高齡與血清學篩查高風險孕婦產前胎兒染色體異常及亞顯微不平衡狀態(tài)的比較分析

周穎，徐玲玲，張莉超，施丹華，李海波

妊娠中期羊水細胞染色體核型分析是產前診斷和及時終止異常妊娠的重要預防手段，是產前診斷染色體數目和結構異常的常用技術之一，并被認為是細胞學診斷的“金標準”[1]。然而，常規(guī)的染色體核型分析報告周期長，羊水細胞需要培養(yǎng)1 周甚至更長時間；而且，DNA基因組中5 Mb以下的染色體拷貝數異常（copy number variant，CNV），即亞顯微不平衡狀態(tài)，無法通過該技術進行分辨[2]。但是，CNV同樣可以導致發(fā)育遲緩、智力障礙、精神行為異常等嚴重出生缺陷。染色體微陣列分析（chromosome microarray analysis，CMA）對于染色體亞顯微不平衡狀態(tài)的診斷具有明顯優(yōu)勢，可顯著提高微缺失、微重復的診斷率[3]，作為新的分子遺傳學產前診斷技術，是傳統核型分析很好的補充。本研究通過對2 497例高齡孕婦和1 891 例血清學篩查高風險孕婦行羊水細胞染色體核型分析及CMA 檢測，比較分析兩組染色體數目異常、結構異常、嵌合體情況及亞顯微不平衡狀態(tài)，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2020 年1 月至2022 年12 月在寧波市婦女兒童醫(yī)院就診的各種高危孕婦，并同時進行產前胎兒染色體核型分析和CMA 檢測的孕婦。納入標準：（1）高齡孕婦，包括僅高齡和高齡合并不良生育史孕婦；（2）血清學篩查高風險孕婦包括21 三體高風險、18 三體高風險和開放性神經管畸形（NTD）高風險的孕婦，其中21 三體高風險包括僅21 三體高風險、21 三體高風險合并超聲異常及21 三體高風險合并不良孕產史；（3）NTD 高風險包括僅NTD 高風險和NTD 高風險合并DS 高風險；（4）超聲軟指標異常包括NT 增厚（≥3.0 mm），心室強光點，側腦室增寬及高齡合并超聲軟指標異常；（5）無創(chuàng)異常包括無創(chuàng)異常合并21 三體高風險及無創(chuàng)異常合并高齡；（6）超聲異常包括超聲異常合并不良孕產史及超聲異常合并高齡；（7）夫婦染色體異常包括高齡合并夫婦染色體異常；（8）其他指夫婦一方確診地中海貧血，孕婦孕期高熱、用藥及智力低下等。其中孕周19 ～23 周、高齡（年齡≥35 歲）孕婦2 497 例，血清學篩查高風險孕婦1 891 例納入本研究。本研究獲得寧波市婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象均同意參加本研究并簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 羊水采集 孕婦排空膀胱取仰臥位，常規(guī)消毒、超聲監(jiān)視下經腹壁行羊膜腔穿刺術，抽取35ml羊水，分裝4 管（FALCON無菌離心管），兩管進行染色體核型分析，一管進行CMA檢測，剩余一管5ml保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 染色體核型分析 按照本院出生缺陷防治實驗室建立的常規(guī)細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)、收獲、制片和G 顯帶分析核型，必要時進行C 顯帶和N 顯帶分析。核型描述依據人類細胞基因組學國際命名體系（ISCN2016）。

1.2.3 CMA 檢測及結果解釋 采用Affymetrix Cytoscan 750K Array 芯片（美國Affymetrix 公司產品）檢測，參照在線公共數據庫（DGV 數據庫、DECIPHER數據庫、OMIM數據庫、UCSC數據庫等）對CNV 的數據進行分析。參照美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會（ACMG）的標準，將CMA 檢測結果分為致病性（P）、可能致病性（LP）、臨床意義不明性（VUS）、可能良性（LB）和良性（B）5 個級別[4]，并結合上述數據庫、相關文獻和超聲檢查結果，系統評價CNV 的臨床意義。

1.3 統計方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行分析，計數資料采用2檢驗或Fisher 確切概率法。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2497 例高齡組染色體核型及CMA 檢測結果 2497 例高齡孕婦共檢出各種異常211 例，總體異常檢出率為8.45%。其中數目異常32 例（1.28%），包括21三體20例、18三體3例、47，XXX 2例、47，XXY 4 例、47，XYY2 例、47，XN，+mar1 例；結構異常12 例（0.48%），其中平衡易位10 例，見表1；大片段缺失重復2 例；嵌合體7 例（0.28%），見表2。10 例平衡易位和5 例嵌合體（包括嵌合比例＜10%和平衡易位嵌合）CMA 均未見異常。CMA 提示CNV160 例，其中27 例評估為致病性CNV，9 例評估為可能致病性CNV，P 或LP CNV 的檢出率為1.44%，見封三彩圖1，124 例評估為VUS，核型分析均未見明顯異常。

表1 羊水細胞染色體核型分析檢出的平衡易位

表2 兩組嵌合體具體類型及妊娠結局

圖1 高齡組P或LP亞顯微不平衡狀態(tài)檢出情況

2.2 1 891 例血清學篩查高風險組核型及CMA 檢測結果 1 891 例血清學篩查高風險孕婦共檢出各種異常178 例（9.41%）。其中數目異常50 例（2.64%），包括21 三體30 例、18 三體14 例、13 三體1 例、47，XXX 1 例、47，XXY 1 例、47，XYY 1 例、45，X 1 例、69，XXX 1 例；結構異常6 例（0.32%），包括平衡易位3 例，見表1；大片段缺失重復3 例；嵌合體5 例（0.26%），見表2。同樣，3 例平衡易位CMA 均未見異常。CMA 提示CNV117 例，其中致病性變異31 例，P或LPCNV檢出率為1.90%，見封三彩圖2，81 例評估為VUS，核型分析均未見明顯異常。高齡組與血清學篩查高風險組數目異常、P 或LP 差異均有統計學意義（均P ＜0.05），見表3。

表3 兩組各種異常檢出率比較

圖2 血清學篩查高風險組P或LP亞顯微不平衡狀態(tài)檢出情況

2.3 高齡組妊娠結局 32 例非整倍體胎兒，其中20例21 三體，3 例18 三體，1 例標記染色體胎兒均終止妊娠，8 例性染色體非整倍體胎兒均足月活產娩出，出生后42 d 隨訪未見明顯異常。

36 例攜帶P 或LP CNV 胎兒經產前遺傳咨詢，有33 例選擇終止妊娠，另外3 例均足月活產娩出，未見明顯異常。攜帶VUS CNV 的胎兒124 例，有2例選擇終止妊娠，經父母雙方外周血驗證，證實變異遺傳自母親。繼續(xù)妊娠的孕婦，有3 例進行父母雙方外周血驗證，證實2 例遺傳自父親，1 例為新發(fā)。7例嵌合體中有2 例選擇終止妊娠，見表2。

2.4 血清學篩查高風險組妊娠結局 50 例非整倍體胎兒，其中30 例21 三體，14 例18 三體，1 例13三體，1 例69，XXX 胎兒均終止妊娠，4 例性染色體非整倍體胎兒均足月活產娩出，出生后42 d 隨訪未見明顯異常。

36 例攜帶P 或LP CNV 胎兒經產前遺傳咨詢，有29 例選擇終止妊娠，另外7 例均足月活產娩出，未見明顯異常。攜帶VUS CNV 的胎兒81 例，均選擇繼續(xù)妊娠，其中有3 例進行父母驗證，證實2 例變異來自母親，1 例來自父親。5 例嵌合體中只有1 例Y 染色體缺失嵌合者選擇繼續(xù)妊娠，其余均終止妊娠，見表2。

3 討論

高齡孕婦中胎兒發(fā)生染色體異常的可能性增加[5]，因為女性自35 歲起卵巢功能逐漸退化，卵子逐漸老化，生殖細胞在減數分裂或受精卵在有絲分裂時較容易發(fā)生染色體不分離或其他畸變。所以我國《母嬰保健法實施辦法》明確指出，孕婦預產期年齡超過35 周歲（高齡孕婦）是產前診斷的適應證。本研究結果顯示高齡組核型檢出異常以非整倍體為主，檢出各種非整倍體32 例，占核型分析總異常的62.74%（32/51）；血清學篩查高風險組檢出非整倍體50 例，占核型異常的81.97%（50/61）。這說明血清學篩查對染色體非整倍體異常有較高的提示作用，通過血清學篩查可提高胎兒染色體非整倍體的檢出率。血清學篩查高風險組檢出數目異常和結構異常共61 例，檢出率為3.23%（61/1 891），與文獻[6-7]報道相符，這說明血清學篩查是確定胎兒染色體疾病風險較好的方法，但其受孕齡、孕婦體質量、血清中AFP及HCG等多種因素的影響，存在較高的假陽性率及假陰性率[8]，需進一步進行羊水穿刺來確診篩查結果，臨床醫(yī)生需結合血清學篩查高風險孕婦自身情況，給予合適的產前診斷方案。

本研究針對高齡和血清學篩查高風險孕婦采用產前胎兒羊水的核型分析聯合CMA 檢測，以標準核型分析分辨率＞10 Mb 設定檢測，對兩者在染色體異常及亞顯微不平衡狀態(tài)進行比較分析。高齡組檢出非整倍體胎兒32 例（1.28%），CMA 額外檢出攜帶P 或LP CNV 胎兒36 例，檢出率提高1.44%。血清學篩查高風險組檢出非整倍體胎兒50 例（2.64%），CMA 額外檢出攜帶P 或LP CNV 胎兒36 例，檢出率提高1.90%，這說明核型分析聯合CMA 檢測可以提高異常的檢出率，符合前期的研究報道[3]。有研究報道，P 或LP CNV 在有超聲結構異常的胎兒中檢出率可達6%～7%[9]，在無超聲結構異常且核型正常的胎兒中檢出率為1%～1.7%[10]。本研究檢出P 或LP CNV高齡組與以往研究一致，血清學篩查高風險組略有升高，分析可能與檢測人群的數量及遺傳背景差異和檢測平臺的不同有關。對于評價為VUSCNV 的檢出情況，兩組均明顯高于胡睿等[11]研究報道的1.03%和Wang等[12]研究報道的1.74%，分析也可能與檢測平臺差異有關。產前VUSCNV 報告不僅會增加臨床醫(yī)生遺傳咨詢工作的難度，同時，還會給胎兒父母帶來很大的心理負擔。本研究兩組孕婦經隨訪發(fā)現，有2 例發(fā)生非醫(yī)學需要的終止妊娠。對攜帶VUSCNV 群體的隨訪觀察，進行系統的表型與基因型關系研究，可以為產前診斷VUS CNV 報告提供更多的參考信息。

CMA 檢測技術與傳統的染色體核型分析相比具有顯著優(yōu)勢，如無需培養(yǎng)，報告周期短，分辨率高，可識別基因組亞顯微結構異常，但其在識別嵌合體和染色體平衡性結構異常方面存在一定局限性。在嵌合體檢出方面，CMA對于低于30%的嵌合體識別較差[13]。本研究兩組羊水細胞染色體核型分析額外檢出3 例數目異常的低比例嵌合體，嵌合比例低于10%。平衡性結構異常方面，本研究染色體核型分析在兩組中共檢出15 例平衡異位攜帶者（包括2 例嵌合體）。因此，針對嵌合型非整倍體和平衡易位的遺傳咨詢，需結合CMA 和染色體核型分析進行綜合評估。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 周穎：實驗設計、采集數據、數據分析、論文撰寫；徐玲玲：實驗設計、采集數據；張莉超：實施研究、采集數據；施丹華：實驗設計、論文修改；李海波：經費支持、研究指導