體外不同條件誘導L02 肝細胞損傷模型的構建

姜曉杰，潘金明，琚立萍，張晶，孫晶晶，莊思靜，席建軍，莊讓笑

肝臟作為機體最重要的腺體，在機體新陳代謝、排毒以及膽汁的生成和排泄等方面起到至關重要的作用，肝臟容易受到如酒精、病毒、藥物等多種外在因素的攻擊而受到損傷，從而影響機體的健康[1-2]。臨床常見肝損傷由于病因不同，常分為病毒性肝損傷、自身免疫性肝損傷、藥物性、酒精性及化學性肝損傷等。而在多種肝臟疾病的肝細胞損傷中，氧化應激是他們的共同損傷機制，在肝損傷的發病過程中起到重要的作用[3]。

目前，藥物性肝損傷模型常用的誘導劑主要有四氯化碳（CCl4）、對乙酰氨基酚（APAP）等，兩種誘導劑在過量的情況下均能夠對肝臟產生損傷，APAP更能模擬人類因服用過量藥物而導致的肝損傷；而氧化性肝損傷常用的誘導劑為過氧化氫（H2O2），由于H2O2在體內釋放大量的氧自由基破壞體內的氧化系統從而導致肝損傷，不同濃度的H2O2產生的肝損傷程度也較大。雖然建立各類肝損傷體內外模型較多，但缺乏統一的建模標準。合理的模型是研究肝損傷發生發展機制以及藥物篩選的基石，因此，本研究通過體外培養L02 人肝細胞，分別以不同濃度的過氧化氫（H2O2）、對乙酰氨基酚（APAP）和酒精誘導不同時間L02 人肝細胞后，觀察L02 肝細胞的細胞存活率，摸索最佳的肝細胞損傷條件，建立穩定、可靠的L02 體外肝細胞損傷模型，為后續相關機制研究、保肝藥物的體外活性篩選等提供實驗基礎和依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人正常L02 肝細胞（上海睿智化學研究有限公司），DMSO（Sigma，批號52396AK），RPMI-1640 培養基（Invitrogen，批號1234-12），胎牛血清（FBS，BIOSERA，批號030813），BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所，批號LF146255），細胞計數試劑盒（CCK-8，江蘇碧云天生物技術研究所，批號101416170109），丙二醛（MDA）檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所，批號041916160630），超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所，批號051216160706），丙氨酸氨基轉移酶（ALT）檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所，批號071315160811），天冬氨酸氨基轉移酶（AST）檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所，批號091512160930），H2O2（Sigma，批號 52396AK），APAP（梯希愛化成工業發展有限公司，批號103-90-2），乙醇（北京百靈威科技有限公司，批號1610-5）。CO2細胞培養箱（美國Thermo 公司），酶標儀（美國Thermo 公司），低溫離心機（德國Eppendorf 公司），超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設備公司），分析天平（德國Sartorius 公司），96 孔板（美國Corning 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 L02細胞復蘇后，用含10%FBS 的RPMI-1640 培養液轉移至培養皿中，37 ℃、5% CO2條件下培養，每2 ～3 天換液1 次，取對數生長期的細胞用于實驗，將L02 細胞隨機分為正常對照組和實驗組（H2O2組、APAP 組和乙醇組）。

1.2.2 不同條件誘導L02細胞損傷細胞存活率的檢測

1.2.2.1 H2O2誘導L02 肝細胞損傷細胞存活率的檢測 取對數生長期的L02 細胞，按2.5×105/ml 接種于96 孔板，每孔100l，接種12 h細胞完全貼壁后，正常組加入無FBS 的培養基，H2O2組分別加入不同濃度梯度（300、400、500 和600mol/L）的H2O2且無FBS 的RPMI-1640 培養液，37 ℃、5%CO2條件下分別孵育6、12 和16 h，用CCK-8 檢測L02 細胞的存活率，設定正常對照組的細胞存活率為100%，計算細胞存活率，每個濃度設6 個復孔，取平均值。

1.2.2.2 APAP 誘導L02 肝細胞損傷細胞存活率的檢測 取對數生長期的L02 細胞，按2.5×105/ml 接種于96 孔板，每孔100l，接種12 h 細胞完全貼壁后，正常組加入無FBS 的培養液，APAP 組分別以不同濃度梯度（1、10、20 和40 mmol/L）的APAP 誘導L02 細胞，在37℃、5%CO2條件下分別培養3 和6 h后，用CCK-8 檢測L02 細胞的存活率，設定正常對照組的細胞存活率為100%，每組設6 個復孔，取平均值。

1.2.2.3 乙醇誘導L02 肝細胞損傷細胞存活率的檢測 取對數增長期的L02 細胞按2.5×105/ml 接種于96 孔板，每孔100l，接種12 h 后細胞完全貼壁后，正常組加入無FBS 的培養液，乙醇組分別加入不同濃度梯度（0.5%、1%、1.5%和2%）的乙醇，在37℃、5%CO2條件下孵育6 和24 h，用CCK-8 檢測L02 細胞的存活率，設定正常對照組的細胞存活率為100%，CCK-8 細胞活性檢測按照說明書使用，應用酶標儀在450 nm 處檢測吸光度（A450），計算細胞存活率，每個濃度設6 個復孔，取平均值。

1.2.3 體外不同條件作用L02 肝細胞損傷模型的建立 取對數生長期的L02 細胞，按2.5×105/ml 接種于96 孔板，每孔100l，接種12 h細胞完全貼壁后，正常組加入無FBS 的培養基，H2O2損傷組用300mol/L 的H2O2誘導6 h，APAP 損傷組用40 mmol/L的APAP作用3h，乙醇損傷組用1.5%的乙醇作用6h，37 ℃、5%CO2條件下培養，用CCK-8 檢測各組L02細胞的存活率；嚴格按照試劑盒說明書操作，檢測各組細胞培養上清中ALT、AST、MDA 含量和SOD 活性，每個濃度設6 個復孔，取平均值。

1.3 統計方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計處理，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的H2O2誘導不同時間L02 肝細胞存活率的比較 經過不同濃度的H2O2誘導L02 肝細胞不同時間后，L02 肝細胞存活率有不同程度的降低，見圖1。與正常對照組比較，300mol/L 的H2O2誘導12 h后，L02肝細胞存活率無明顯變化（P＞0.05），其余各組細胞在不同濃度的H2O2誘導不同時間后差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；在相同誘導時間下，隨著H2O2濃度增加，L02肝細胞存活率顯著下降；而相同濃度的H2O2隨著誘導時間的延長，L02 細胞存活率有增加的趨勢?？紤]到試驗時間的可操作性及細胞的承受能力，采用300mol/L 的H2O2誘導6h為氧化性肝細胞損傷建模的最佳條件。

圖1 不同濃度H2O2 誘導不同時間L02 肝細胞存活率比較

2.2 不同APAP 濃度誘導不同時間L02 肝細胞存活率的比較 不同濃度APAP分別誘導L02 肝細胞損傷3 和6 h 后，L02 細胞存活率逐漸降低，見圖2。在相同濃度的APAP 誘導L02 細胞時，隨著造模時間的延長，L02 肝細胞的存活率逐漸下降，與正常對照組比較，40 mmol/L 的APAP 作用3 和6 h 后，肝細胞存活率分別降至33%和72%左右，差異均統計學意義（均P ＜0.05）；20 mmol/L 的APAP 作用6 h時，細胞存活率降至39%左右，差異有統計學意義（P＜0.05），其余各組差異均無統計學意義（均P ＞0.05）。采用40 mmol/L 的APAP 誘導L02 肝細胞3h為藥物性肝損傷模型的最佳誘導條件。

圖2 不同濃度APAP 誘導不同時間L02 肝細胞存活率比較

2.3 不同乙醇濃度作用不同時間L02 肝細胞存活率的比較 當用不同濃度乙醇誘導24 h 時，可能由于實驗操作以及誘導24 h時已超出細胞的承受能力等因素，導致L02 肝細胞大量壞死，導致參與統計的細胞組數不夠，差異無統計學意義，因此不同濃度乙醇誘導24 h 組的數據不納入統計計算。當乙醇濃度為1.5%和2%誘導6 h 時，細胞存活率顯著下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3。采用1.5%的乙醇誘導L02 肝細胞6 h 為酒精性肝損傷模型的最佳建模條件。

圖3 不同乙醇濃度誘導6 h 后L02 肝細胞損傷的細胞存活率比較

2.4 體外L02 肝細胞損傷模型各組細胞存活率比較 H2O2模型組、APAP 模型組和乙醇模型組的細胞存活率均低于正常對照組（均P ＜0.05），見圖4。

圖4 不同條件誘導L02 肝細胞損傷的細胞存活率比較

2.5 體外L02 肝細胞損傷模型ALT、AST、MDA 和SOD 指標比較 H2O2模型組、APAP 模型組和乙醇模型組的ALT、AST、MDA 含量均高于正常對照組（均P ＜0.05），而SOD 活性均低于正常對照組（均P＜0.05），見表1。

表1 各組細胞ALT、AST、MDA 含量和SOD 活性結果

3 討論

肝細胞損傷是由各種因素引起的多種肝臟疾病的共同病變基礎和表現，而內源性活性氧（ROS）引發的氧化應激是肝損傷最重要的發病機制[4]。正常情況下，機體內抗氧化系統能夠維持細胞內氧自由基的代謝平衡，但當肝細胞受到大量氧自由基的攻擊，機體氧化平衡系統被打破，造成細胞膜和細胞結構的破壞，導致肝細胞腫脹壞死，進一步使細胞內清除自由基酶的活性下降，使肝細胞損傷進一步加重[5-6]。

氧化性肝損傷主要是一些藥物及活性氧在肝臟內生成大量的ROS 引起組織內氧化-還原失衡，從而影響到肝臟內的抗氧化酶系統，使肝細胞功能發生紊亂，肝組織破壞而導致的一類肝損傷；而藥物性肝損傷是藥物在使用過程中，因藥物本身或/及其代謝產物或由于特殊體質對藥物的超敏感性或耐受性降低所導致的肝臟損，藥物性肝損傷常常是藥物研發失敗、上市后被撤市或限制使用的主要原因之一；酒精性肝損傷即酒精性肝病是一種進行性發展嚴重影響身體健康的疾病，而且在世界范圍內酒精性肝病的發病率呈逐年上升趨勢。因此，建立合適的體內外肝損傷模型，對于深入研究肝損傷的發病機制、藥物篩選等具有重要的研究意義。

H2O2是一種重要的活性氧，能夠穿透細胞膜使細胞內氧自由基增加，而且極易通過細胞膜與細胞內鐵離子反應形成高活性羥基損傷肝細胞[7-8]；長期或過量服用APAP后，其代謝產物N-乙酰-對苯醌亞氨將肝細胞中的谷胱甘肽耗竭，進一步與線粒體和脂質膜中蛋白質共價結合，破壞線粒體功能而產生超氧陰離子、H2O2等活性氧[9-10]；乙醇能夠激活細胞色素P450 活性，導致機體氧化應激的發生，產生ROS，在胞內酶作用下，生成大量超氧陰離子、羥基等自由基[11-13]。

本研究分別用不同濃度的H2O2、APAP 和乙醇作為誘導劑，分別作用L02 人肝細胞不同時間后，采用CCK-8 檢測L02 肝細胞的存活率，結果發現，不同條件誘導的L02 肝細胞損傷細胞存活率降低，與正常對照組比較，用300mol/L H2O2誘導6 h、40 mmol/L APAP 作用3 h 和1.5%的乙醇作用6 h 處理的L02 肝細胞存活率差異均有統計學意義（均P ＜0.05），可作為H2O2、APAP和乙醇誘導L02 肝細胞損傷的最佳條件。通過體外L02 肝細胞損傷模型的建立，對所建立的L02 肝細胞損傷條件進行驗證，結果發現，H2O2模型組、APAP 模型組和乙醇模型組細胞存活率均低于正常對照組（均P＜0.05），ALT、AST、MDA 含量高于正常對照組，而SOD 活性低于正常對照組（均P ＜0.05），這提示采用300mol/L H2O2誘導6 h、40 mmol/L APAP 作用3 h 和1.5%的乙醇作用6 h 的L02 肝細胞，可作為不同肝細胞損傷模型的最佳誘導條件。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 姜曉杰：論文撰寫；潘金明、琚立萍、張晶：細胞培養及模型建立；孫晶晶、莊思靜：數據整理、統計學分析；席建軍、莊讓笑：論文修改及審核