純合變異可導(dǎo)致全身性嬰兒動(dòng)脈鈣化，而患者攜帶雜合變異的父母未發(fā)病。功能研究發(fā)現(xiàn)ENPP1 c.241G＞T可引起異常剪接，導(dǎo)致2號(hào)外顯子跳躍[21]。然而ENPP1c.T253C（p.Cys85Arg）通過(guò)何種機(jī)制致病仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

ENPP1基因純合或復(fù)合雜合變異可導(dǎo)致全身性嬰兒動(dòng)脈鈣化和低磷血癥性佝僂病。全身性嬰兒動(dòng)脈硬化表現(xiàn)為大中型動(dòng)脈的內(nèi)彈性層鈣化和狹窄，嚴(yán)重時(shí)與心血管衰竭和早期死亡相關(guān)，在胚胎時(shí)期或出生6個(gè)月內(nèi)死亡率約為55%，血管外鈣化也常見(jiàn)于幸存者的關(guān)節(jié)、脊柱和內(nèi)臟組織[22]。低磷血癥性佝僂病表現(xiàn)為身材矮小、骨骼畸形、低磷酸鹽血癥、堿性磷酸酶水平升高和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（fibroblast growth factor 23, FGF23）水平升高或正常高限[23]。此外，ENPP1基因變異可導(dǎo)致Cole病（OMIM：#615522），呈常染色體顯性遺傳。導(dǎo)致Cole 病的大部分變異都影響編碼蛋白中串聯(lián)生長(zhǎng)介素B 樣結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基[19]。Cole 病臨床表現(xiàn)為先天性或早發(fā)性點(diǎn)狀角化，伴有不規(guī)則形狀的色素沉著斑，通常見(jiàn)于手臂和腿部，但不見(jiàn)于軀干或肢端區(qū)域。

Kotwal等[24]報(bào)道了幾例單等位基因ENPP1缺陷患者，均未出現(xiàn)低磷血癥性佝僂病或全身性嬰兒動(dòng)脈鈣化的臨床癥狀，但確實(shí)表現(xiàn)出低鈣血癥或低磷血癥，表明ENPP1缺陷可能誘導(dǎo)基因劑量效應(yīng)影響鈣和磷酸鹽的穩(wěn)態(tài)。Kato等[9]也發(fā)現(xiàn)具有單等位基因ENPP1變異的患者出現(xiàn)ENPP1單倍劑量不足，導(dǎo)致血漿PPi降低，可能是患者出現(xiàn)進(jìn)行性椎旁韌帶骨化癥的危險(xiǎn)因素。

本研究對(duì)發(fā)生ENPP1基因變異的2例OPLL患者進(jìn)行臨床表型分析，2 例患者均未發(fā)生全身性嬰兒動(dòng)脈鈣化，沒(méi)有身材矮小和佝僂病表型，也未發(fā)現(xiàn)點(diǎn)狀角化和色素沉著斑等Cole病的表現(xiàn)。患者1血清生化檢查發(fā)現(xiàn)鈣、磷和堿性磷酸酶水平正常，但在C3～C7發(fā)生了節(jié)段型OPLL，胸椎后縱韌帶和黃韌帶均有骨化。患者2血清鈣水平正常，但血清磷水平在正常低限（0.86 mmol/L），血清堿性磷酸酶水平高于正常值（160 U/L）。患者2發(fā)生了C2～C5連續(xù)型、C6及C7局灶型、C7～T2 連續(xù)型OPLL 及胸椎黃韌帶骨化癥。與患者1相比較，患者2脊髓壓迫程度較重，術(shù)前JOA評(píng)分僅2.5分。由于患者2攜帶2個(gè)ENPP1變異，患者1僅攜帶1個(gè)ENPP1變異，推測(cè)可能是由于變異誘導(dǎo)的劑量效應(yīng)導(dǎo)致了2例患者臨床表型的差異。

通過(guò)基因型-臨床表型分析，本研究發(fā)現(xiàn)ENPP1基因變異造成的OPLL骨化范圍廣泛、椎管侵占率高、脊髓壓迫程度重，造成手術(shù)范圍廣、難度大。ENPP1基因變異的患者可伴有其他方面的異常，如低磷血癥、血清堿性磷酸酶水平升高等，因此，在臨床上遇到低磷血癥、血清堿性磷酸酶水平異常的患者，應(yīng)考慮進(jìn)行ENPP1基因分析以明確診斷。在臨床前研究中，ENPP1 酶替代療法已顯示出將PPi恢復(fù)到正常水平的潛力，從而預(yù)防與ENPP1缺乏相關(guān)的并發(fā)癥。據(jù)報(bào)道，重組ENPP1-Fc 蛋白治療Enpp1缺陷小鼠可防止異位鈣化的發(fā)生[25-26]。ENPP1酶替代療法有望對(duì)攜帶ENPP1基因變異的患者進(jìn)行治療，減緩骨化發(fā)展。

本研究的局限性：①未對(duì)發(fā)現(xiàn)ENPP1基因變異的OPLL患者進(jìn)行PPi水平檢測(cè)以明確基因變異是否導(dǎo)致PPi水平降低；②在進(jìn)行WES 的93例患者中，存在各種不同分型的OPLL 病例，由于僅發(fā)現(xiàn)2 例ENPP1基因變異患者，本研究并未對(duì)ENPP1基因變異患者與其他患者進(jìn)行臨床表型比較。在今后的研究中擬擴(kuò)大樣本量，以闡明不同基因變異對(duì)OPLL 臨床表型和OPLL分型的影響。

4 結(jié)論

ENPP1基因c.T802C（p.Tyr268His）和c.T253C（p.Cys85Arg）變異可能是OPLL患者的致病原因，豐富了ENPP1基因變異譜，為今后OPLL患者應(yīng)用目前臨床開(kāi)發(fā)中的ENPP1酶替代療法提供了分子診斷依據(jù)。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突