mNGS 技術(shù)聯(lián)合GM 試驗、血清煙曲霉特異性抗體檢測對COPD合并侵襲性肺曲霉菌病的診斷價值

王卓萍，胡小燕，胡慧佳，張燚超，金軍

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，隨著疾病進展，患者肺功能逐漸下降，導致呼吸困難、持續(xù)咳嗽和反復急性加重[1]。由于COPD 患者的肺部環(huán)境易于細菌和真菌定植，因此更容易發(fā)生各種呼吸道感染。侵襲性肺曲霉菌病（invasive pulmonary aspergillus，IPA）是一種由曲霉菌引起的嚴重肺部感染，在COPD患者中的發(fā)生率逐年上升，其臨床表現(xiàn)與其他呼吸道感染相似，但進展迅速，若不及時診斷和治療，可能導致患者死亡[2]。目前，IPA 的診斷主要依賴臨床表現(xiàn)、影像學檢查和微生物學檢測等，傳統(tǒng)的微生物學檢測方法，如直接鏡檢和培養(yǎng)，雖然診斷準確率較高，但耗時較久[3]。近年來，宏基因二代測序（mNGS）技術(shù)逐漸應用于各種感染性疾病的診斷，可快速、準確地檢測出樣本中的微生物DNA，為臨床診斷提供高效的工具[4]。半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）試驗和血清煙曲霉特異性抗體檢測也是診斷IPA 的常用工具，本研究旨在探討mNGS技術(shù)聯(lián)合GM 試驗、血清煙曲霉特異性抗體檢測對COPD 合并IPA 的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用前瞻性研究，納入2020 年8 月至2023 年8 月杭州市第九人民醫(yī)院收治的96 例COPD患者。納入標準：（1）符合COPD 診斷標準[5]；（2）存在疑似IPA 的臨床表現(xiàn)（如發(fā)熱、持續(xù)咳嗽、胸痛、血痰等）；（3）胸部影像學檢查顯示肺部浸潤、空洞形成等可能與IPA 相符的表現(xiàn)；（4）臨床資料完整。排除標準：（1）已明確診斷為肺結(jié)核、肺癌等其他呼吸系統(tǒng)疾病；（2）有嚴重肝腎功能障礙、已知其他真菌感染。本研究獲得杭州市第九人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均同意參加本研究并簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 mNGS檢測 從患者的支氣管肺泡灌洗液中提取總DNA，采用QIAamp DNA Mini Kit 進行DNA 提取；使用專門針對微生物的16S rRNA 引物進行PCR擴增，PCR 反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，35 個周期，55℃退火30s、72℃延伸1min，最后72℃延伸7min。使用IlluminaMiSeq 平臺進行測序，使用QIIME 2 軟件進行數(shù)據(jù)分析，與NCBI 微生物數(shù)據(jù)庫進行比對，在樣本中檢測到曲霉菌DNA序列，且其在所有微生物中的相對豐度超過1%，判定為陽性。

1.2.2 GM 試驗 從患者血液中提取血清，存儲于-20℃；采用PlateliaAspergillusGM試劑盒，按照廠家說明書進行操作，通過酶標儀讀取450nm的吸光度值。

1.2.3 血清煙曲霉特異性抗體檢測 從患者血液中提取血清，存儲于-20 ℃；使用煙曲霉IgG ELISA試劑盒，將樣本加入預先包被有煙曲霉抗原的酶標板孔中，孵育1 h；采用洗滌緩沖液洗滌3 次，去除未結(jié)合的物質(zhì)，加入與IgG抗體結(jié)合的酶標記二抗，孵育30 min，重復洗滌步驟，加入TMB底物，孵育20min，然后加入停止液；通過酶標儀讀取450 nm 的吸光度值，使用標準曲線來確定抗體濃度。

1.3 COPD合并IPA的診斷標準 參照歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組（EORTC/MSG）的共識標準[6]，（1）臨床表現(xiàn)：持續(xù)發(fā)熱且廣譜抗生素治療無反應，存在呼吸困難、持續(xù)咳嗽、胸痛及血痰；（2）影像學檢查：胸部CT 顯示“新月體”征、“空洞”形成、“衛(wèi)星病灶”；（3）微生物學證據(jù)：從呼吸道分泌物或肺組織中直接觀察到曲霉菌的分枝菌絲，從肺組織或支氣管肺泡灌洗液中分離出曲霉菌；（4）組織病理學證據(jù)：肺組織活檢發(fā)現(xiàn)曲霉菌侵襲性生長，如曲霉菌的菌絲穿透肺泡壁、出現(xiàn)組織壞死。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用獨立樣本t 檢驗；計數(shù)資料采用2檢驗；聯(lián)合檢測中一項陽性則結(jié)果為陽性，繪制ROC曲線分析各檢測方法的診斷價值。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 根據(jù)診斷標準，最終96例患者中合并IPA組40例，非IPA組56例，IPA組男24例，女16例；年齡45～78歲，平均（62.3±8.5）歲；COPD病程3～15年，平均（9.45±3.58）年。非IPA組男34例，女22例；年齡43～77歲，平均（60.1±7.9）歲；COPD 病程2～14年，平均（8.76±3.37）年。兩組一般資料差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.2 mNGS 檢測結(jié)果 mNGS 檢出陽性44 例，其中真陽性36例，陰性52例，其中真陰性48例，見表1。

表1 mNGS 檢測結(jié)果 例

2.3 兩組血清GM 值及煙曲霉IgG 抗體水平比較IPA 組血清GM 值及煙曲霉IgG 抗體水平均高于非IPA 組（均P ＜0.05），見表2。

表2 兩組血清GM 值及煙曲霉IgG 抗體水平比較

2.4 血清GM 值及煙曲霉IgG 抗體水平對IPA 的診斷價值分析 ROC曲線顯示，血清GM值、煙曲霉IgG抗體水平診斷TPE的最佳截斷值分別為0.64、77.32kAU/L，對應的AUC 分別為0.804、0.807，聯(lián)合診斷AUC 為0.865，見表3。

表3 血清GM 值及煙曲霉IgG 抗體水平對IPA 的診斷效能

2.5 mNGS 聯(lián)合GM 試驗、血清煙曲霉IgG 抗體檢測對IPA 的診斷效能 mNGS 聯(lián)合GM 試驗、血清煙曲霉IgG 抗體檢測診斷IPA 的敏感度、特異度、準確度分別為96.88%、92.19%、93.75%，與最終診斷結(jié)果的一致性檢驗Kappa 值為0.86，見表4。

表4 mNGS 聯(lián)合GM 試驗、煙曲霉IgG 抗體檢測對IPA 的診斷效能

3 討論

IPA的臨床表現(xiàn)多樣且具有非特異性，臨床確診有一定難度，傳統(tǒng)診斷方法如微生物培養(yǎng)和組織病理學檢查耗時較長，可能導致診斷延遲而延誤病情[7-8]。因此，尋找一種快速、準確的IPA 診斷方法，對于改善COPD 患者的療效和預后具有重要意義。

mNGS是近年來迅速發(fā)展的一種高通量測序技術(shù)，其核心原理是通過對樣本中的所有DNA進行測序，然后與已知的微生物數(shù)據(jù)庫進行比對，從而實現(xiàn)對病原體的快速、準確鑒定[9-11]。在IPA 的診斷中，mNGS可在短時間內(nèi)直接從患者樣本中檢測到曲霉菌DNA，從而為早期診斷提供依據(jù)[12]。本研究結(jié)果顯示mNGS技術(shù)在IPA的診斷中敏感度高達90.0%，這是因為mNGS可在短時間內(nèi)檢測到大量微生物的DNA，且與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法相比，mNGS不受微生物生長速度、培養(yǎng)條件等因素的限制，因此更為敏感。mNGS 單獨診斷IPA 的特異度為85.7%，提示存在一定的假陽性率，可能原因是mNGS 檢測的是曲霉菌DNA，而不是活菌，因此即使在沒有活性感染的情況下也可能檢測到曲霉菌的DNA，從而導致假陽性結(jié)果。此外，環(huán)境中的曲霉菌污染、樣本處理過程中的交叉污染等因素也可能導致假陽性結(jié)果。

GM 是曲霉菌細胞壁的組成部分，在曲霉菌的生長和復制過程中會釋放到體內(nèi)，因此其在血清中的存在與曲霉菌的活性侵襲有關(guān)，且血清中的GM 水平在感染早期顯著升高，因此GM 試驗常被用作IPA 的早期和快速診斷工具[13]。本研究結(jié)果顯示IPA 組血清GM 值高于非IPA 組，與文獻[14]報道結(jié)果一致。ROC曲線分析顯示，血清GM 值對IPA 診斷的最佳截斷值為0.64，單獨診斷特異度高但敏感度較低，原因是GM試驗在感染初期或菌量較低的情況下容易出現(xiàn)假陰性。在免疫系統(tǒng)受到侵襲時，機體會產(chǎn)生特異性抗體來應對病原體感染，因此檢測煙曲霉特異性IgG 抗體水平可提供患者免疫狀態(tài)相關(guān)信息。本研究結(jié)果顯示IPA組血清煙曲霉特異性IgG抗體水平高于非IPA組。IPA 通常病程較長，煙曲霉IgG 抗體水平的升高可能會持續(xù)較長時間，而不像一些其他免疫標志物（如C反應蛋白）那樣迅速升高和下降，這也導致一些早期或輕度感染可能會漏診[15]。本研究結(jié)果顯示mNGS 技術(shù)、GM試驗及血清煙曲霉IgG抗體檢測三者聯(lián)合診斷，敏感度、特異度、準確度均較高，與最終診斷結(jié)果一致性較好，原因是三種診斷方法各自具有其優(yōu)點和局限，通過聯(lián)合檢測可互相彌補局限性，從而提高診斷敏感性。mNGS技術(shù)在早期感染就能檢測到病原體，而早期感染可能在其他診斷方法中產(chǎn)生假陰性結(jié)果，但mNGS 可以更早捕獲感染信號，同時也有助于確定治療后是否存在潛在耐藥或其他復雜情況；GM 試驗和IgG 抗體檢測早期敏感性較低，但可用于監(jiān)測治療效果或復發(fā)感染，三者聯(lián)合診斷可減少漏診或誤診的可能性。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 王卓萍：實驗操作、論文撰寫；胡小燕、胡慧佳、張燚超、金軍：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學分析