有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)精神分裂癥大鼠認(rèn)知功能的改善作用及機(jī)制探究

葉樂，李穎芳，李陽(yáng)

精神分裂癥（schizophrenia，SCZ）是以腦組織認(rèn)知功能損傷為主要特征的一種嚴(yán)重的精神病，具有較高的發(fā)病率及致殘率，但其病因和發(fā)病機(jī)制還不明確。近來研究發(fā)現(xiàn)，微生物-腸-腦軸在SCZ 中的作用，越來越受到研究者的重視[1]。有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)腸道微生物群具有有益影響，且其可改善SCZ患者及阿爾茨海默癥小鼠認(rèn)知功能，促進(jìn)大腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)[2-3]。核轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)因子2（Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）通路激活，可誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1（HO-1）產(chǎn)生來發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。研究證實(shí)Nrf2/ARE/HO-1 抗氧化途徑不僅在緩解神經(jīng)元損傷、改善認(rèn)知功能障礙中發(fā)揮作用[4]，還在腸屏障損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[5]。本研究建立大鼠SCZ模型，以期闡明SCZ 發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制，并為有氧運(yùn)動(dòng)在SCZ 領(lǐng)域的治療提供新的思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康SD 雄性大鼠82 只，7～8 周齡，200 ～220 g，大鼠自由飲水喂食，飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中，溫度20 ～26 ℃。所有大鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK （京） 2019-0011，合格證號(hào)：1103012 111038179 。本研究獲得麗水市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)20220302-02），符合3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器 地卓西平馬來酸鹽（MK-801）（M15913，上海珞琺生化科技有限公司）；Nrf2-ARE通路抑制劑-全反式維甲酸（ATRA）（上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素-脂多糖（LPS）試劑盒（CS-10802E，上海莼試生物技術(shù)有限公司），神經(jīng)遞質(zhì)-5-羥色胺（5-HT）試劑盒（IB-E11975，江西艾博因生物科技有限公司），多巴胺（DA）試劑盒（YT30237，上海韻泰信息科技有限公司），白細(xì)胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（HL20064，上海哈靈生物科技有限公司），白細(xì)胞介素-1（IL-1 ）ELISA 試劑盒（SEKR-0002，北京索萊寶科技有限公司），D-乳酸（D-Lac）試劑盒（KL15282，上海康朗生物科技有限公司），HE 染色試劑盒（HGR6210，青島捷世康生物科技有限公司），尼氏染色試劑盒和TUNEL 染色試劑盒（YT8907、YT2205，北京伊塔生物科技有限公司），咬合蛋白（occludin）、帶狀閉合蛋白ZO 家族1（ZO-1）、Nrf2、HO-1、超氧化物歧化酶-2（SOD2）、白細(xì)胞介素-1（IL-1 ）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等抗體（ab216327、ab221547、ab31163、ab52947、ab68155、ab254360、ab192271，美國(guó)abcam 公司）。

1.3 分組及處理 隨機(jī)取62 只大鼠建立SCZ 模型，將造模成功的60 只大鼠，隨機(jī)分為模型組、有氧運(yùn)動(dòng)組、有氧運(yùn)動(dòng)+ATRA 組，每組20 只。另取20只大鼠，作為對(duì)照組。

造模大鼠腹腔注射地卓西平馬來酸鹽（MK-801）0.5 mg·kg1·d1，連續(xù)14 d，建立SCZ 模型。采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)方法記錄大鼠自主活動(dòng)及排便狀況，若大鼠在遠(yuǎn)離場(chǎng)壁的暴露中心區(qū)域活動(dòng)增加，且排便減少，視為大鼠出現(xiàn)探索行為減少，抑郁樣行為增加等SCZ 癥狀，認(rèn)為造模成功，共60 只大鼠造模成功。

大鼠造模成功后，有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠每天固定時(shí)間在中等強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練，每次20 min，連續(xù)進(jìn)行6周，每周休息1 d，大鼠運(yùn)動(dòng)后還需腹腔注射相應(yīng)劑量0.9%氯化鈉注射液。有氧運(yùn)動(dòng)+ATRA 組大鼠有氧運(yùn)動(dòng)后腹腔注射相應(yīng)劑量的Nrf2-ARE 通路阻斷劑40 mg/kg，1 次/d。模型組及對(duì)照組大鼠腹腔注射給予等量0.9%氯化鈉注射液。各組連續(xù)干預(yù)6 周后，收集大鼠最后1 d 糞便，并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 行為學(xué)及認(rèn)知功能 糞便檢測(cè)后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：將大鼠分別放置在陌生平臺(tái)區(qū)域（100 cm×100 cm×100 cm），自由探索6 min，用自動(dòng)視頻跟蹤系統(tǒng)記錄大鼠在5 min 于平臺(tái)中心區(qū)域（平臺(tái)內(nèi)表面積的25%）和外圍區(qū)域（中心外部）的自發(fā)活動(dòng)距離。水迷宮試驗(yàn)探究其認(rèn)知功能：將大鼠置于圓形水池（直徑160 cm，高50 cm，水深25 cm），水溫及室溫（24±1）℃，水池分4 個(gè)象限，第1 象限據(jù)池壁35 cm設(shè)置直徑12 cm、高22 cm，距水下3 cm 的圓形黑色逃生平臺(tái)，將大鼠放置第3 象限內(nèi)，用SMART 數(shù)字跟蹤系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期，記錄大鼠在60 s 內(nèi)穿越原平臺(tái)象限次數(shù)。

1.4.2 腦海馬組織神經(jīng)元 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，隨機(jī)取6 只大鼠處死后取小腸組織及海馬組織，分別分成兩部分，一部分置于 80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫硪徊糠种糜?%多聚甲醛溶液中固定24 h 后，脫水、石蠟包埋，切成5m 切片。海馬組織石蠟切片，脫蠟水化后，分別按尼氏及TUNEL染色試劑盒說明書方法進(jìn)行染色，并于光鏡下觀察神經(jīng)元損傷及凋亡狀況。TUNEL 染色切片，用Image-pro plus 軟件測(cè)棕黃色染色細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）數(shù)目，測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.3 血漿LPS、血清炎癥因子及神經(jīng)遞質(zhì)水平取大鼠腹主動(dòng)脈血2 ml，按ELISA 說明書方法檢測(cè)血漿LPS水平；另取大鼠腹主動(dòng)脈血2 ml，按ELISA說明書方法檢測(cè)血清炎癥因子IL-6、IL-1 水平，及神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA 水平。

1.4.4 腸屏障 小腸組織石蠟切片按HE 試劑盒說明書方法染色后，于光鏡下觀察小腸炎癥和腸黏膜厚度變化，以評(píng)估腸道完整性。取相同部位石蠟切片，脫蠟及透化后，加入一抗（occludin、zonula，1∶200）4 ℃孵育24 h，二抗山羊抗兔免疫球蛋白-G（1∶500）室溫孵育1 h，于顯微鏡下拍照觀察，Image J軟件分析腸管腔陽(yáng)性染色情況，以評(píng)估腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)損傷狀況。

1.4.5 腸屏障及血腦屏障通透性 各組大鼠隨機(jī)取5 只，經(jīng)尾靜脈注射2%EB（3 ml/kg），1 h 后將大鼠處死，取腦皮質(zhì)組織，均漿后取勻漿液，在620 nm 波長(zhǎng)下測(cè)EB吸光度值，并計(jì)算EB含量，以評(píng)估血腦屏障通透性。再隨機(jī)取5 只大鼠，取腹主動(dòng)脈血，測(cè)D-Lac水平；將大鼠禁食禁水4 h 后，給予400 mg/kg FITCDextran 灌胃4h 后取血，3500r/min 條件下離心10min后，取血漿25l，在488nm 激發(fā)波長(zhǎng)、525nm 發(fā)射光波長(zhǎng)下，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，并計(jì)算FITC-Dextran 濃度，用D-Lac 及FITC-Dextran 水平，評(píng)估腸道通透性變化。

1.4.6 腸道菌群 處死各組剩余4 只大鼠，于無菌條件下摘取腸系膜淋巴結(jié)及腦組織，稱取相同重量后用無菌0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈，在無菌組織勻漿器中研磨，加入無菌0.9%氯化鈉注射液制成1 ml勻漿液。取100l 勻漿液，接種于麥康凱培養(yǎng)基平板上，在恒溫箱中培養(yǎng)24 h，用哥倫比亞血平板分離培養(yǎng)，用VT2 compact 鑒定，組織勻漿中培養(yǎng)出3 個(gè)或以上腸道菌落即為發(fā)生腸道菌移位，計(jì)數(shù)腸道及腦組織內(nèi)發(fā)生腸道菌移位情況。

1.4.7 小腸及海馬組織Nrf2、HO-1、SOD、IL-1 、IL-10 蛋白表達(dá) 取 80 ℃保存的小腸組織及海馬組織，4℃解凍后，加入細(xì)胞裂解液均漿，蛋白提取試劑盒分別軸提細(xì)胞中總蛋白及細(xì)胞核中總蛋白，用BCA法測(cè)蛋白濃度，取25g蛋白樣品行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入一抗Nrf2（檢測(cè)細(xì)胞核中蛋白）、HO-1、SOD、IL-1 、IL-10 抗體（1∶1 000），內(nèi)參抗體-actin（1∶1 000），4℃下孵育過夜；加入二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，用化學(xué)發(fā)光成像分析儀拍照并分析灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS 24.0 及GraphPad Prism 8行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用方差分析，多重比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組大鼠行為學(xué)及認(rèn)知功能比較 4 組遠(yuǎn)離中心活動(dòng)距離、穿越原平臺(tái)象限次數(shù)、逃避潛伏期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F≥102.321，均P ＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組大鼠在曠場(chǎng)中心區(qū)域活動(dòng)增多，遠(yuǎn)離中心活動(dòng)距離、穿越原平臺(tái)象限次數(shù)降低（q≥20.759，均P ＜0.05），逃避潛伏期延長(zhǎng)（q=29.269，P＜0.05）；與模型組相比，有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠在曠場(chǎng)中心區(qū)域活動(dòng)較少，遠(yuǎn)離中心活動(dòng)距離、穿越原平臺(tái)象限次數(shù)增加（q≥7.379，均P ＜0.05），逃避潛伏期縮短（q=17.806，P＜0.05）；與有氧運(yùn)動(dòng)組相比，有氧運(yùn)動(dòng)+ATRA組大鼠在曠場(chǎng)中心區(qū)域活動(dòng)增加，遠(yuǎn)離中心活動(dòng)距離、穿越原平臺(tái)象限次數(shù)降低（q≥8.675，均P ＜0.05），逃避潛伏期延長(zhǎng)（q=19.576，P ＜0.05），見圖1。

圖1 4 組大鼠行為學(xué)及認(rèn)知功能比較

2.2 4 組大鼠海馬神經(jīng)元損傷及凋亡情況比較 尼氏染色可見，對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，模型組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，胞核濃縮且深染，神經(jīng)元丟失和壞死嚴(yán)重；TUNEL染色可見模型組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞染色加深，凋亡嚴(yán)重。4 組海馬神經(jīng)元凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=340.707，P ＜0.05）。與模型組相比，有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠凋亡率降低（q=19.373，P ＜0.05）；與有氧運(yùn)動(dòng)組相比，有氧運(yùn)動(dòng)+ATRA組大鼠凋亡率增加（q=18.075，P＜0.05），見圖2。

2.3 4 組大鼠血漿LPS、血清炎癥因子及神經(jīng)遞質(zhì)比較 4 組LPS、DA、5-HT、IL-6、IL-1 水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F≥39.976，均P ＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組LPS、DA、5-HT、IL-6、IL-1 水平均升高（q≥11.853，均P ＜0.05）；與模型組相比，有氧運(yùn)動(dòng)組均降低（q≥8.768，均P ＜0.05）；與有氧運(yùn)動(dòng)組相比，有氧運(yùn)動(dòng)+ATRA 組均升高（q≥9. 218，均P ＜0.05），見圖3。

圖3 4 組大鼠LPS、DA、5-HT、IL-6、IL-1 水平比較

2.4 4 組大鼠腸屏障損傷情況比較 對(duì)照組大鼠腸組織結(jié)構(gòu)正常，腸道緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1 及occludin蛋白可在細(xì)胞膜外及胞質(zhì)內(nèi)呈強(qiáng)陽(yáng)性（棕黃色顆粒沿膜連續(xù)分布）表達(dá)；模型組大鼠可見腸絨毛萎縮、水腫及變形、腸隱窩加深及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷嚴(yán)重，腸道棕黃色顆粒染色變淺且分布不連續(xù)，ZO-1 及occludin 呈弱陽(yáng)性表達(dá)。4 組ZO-1、occludin陽(yáng)性表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F≥209.570，均P ＜0.05）。與模型組相比，有氧運(yùn)動(dòng)組ZO-1 及occludin陽(yáng)性表達(dá)升高（q≥12.318，均P ＜0.05）；與有氧運(yùn)動(dòng)組相比，有氧運(yùn)動(dòng)+ATRA 組ZO-1 及occludin 陽(yáng)性減弱（q≥11.438，均P ＜0.05），見圖4。

圖4 4 組大鼠腸屏障損傷情況比較

2.5 4 組大鼠腸通透性及血腦屏障通透性比較 4組FITC-Dextran、D-Lac 及EB 水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F≥27.954，均P ＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組血漿FITC-Dextran 濃度及D-Lac 水平、腦組織EB 水平均升高（q≥11.083，均P ＜0.05）；與模型組相比，有氧運(yùn)動(dòng)組均降低（q≥6.130，均P ＜0.05）；與有氧運(yùn)動(dòng)組相比，有氧運(yùn)動(dòng)+ATRA 組均升高（q≥5.836，均P ＜0.05），見圖5。

圖5 4 組大鼠FITC-Dextran、D-Lac 及EB 水平比較

2.6 4 組大鼠腸、腦組織器官菌群移位比較 4 組腸道細(xì)菌在腸和腦組織中移位陽(yáng)性個(gè)數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F≥191.852，均P ＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組腸道細(xì)菌在腸和腦組織中移位陽(yáng)性個(gè)數(shù)升高（q≥27.530，均P ＜0.05）；與模型組相比，有氧運(yùn)動(dòng)組移位陽(yáng)性個(gè)數(shù)降低（q≥17.889，均P ＜0.05）；與有氧運(yùn)動(dòng)組相比，有氧運(yùn)動(dòng)+ATRA組移位陽(yáng)性個(gè)數(shù)升高（q≥14.907，均P ＜0.05），見圖6。

圖6 4 組大鼠腸道細(xì)菌移位陽(yáng)性個(gè)數(shù)比較

2.7 大鼠小腸、海馬組織中Nrf2/ARE/HO-1 通路蛋白及SOD、IL-1 、IL-10 蛋白表達(dá) 4 組小腸、海馬組織中Nrf2、HO-1、SOD、IL-1 、IL-10 蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F≥34.183，均P ＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組小腸、海馬組織細(xì)胞核中Nrf2 蛋白表達(dá)、細(xì)胞胞漿中HO-1、SOD、IL-1 、IL-10 蛋白表達(dá)升高（q≥7.380，均P ＜0.05）；與模型組比較，有氧運(yùn)動(dòng)組蛋白表達(dá)升高（q≥5.134，均P ＜0.05）；與有氧運(yùn)動(dòng)組比較，有氧運(yùn)動(dòng)+ATRA組蛋白表達(dá)降低（q≥5.300，均P ＜0.05），見圖7。

圖7 4 組大鼠蛋白表達(dá)比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，SCZ 認(rèn)知功能減退與中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬神經(jīng)元變性有關(guān)[6]。有氧運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)記憶功能和反應(yīng)速度，延緩大腦皮質(zhì)的萎縮，減少海馬體積損失，從而維持認(rèn)知功能的穩(wěn)定性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后SCZ 大鼠認(rèn)知及學(xué)習(xí)障礙緩解，海馬神經(jīng)元損傷及凋亡也明顯緩解，這提示有氧運(yùn)動(dòng)有利于緩解SCZ 海馬神經(jīng)元損傷及認(rèn)知功能障礙。

有研究發(fā)現(xiàn)SCZ 患者腸道內(nèi)存在微生物菌群的多樣性及豐度的改變[1]。腸道菌群及代謝產(chǎn)物如LPS 等釋放增加，會(huì)刺激腸黏膜釋放炎癥性細(xì)胞因子增加，改變腸道屏障的通透性，進(jìn)而導(dǎo)致腸道菌株產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)通過腸黏膜屏障及腸道神經(jīng)系統(tǒng)傳入大腦，作用于神經(jīng)元，影響認(rèn)知功能改變引起腦損傷[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腸道屏障及通透性改變，腸道菌群移位及釋放的神經(jīng)遞質(zhì)、炎性因子增加，通過有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后發(fā)現(xiàn)大鼠腸黏膜通透性及屏障損傷緩解，血漿LPS、血清中炎性因子及神經(jīng)遞質(zhì)水平降低，血腦屏障通透性改變也顯著緩解，這提示有氧運(yùn)動(dòng)也可改善SCZ 大鼠腸道屏障損傷作用。

Nrf2/ARE/HO-1 為機(jī)體抗應(yīng)激損傷的重要通路。機(jī)體在受到炎性及氧化應(yīng)激等損傷后，會(huì)刺激Nrf2 與ARE 結(jié)合，并促進(jìn)抗氧化蛋白類基因如SOD、及抗炎類因子如IL-1 表達(dá)來發(fā)揮抗應(yīng)激損傷；另外Nrf2/ARE 活化，還可上調(diào)HO-1 表達(dá)，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡作用，來保護(hù)組織免受損傷[10]。有研究顯示激活Nrf2/ARE/HO-1 通路可促進(jìn)SCZ大鼠抗氧化酶含量，緩解氧化應(yīng)激，改善大鼠認(rèn)知功能，從而緩解精神分裂[11]。本研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠腸-腦軸組織中出現(xiàn)Nrf2/ARE/HO-1 通路及其抗炎、抗氧化途徑的激活，提示有氧運(yùn)動(dòng)發(fā)揮腸-腦軸保護(hù)作用，可能與激活Nrf2/ARE/HO-1 通路及其介導(dǎo)的抗炎、抗氧化途徑有關(guān)，而ATRA可減弱有氧運(yùn)動(dòng)的上述作用。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 葉樂：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作、論文撰寫；李穎芳：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；李陽(yáng)：研究指導(dǎo)、論文修改