紅景天苷對海馬神經元自然衰老的影響和機制研究

徐新穎 朱 琳 劉姿杉 倪欽帥 于竹芹，3*

（1.濟南市濟陽區中醫院ICU科，山東 濟南，251400；2.青島大學醫學部中西醫結合中心，山東 青島，266021；3.青島市第六人民醫院內科，山東 青島，266023）

機體發生衰老時會增加神經退行性疾病等多種疾病的發病風險[1]。海馬神經元衰老與多種神經退行性疾病的發生密切相關[2]。研究表明，端粒酶缺乏的小鼠更容易發生衰老并伴隨神經退行性變，出現海馬神經元損傷，而重新提高端粒酶活性可以改善年齡相關的神經元損傷并延緩衰老[3]。《靈樞·天年》曰：人之壽，百歲而死。說明人若盡其天年可活到百歲，若能采取有效措施，可以延緩衰老的[4]。《本草綱目》中記載，紅景天（rhodiolarosea）為“本經上品，祛邪惡氣，補諸不足”，具有補氣清肺、益智養心、理氣養血等功效[5]。臨床研究發現，紅景天可以抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、抗衰老和肝保護等作用[6-7]。現代藥理研究表明，紅景天的主要活性成分紅景天苷（salidroside，Sal）對多種神經退行性疾病具有神經保護作用[8-9]，但其對神經元衰老的影響及作用機制尚不十分明確。本研究通過分離和培養大鼠原代海馬神經元，使其自然衰老，旨在探討紅景天苷對海馬神經元衰老的作用和作用機制，為臨床應用提供新的思路[10]，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

紅景天苷（生產企業：上海阿拉丁生化科技公司，Sal，S101157，C14H20O7，300.31 Da）；環黃芪醇（生產企業：上海麥克林生化科技公司，CAG，C864810，C30H50O5，490.71 Da）；胰蛋白酶（25200056）、胎牛血清（FBS，10099141）、DMEM /F12培養基（11320082）、Neurobasal-A培養基（10888022）（生產企業：美國Gibco公司）；細胞計數試劑盒（生產企業：北京索萊寶科技公司，CCK-8，CA1210）；衰SA-β-gal染色試劑盒（生產企業：上海碧云天生物技術公司，C0602）；兔抗鼠TERT抗體（生產企業：Novus Biologicals公司，NB100-317）；端粒酶PCR-ELISA試劑盒（生產企業：德國羅氏公司，1185666910）；熒光顯微鏡（ECLIPSE Ti2）、PCR儀（T100TM）（生產企業：Bio-Rad公司）；酶標儀（生產企業：Bio-Tek公司，SYNERGYH1）。

1.2 原代海馬神經元的培養

取新生24 h內SD大鼠，用75%酒精浸泡消毒5 min，斷頭取腦，無菌操作，分離海馬，剪碎，加0.125%胰蛋白酶，37 ℃消化15 min。加含血清培養基，機械輕柔吹打數次終止消化，用200目篩網過濾到離心管，1 000 rpm離心5 min，棄上清。用DMEM/F12培養基將沉淀細胞懸浮，接種到多聚賴氨酸包被培養板，5% CO2，37 ℃培養箱培養4 h后，更換為Neurobasal-A培養基，每隔2天半量換液。光鏡（200倍）觀察神經元生長狀態。隨機選取5個視野，計算平均細胞數。實驗過程嚴格遵守動物倫理學要求（QDYXBWZLL20230606）。

1.3 原代海馬神經元純度鑒定

取培養7 d的原代海馬神經元，用4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗5 min×3次。加0.5% Triton X-100室溫透化10 min，PBS洗5 min×3次。用10%正常山羊血清室溫封閉30 min，然后加MAP2抗體（1:150），4 ℃孵育過夜，PBS洗5 min×3次，避光，加Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗（1:200）室溫避光孵育1 h，PBS洗5 min×3次，加DAPI染液，室溫避光染色10 min，PBS洗5 min×3次。熒光顯微鏡（200倍）觀察DAPI和MAP2表達情況，隨機選取5個視野，計數綠色熒光細胞數，根據熒光細胞數目和細胞總數的比值計算神經元純度。

1.4 原代海馬神經元分組

原代海馬神經元培養至第7天為ST培養（年輕神經元），第17天為LT培養（老年神經元）。將神經元分為ST組、LT組、紅景天苷低濃度（Sal-L）、高濃度（Sal-H）組、環黃芪醇（CAG）組。神經元培養至第14天，分別用紅景天苷（10 μM、20 μM）和CAG（5 μM）處理72 h。第17天收集各組神經元。顯微鏡（200倍）觀察神經元生長情況。

1.5 細胞活力測定

原代海馬神經元接種于96孔板，至第14天，加紅景天苷（10 μM、20 μM）和CAG（5 μM）繼續培養至第23天，每隔2天使用CCK-8法檢測細胞活力。每孔加10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育3 h。酶標儀在450 nm處測定吸光度。

1.6 SA-β-gal染色

原代海馬神經元接種于6孔板，按分組處理后SA-βgal染色。每孔加1 mL染色固定液，室溫固定15 min，PBS洗3 min×3次，隨后每孔加1 mL染色工作液，封口膜封住6孔板以防蒸發，37℃（無CO2）孵育過夜。光鏡觀察記錄SA-β-gal陽性細胞（藍染）數，計算陽性細胞率（陽性細胞數目/總細胞數目）。

1.7 流式細胞術

海馬原代神經元經分組處理，經0.25%胰酶（無EDTA）消化，1 000 rpm、4 ℃離心5 min，棄上清，預冷PBS洗滌細胞2次，1 000 rpm、4 ℃離心5 min，棄上清。將細胞重懸于100 μL預冷Annexin V緩沖液，隨后分別加5 μL的 Annexin V-FITC和PI，室溫避光反應15 min，加400 μL預冷Annexin V緩沖液重懸細胞，流式細胞儀分析。

1.8 Western Blot分析

原代海馬神經元按分組處理后，用RIPA裂解液裂解，12 000 rpm離心5 min，收集上清，使用BCA法檢測總蛋白濃度。總蛋白（30 ug）經SDS-PAGE分離后，凝膠濕轉到PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗5 min×3次。加一抗（TERT 1:500，β-actin 1:15 000），4℃孵育過夜，TBST洗5 min×3次。加羊抗兔二抗（1:15 000）室溫孵育1.5 h，TBST洗5 min×3次。隨后ECL化學發光顯色，凝膠成像系統采集圖像，Image J軟件分析蛋白條帶灰度。目的蛋白與內參β-actin灰度比值為目的蛋白的相對表達量。

1.9 端粒酶活性測定

使用端粒酶PCR-ELISA試劑盒裂解液裂解神經元，取部分裂解產物95℃熱滅活作為陰性對照，試劑盒提供的蛋白提取物作為陽性對照。隨后加入含有端粒酶底物的反應混合物。將樣品轉移PCR儀擴增：25 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s 30個循環，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s。用雜交緩沖液稀釋PCR產物后，加到預涂有地高辛標記（含端粒重復特異性探針）的96孔板。經37 ℃變性雜交2 h，加入抗地高辛過氧化物酶偶聯物和TMB底物ELISA測定，測定450 nm處的吸光度。根據陰性對照值，吸光度值大于0.25為端粒酶陽性。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠原代海馬神經元長期培養

培養第7天，神經元胞體飽滿，細胞折光性強，神經元突起密集，形成突觸連接和神經網絡。第11～15天，細胞胞體飽滿且折光性更強，神經元突起發達，神經元網絡最為密集，細胞數量較第7天無明顯變化（P＞0.05）。第17～19天，細胞邊界不清，部分細胞開始退化，光暈減弱，突起斷裂，細胞數量較第15天明顯減少（P＜0.01）。第21天，神經元退化，胞體萎縮，胞漿內出現顆粒變性，神經元突起斷裂，細胞數量較第19天進一步減少（P＜0.01）。海馬神經元培養第7天，經MAP2免疫熒光鑒定，92%以上為陽性細胞，見圖1、2。

圖1 原代海馬神經元在不同培養時間的形態和數目（n=5，200×）

圖2 免疫熒光染色鑒定原代海馬神經元純度（n=5，200×）

2.2 紅景天苷對神經元存活率的影響

CCK-8結果顯示，細胞培養至第15天，加紅景天苷和CAG的神經元存活率與LT組相比無明顯變化，差異有統計學意義（P＞0.05）。至第17天、19天，Sal-L組、Sal-H組和CAG組的神經元存活率較LT組顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。至第21天、23天，Sal-L組、Sal-H組和CAG組神經元存活率較與LT組顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 紅景天苷對原代海馬神經元的形態和細胞活性影響（n=5，200×）

2.3 紅景天苷對海馬神經元SA-β-gal表達的影響

SA-β-gal染色結果顯示，LT組SA-β-gal陽性（藍染）細胞率相較ST組明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01），說明隨著海馬神經元的長時間培養，細胞逐漸衰老。而與LT組相比，Sal-L組、Sal-H組和CAG組的SA-β-gal陽性細胞率明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 紅 景天苷對自然衰老神經元SA-β-gal表達的影響（n=5，200×）

2.4 紅景天苷對神經元凋亡率的影響

流式細胞術結果顯示，LT組凋亡細胞比率較與ST組明顯增加（P＜0.01）。給予紅景天苷和環黃芪醇處理后，凋亡細胞數量逐漸減少，Sal-L、Sal-H和CAG組的凋亡細胞比率較LT組均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 紅景天苷對自然衰老的海馬神經元凋亡的影響（n=3，200×）

2.5 紅景天苷對神經元端粒酶活性和TERT表達的影響

PCR-ELISA法顯示，LT組海馬神經元的端粒酶活性較ST組顯著降低（P＜0.0 1）；經紅景天苷和環黃芪醇處理后，神經元的端粒酶活性顯著提高，差異有統計學意義（P＜0.05）。Western blot檢測結果表明，LT組神經元TERT表達較ST組顯著下降（P＜0.01），經紅景天苷和環黃芪醇處理的神經元TERT表達較LT組顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6、表1。

表1 各組海馬神經元端粒酶相對活性和TERT表達 （）

表1 各組海馬神經元端粒酶相對活性和TERT表達 （）

注：**P＜0.01 vs LT組；# P＜0.01、##P＜0.01 vs ST組。

0.32±0.13 0.14±0.13**0.23±0.15#0.27±0.14##0.24±0.15#組別例數端粒酶相對活性TERT相對表達量ST組LT組Sal-L組Sal-H組CAG組5 5 5 5 5 1.19±0.10 0.58±0.18**0.80±0.14#0.99±0.19##0.86±0.15#

圖6 各組小鼠海馬組織中TER的蛋白表達

3 討論

傳統中藥用藥歷史久遠，《四部醫典》中便言其“性平、味澀、善潤肺、能補腎、理氣養血”，《神農本草經》稱服之可“輕身益氣，不老延年”，具有益氣活血、通脈平喘的功效。近年研究發現，紅景天具有抗疲勞、抗炎、抗氧化、抗衰老等作用，其主要活性成分紅景天苷可以有效緩解多種神經退行性疾病，對神經元具有保護作用，但其作用機制尚不十分明確[11-15]。

本實驗長期培養大鼠原代海馬神經元作為自然衰老模型，可以模擬在體海馬神經元衰老的一些改變[16]。結果表明，培養第7～15天，神經元胞體飽滿，具有典型的神經元結構和突起，神經元數目無明顯改變。隨著海馬神經元培養時間的增加，大多數神經元開始退化，細胞胞體萎縮，神經元突起斷裂，神經元數目明顯減少，可見大量細胞碎片，與既往研究相一致。Mao等[17]研究發現，紅景天苷可以降低人胚肺二倍體細胞（2BS）的SA-β-gal的表達，延緩2BS細胞的復制性衰老。Zhang等[18]研究發現，紅景天苷可以劑量依賴地抑制MPP（+）誘導的PC12細胞凋亡。本實驗研究結果顯示，與短期培養的年輕神經元相比，長期培養的海馬神經元細胞存活率明顯下降，而SA-β-gal的陽性表達率明顯增加，并且海馬神經元凋亡率增加，說明長期培養的神經元衰老比例明顯增多。給予不同濃度的紅景天苷處理后，細胞存活率顯著提高，SA-β-gal的陽性表達率和神經元凋亡率也明顯下降，提示紅景天苷可以延緩原代海馬神經元的自然衰老，與抗衰老藥物環黃芪醇的作用效果一致[19]。

染色體末端的端粒縮短可以激活DNA損傷反應，引發細胞周期停滯，加速細胞衰老和死亡[20]。端粒長度主要由端粒酶維持，端粒酶可以合成并添加端粒重復序列至染色體末端，以維持染色體末端的端粒長度， 從而防止細胞衰老。 端粒酶逆轉錄酶（TERT）是具有逆轉錄酶活性的催化亞基，也是端粒酶起作用的關鍵結構和主要調控亞單位。有研究發現，TERT基因敲除小鼠的海馬組織中缺乏端粒酶，不僅導致海馬神經元退化，組織局部功能喪失，還會產生衰老相關疾病，而端粒酶再激活可以逆轉神經元退化，說明端粒在大腦衰老的過程中具有重要作用[21-22]。本研究證實，長期培養的海馬神經元端粒酶活性明顯低于短期培養的神經元，給予紅景天苷處理可以有效減少端粒酶活性的下降，其作用效果與環黃芪醇的作用效果相似。說明紅景天苷可以有效提高自然衰老的原代海馬神經元的端粒酶活性。

綜上所述，紅景天苷可能通過降低衰老海馬神經元的SA-β-gal表達和神經元凋亡，提高衰老海馬神經元的端粒酶活性，從而延緩海馬神經元自然衰老，提高原代海馬神經元存活率。