CCR10通過NRF2抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制研究

徐昰棟,劉子梅,陳 寧,褚敬申,姜曉星,劉湘帆,馬俐君

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院 腫瘤科,上海200336;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,上海200025;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 科技發(fā)展處,上海200025)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,約占全球每年新發(fā)癌癥的10%[1-2],發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。鐵死亡是一種鐵依賴、由脂質(zhì)過氧化和隨后的質(zhì)膜破裂而引起的細(xì)胞程序性死亡[3]。鐵死亡主要通過兩種途徑啟動(dòng),外源性途徑是抑制胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(系統(tǒng)XC-)或激活鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體血清轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳轉(zhuǎn)鐵蛋白;內(nèi)源性途徑主要是抑制細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione Peroxidase 4,GPX4)[4]。鐵死亡誘導(dǎo)劑(ferroptosis inducers,FINS)已被發(fā)現(xiàn)可以和傳統(tǒng)療法結(jié)合治療癌癥[5]。Erastin和rsl3是鐵死亡研究中常用的兩種FINs,其中Erastin可抑制溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)攝取胱氨酸并限制細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸和谷胱甘肽水平[6-7],rsl3可抑制GPX4的催化活性[8]。C-C趨化因子受體10(C-C chemokine receptor 10,CCR10)是一種G蛋白偶聯(lián)受體,在腫瘤中的具體功能與機(jī)制尚不十分明確。本研究旨在結(jié)合生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,深入研究CCR10在結(jié)直腸癌細(xì)胞鐵死亡過程中的作用和分子機(jī)制,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

HCT 116細(xì)胞系購自中國科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫,胎牛血清來自美國Crystalgen公司,McCOY’s 5A培養(yǎng)基來自美國Cytiva公司,青鏈霉素雙抗和胰蛋白酶來自美國Gibco公司;Lipo2000購自美國Invitrogen公司,CCR10過表達(dá)慢病毒及其陰性對(duì)照,CCR10過表達(dá)質(zhì)粒及其空載對(duì)照,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染核因子E2相關(guān)因子2(NRF2)過表達(dá)質(zhì)粒及其空載對(duì)照均由上海和元生物構(gòu)建,CCR10敲除慢病毒及其陰性對(duì)照購自上海碧云天技術(shù)有限公司;CCK8試劑盒購自蘇州新賽美生物,PCR相關(guān)試劑購自湖南艾科瑞生物,結(jié)晶紫購自上海碧云天技術(shù)有限公司;鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin、rsl3購自美國Selleck公司,CCR10抗體購自美國Proteintech公司,鐵死亡抗體樣品試劑盒(Ferroptosis Antibody Sampler Kit)、β-tubulin、GAPDH抗體購自美國CST公司;4周齡BALB/c雄性裸鼠來自上海維通利華。

1.2 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析

使用基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)的快速個(gè)性化分析網(wǎng)站(http://gepia2.cancer-pku.cn/),分析CCR10在結(jié)直腸癌中與鐵死亡相關(guān)基因的共表達(dá)情況。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建

使用含10%胎牛血清和1%雙抗的McCOY’s 5A培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)HCT 116細(xì)胞,用含有CCR10靶向sgRNA(CCR10-KO)和cDNA(CCR10-OE)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染HCT 116細(xì)胞。空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作敲除或過表達(dá)的陰性對(duì)照。用嘌呤霉素(8 μg/ml)篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

1.4 CCK8法和克隆形成檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力

CCK8法:將細(xì)胞接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后,每組加入相應(yīng)濃度的erastin(12 μM)或rsl3(4 μM)培養(yǎng)24 h,再加入CCK8試劑孵育2 h,每組細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值。克隆形成實(shí)驗(yàn):6孔板每孔鋪設(shè)細(xì)胞1000個(gè)并培養(yǎng)14 d,或每孔鋪設(shè)5000個(gè)細(xì)胞待貼壁后并分別加入DMSO/erastin/rsl3培養(yǎng)14 d。多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,肉眼觀察。

1.5 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

用總RNA提取試劑盒(AG,#AG21024))提取上述細(xì)胞系總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,使用qPCR試劑盒和相關(guān)引物進(jìn)行qRT-PCR。引物序列:CCR10正向序列5’-CTGCTGGATACTGCCGATCTAC-3’,反向序列5’-AGGAAGGCGTAGAACGGGGAT-3’。NRF2正向序列5’-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3’;反向序列5’-GGAATGTCTGCGCCAAAAGCTG-3’。GAPD正向序列5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’;反向序列5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’。GAPDH作為內(nèi)參。然后用2-△△Ct方法計(jì)算每個(gè)基因表達(dá)水平。

1.6 Western blot

在冰上用RIPA裂解細(xì)胞提取總蛋白,經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,使用CCR10、GAPDH或β-tubulin、Ferroptosis Antibody Sampler Kit一抗(CST)及山羊抗兔HRP偶聯(lián)的二抗(CST)孵育,顯影儀檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.7 C11-BODIPY染色和流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)脂質(zhì)過氧化

用C11-BODIPY 581/591(MCE,#HY-D1301)檢測(cè)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。經(jīng)DMSO/erastin/rsl3處理24 h后,細(xì)胞與C11-BODIPY(5 μM)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育60 min。孵育結(jié)束后,加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞,以1 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞,最后用500 μL PBS重懸細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。染料的羥基自由基氧化導(dǎo)致熒光發(fā)射峰從～591 nm移動(dòng)到～510 nm。

1.8 裸鼠異種移植瘤實(shí)驗(yàn)

將HCT 116細(xì)胞懸液(4×106個(gè)/200 μL)注射到4周齡雄性BALB/c裸鼠的右側(cè)背側(cè)皮下。將小鼠隨機(jī)分為2組,每組6只:(1)接種NC細(xì)胞;(2)接種CCR10-KO細(xì)胞。所有小鼠在腫瘤最大直徑達(dá)到15 mm之前被處死。腫瘤體積按0.5×長(zhǎng)×寬2計(jì)算。每3 d監(jiān)測(cè)一次腫瘤體積。本實(shí)驗(yàn)由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行分析,通過t檢驗(yàn)或單向ANOVA分析統(tǒng)計(jì)差異并經(jīng)過正態(tài)分布檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)都來自至少三個(gè)獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CCR10與鐵死亡相關(guān)基因共表達(dá)的生信分析

利用GEPIA分析CRC患者組織中鐵死亡相關(guān)基因與CCR10的共表達(dá)情況,其中CCR10與鐵死亡抑制基因B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(BCL-2)(r=0.54,P<0.001)、重肽鐵蛋白(FTH1)(r=0.18,P<0.01)和NRF2(r=0.31,P<0.001)呈正相關(guān)(見圖1A),與鐵死亡驅(qū)動(dòng)基因腫瘤蛋白P53(TP53)(r=-0.46,P<0.001)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TFRC)(r=-0.45,P<0.001)和胞質(zhì)接頭蛋白Keap1(KEAP1)(r=-0.29,P<0.001)呈負(fù)相關(guān)(見圖1B),提示CCR10與鐵死亡具有密切相關(guān)性。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析CCR10與鐵死亡相關(guān)基因共表達(dá)關(guān)系

2.2 建立CCR10過表達(dá)和敲除細(xì)胞株

qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相較于其陰性對(duì)照組(NC),CCR10-OE組的CCR10 mRNA的表達(dá)水平升高約20倍,而CCR10-KO組CCR10 mRNA表達(dá)水平約降低為原來的1/10(見圖2A)。WB實(shí)驗(yàn)證明CCR10-OE蛋白表達(dá)水平顯著升高,而CCR10-KO組的CCR10蛋白表達(dá)水平顯著降低(見圖2B),提示HCT 116 CCR10過表達(dá)和敲除細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖2 病毒感染HCT116細(xì)胞后CCR10過表達(dá)及敲除情況

2.3 CCR10對(duì)于細(xì)胞增殖的影響

CCK8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CCR10過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞增殖,而CCR10敲除則抑制了這一作用(見圖3A)。同樣地,CCR10過表達(dá)或敲除分別增加或抑制兩種細(xì)胞的集落形成(見圖3B)。

圖3 CCR10過表達(dá)及敲除后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響

2.4 CCR10敲除影響小鼠皮下異種移植瘤生長(zhǎng)

將CCR10-KO的HCT 116細(xì)胞注射至裸鼠皮下后形成的腫瘤小于注射對(duì)照細(xì)胞的裸鼠(見圖4A、4B),CCR10-KO的HCT116細(xì)胞種植后形成的腫瘤體積(見圖4C)和重量(見圖4D)較對(duì)照組相比明顯縮小,提示CCR10基因敲除明顯抑制了腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。

圖4 CCR10敲除后在體內(nèi)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響

2.5 CCR10對(duì)于erastin和rsl3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響

分別用兩種鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin和rsl3處理CCR10過表達(dá)和敲除的HCT 116細(xì)胞。CCK8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)(見圖5A、5B)和克隆形成實(shí)驗(yàn)(見圖5C)顯示erastin或rsl3處理細(xì)胞均可導(dǎo)致細(xì)胞死亡,而過表達(dá)CCR10時(shí),可顯著抑制erastin和rsl3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡;反之,當(dāng)CCR10表達(dá)下降時(shí),細(xì)胞則對(duì)2種鐵死亡誘導(dǎo)劑敏感性增強(qiáng)。結(jié)果表明,CCR10表達(dá)會(huì)影響細(xì)胞對(duì)鐵死亡的反應(yīng)。

圖5 CCR10過表達(dá)及敲除后結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑殺傷作用的變化

2.6 CCR10對(duì)于細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞經(jīng)erastin或rsl3處理24 h后的脂質(zhì)過氧化水平,結(jié)果表明,CCR10-OE組相對(duì)于對(duì)照組,脂質(zhì)過氧化比例明顯下降(見圖6A),而CCR10-KO組相對(duì)于對(duì)照組,脂質(zhì)過氧化比例則明顯上升(見圖6B)。在CCR10-KO細(xì)胞株中回補(bǔ)CCR10質(zhì)粒(見圖6C)則相對(duì)其空載對(duì)照逆轉(zhuǎn)了脂質(zhì)過氧化水平。

圖6 CCR10過表達(dá)或敲除后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平的影響

2.7 CCR10蛋白表達(dá)水平與多種鐵死亡相關(guān)蛋白的關(guān)系

分別提取CCR10過表達(dá)和對(duì)照細(xì)胞,CCR10敲除和對(duì)照細(xì)胞的總蛋白,利用Western blot檢測(cè)上述樣本鐵死亡相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(見圖7)。結(jié)果顯示,過表達(dá)CCR10顯著增加了鐵死亡抵抗蛋白NRF2、SLC3A2、SLC40A1、SLC7A11、GPX4、FTH1蛋白的水平,降低了鐵死亡驅(qū)動(dòng)蛋白NCOA4的水平。而在CCR10敲除組中這些與鐵死亡相關(guān)的蛋白水平呈現(xiàn)與過表達(dá)組相反的趨勢(shì),進(jìn)一步證明了CCR10的表達(dá)與鐵死亡呈負(fù)相關(guān),并明顯改變了鐵死亡途徑中多個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

圖7 WB檢測(cè)CCR10過表達(dá)及敲除后HCT116細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白的變化

圖8 CCR10通過NRF2影響鐵死亡下游基因SLC7A11、GPX4和FTH1

2.8 NRF2是CCR10抑制結(jié)直腸癌鐵死亡通路的關(guān)鍵分子

NRF2是已知的抑制鐵死亡的重要分子,可直接影響SLC7A11、GPX4和FTH1的表達(dá)。前面結(jié)果已證明CCR10影響NRF2蛋白表達(dá)。進(jìn)一步進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明CCR10的過表達(dá)可引起NRF2轉(zhuǎn)錄水平升高,而敲除CCR10則使NRF2轉(zhuǎn)錄水平下降(見圖8A)。為了進(jìn)一步明確CCR10與NRF2的關(guān)系,采用了NRF2的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。在CCR10-KO的HCT116細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NRF2質(zhì)粒及其空載,在mRNA(見圖8B)和蛋白質(zhì)(見圖8C)水平分別驗(yàn)證其成功轉(zhuǎn)染。CCK8結(jié)果表明,經(jīng)erastin和rsl3處理后,轉(zhuǎn)染NRF2的CCR10-KO細(xì)胞相對(duì)存活率得以恢復(fù)(見圖8D),即回補(bǔ)NRF2可恢復(fù)細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性,并分別檢測(cè)SLC7A11、GPX、FTH1的mRNA水平(見圖8E)和蛋白質(zhì)水平(見圖8F),結(jié)果顯示,當(dāng)回補(bǔ)NRF2后,SLC7A11、GPX4和FTH1表達(dá)水平相應(yīng)升高,也驗(yàn)證了NRF2作為SLC7A11的上游轉(zhuǎn)錄因子的效應(yīng)。上述結(jié)果提示,CCR10可以通過NRF2表達(dá)上調(diào)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的鐵死亡。

2.9 CCR10通過NRF2抵抗鐵死亡

結(jié)果表明,CCR10可能通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NFR2表達(dá),影響下游的SLC7A11、GPX4和FTH1等鐵死亡重要蛋白質(zhì)表達(dá),從而引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平降低,進(jìn)而發(fā)揮抵抗結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性(見圖9)。

圖9 CCR10通過NRF2抵抗鐵死亡

3 討論

結(jié)直腸癌具有復(fù)雜性、異質(zhì)性和通過各種手段逃避免疫監(jiān)視的能力[9],因此有必要對(duì)結(jié)直腸癌分子機(jī)制進(jìn)行深入研究,采取多靶點(diǎn)、多途徑的個(gè)體化治療。近年誘導(dǎo)鐵死亡是一種治療腫瘤新的治療策略,鐵死亡激活劑因其巨大的治療潛力而引起了癌癥研究的極大興趣[10]。

鐵死亡是一種獨(dú)特的調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的形式,最早由DIXON等[11]在2012年描述為一種非凋亡性、鐵依賴的細(xì)胞死亡形式。這一過程在形態(tài)、生化和遺傳方面不同于其他類型的細(xì)胞死亡,如細(xì)胞凋亡、壞死和自噬等[3]。鐵死亡的關(guān)鍵生化特征包括過氧化脂質(zhì)的積累和谷胱甘肽的耗竭,其中谷胱甘肽是一種重要的抗氧化劑分子,其耗竭會(huì)導(dǎo)致活性氧(ROS)水平升高和氧化應(yīng)激,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。鐵死亡已被證明在抑制腫瘤和耐藥性方面發(fā)揮作用。在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)鐵死亡可以增加它們對(duì)化療、放射治療和免疫治療的敏感性[13],如erastin可以提高化療藥物,如順鉑、多西他賽、替莫唑胺等藥物殺傷腫瘤的作用。免疫治療是最新型的腫瘤治療模式,研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用鐵死亡抑制劑liproxstatin-1后,程序性細(xì)胞死亡配體1(PD-L1)的免疫抑制作用會(huì)明顯降低,提示鐵死亡在免疫治療中發(fā)揮重要作用。此外,結(jié)直腸癌存在多種基因突變,其中KRAS基因突變率約占40%,也是造成CRC治療出現(xiàn)耐藥性的重要原因,現(xiàn)已有報(bào)道CRC細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性與KRAS突變耐藥性關(guān)系密切[14],然而目前已知的FINs都無法作為藥物應(yīng)用于臨床,因此尋找能夠增強(qiáng)鐵死亡敏感性的基因?qū)訌?qiáng)化療藥物、靶向藥物、免疫治療的療效以及減少耐藥性出現(xiàn)將具有積極的臨床意義。

本研究通過CCR10與多個(gè)鐵死亡重要基因共表達(dá)的生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn),CCR10與鐵死亡關(guān)系極為密切,且表現(xiàn)為CCR10是鐵死亡的負(fù)性基因。在以往的研究中,CCR10研究主要集中在它的兩個(gè)配體,即趨化因子配體27(chemokine ligand 27,CCL27)和趨化因子配體28 (chemokine ligand 28,CCL28)[15-17]。CCR10/CCL27-CCL28軸被認(rèn)為介導(dǎo)免疫細(xì)胞的遷移和定位,參與腫瘤免疫監(jiān)視、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,基于該軸設(shè)計(jì)的治療方法可能在腫瘤治療中具有一定的應(yīng)用前景[18]。CCL27作為一種趨化因子,可以吸引T細(xì)胞和NK細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境,抑制腫瘤生長(zhǎng)[19-20],而CCL28被認(rèn)為是肝癌、肺癌和結(jié)直腸癌的侵襲因子[18],可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。總之,CCR10/CCL27-CCL28軸是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一把雙刃劍[21],而本研究揭示了CCR10除了與配體的作用外,可能直接參與結(jié)直腸癌細(xì)胞鐵死亡。

研究發(fā)現(xiàn)CCR10能抑制細(xì)胞鐵死亡,促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,而當(dāng)CCR10基因表達(dá)缺失時(shí),可以啟動(dòng)鐵死亡,細(xì)胞增殖能力則明顯減弱,同樣的結(jié)果也在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得以驗(yàn)證。明確CCR10與鐵死亡的關(guān)系后,本研究進(jìn)一步探討CCR10調(diào)控鐵死亡的機(jī)制。其中胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(System xc-)是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化體系,參與細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)生成。GSH是谷胱甘肽過氧化物酶的還原性輔助因子,那么抑制System xc- 活性即抑制GSH的合成,繼而降低GPX4活性,細(xì)胞抗氧化能力降低,導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物的累積,從而促進(jìn)鐵死亡,這是鐵死亡的最重要的途徑之一。System xc-由SLC7A11和SLC3A2兩個(gè)亞基組成,其中SLC7A11是系統(tǒng)XC-中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞基[6,22],對(duì)胱氨酸/谷氨酸具有強(qiáng)特異性。本研究發(fā)現(xiàn),CCR10基因變化會(huì)導(dǎo)致NRF2基因表達(dá)的明顯改變。NRF2是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,它對(duì)SLC7A11具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。通過上調(diào)NRF2可引起下游SLC7A11、GPX4、FTH1等基因表達(dá)升高,而在CCR10敲除的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NRF2進(jìn)行補(bǔ)償驗(yàn)證時(shí),鐵死亡表型發(fā)生了逆轉(zhuǎn),SLC7A11、GPX4等表達(dá)也發(fā)生了反向改變。上述結(jié)果提示CCR10可以通過NRF2的升高影響SLC7A11/GPX4通路,從而降低CRC對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑的敏感性。

綜上,本研究明確了CCR10可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性,促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。CCR10改變鐵死亡表型可能是通過轉(zhuǎn)錄因子NFR2,影響下游SLC7A11、GPX4等關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的。那么CCR10是否具有腫瘤靶點(diǎn)治療的潛力,其靶點(diǎn)封閉是否具有與化療、靶向治療等協(xié)同作用的價(jià)值,都值得未來進(jìn)行深入研究。