基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探索百部異病同治肺癌與咳嗽的共同作用機制

張 松 趙 寧

（1.中國政法大學校醫(yī)院，北京，100088；2.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院藥學部，北京，100091)

百部是有著悠久歷史的傳統(tǒng)中藥，其味甘、苦、性微溫，具有潤肺下氣止咳，殺蟲滅虱等功用[1]。百部主要化學成分和有效成分為生物堿[2]，用于治療咳嗽、肺痿、肺炎、感冒、牛皮癬、肺癌、陰虱、陰道炎、螨蟲病、疥瘡等[3-4]。

咳嗽是肺癌最常見癥狀之一，也多為首發(fā)癥狀[5]。咳嗽是身體的一種防御性神經(jīng)反射，能夠促進呼吸道內(nèi)分泌物的排出和異物的清除，但高頻率且劇烈的咳嗽會對患者的生活產(chǎn)生嚴重的負面影響。在西醫(yī)理論及臨床實踐中，肺癌與咳嗽的治療藥物往往不同，很少用同一個藥物同時治療肺癌和咳嗽。百部在臨床應(yīng)用中涉及肺癌和咳嗽，是中醫(yī)理論異病同治的有效體現(xiàn)，但其同時治療肺癌和咳嗽的作用機制未見報道。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，從分子作用機制角度探索百部與肺癌和咳嗽之間的關(guān)系，為百部異病同治肺癌與咳嗽的研究開展提供一定的理論依據(jù)，現(xiàn)報告如下[6]。

1 資料與方法

1.1 篩選百部的活性成分

使用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（http://lsp.nwu.edu.cn/），以“百部”為關(guān)鍵詞鍵入Herb name，檢索全部化學成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件進行活性成分篩選，得到百部中具有較高活性且可能入血的活性成分（檢索時間：2023年3月6日）。

1.2 預測分析百部化學成分的靶點

通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺“Related Targets”收集篩選得到的活性成分對應(yīng)的靶點蛋白，并在Uniprot（http://www.uniprot.org/）使用Uniprot KB 檢索功能，以“organism：homo sapiens”和“reviewed：yes”為檢索條件，獲取活性成分對應(yīng)人類的相關(guān)潛在靶點基因。

1.3 確定疾病靶點

通過Genecards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）檢索肺癌（lung cancer）與咳嗽（cough）的疾病相關(guān)基因（檢索時間：2023年5月7日）。

1.4 預測百部對肺癌和咳嗽作用靶點

建立百部活性成分靶蛋白及肺癌和咳嗽Excel文件，利用Excel篩選功能，映射出百部活性成分靶蛋白與肺癌和咳嗽靶蛋白交集的關(guān)鍵靶點。將其導入STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），從數(shù)據(jù)庫中獲取篩選出的交集蛋白靶點之間的關(guān)系信息。將結(jié)果導入Cytoscape 3.8.2軟件，以自由度（degree）進行可視化及網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析，并將交集靶點繪制成網(wǎng)絡(luò)圖，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）。

1.5 百部肺癌和咳嗽作用靶點的功能注釋分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org），選擇人類作為研究對象，將百部的有效作用靶點上傳，進行基因本體功能（Gene Ontology，GO）通路富集分析和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的通路富集分析，并進行可視化處理，得到百部在肺癌和咳嗽中的主要作用通路。

2 結(jié)果

2.1 有效活性成分的篩選

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，得到百部中有效活性成分110個。按“OB≥30%、DL≥0.18”篩選，得到32個有效活性成分，見表1。

表1 百部有效活性成分

2.2 百部化學成分靶點的預測

檢索中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺，得到百部每個活性成分作用的靶點，使用UniProt數(shù)據(jù)庫進行矯正，得到對應(yīng)靶點的基因名，共得到百部的靶點基因102個。

2.3 百部對肺癌與咳嗽作用靶點的預測及相互作用分析

在Genecards數(shù)據(jù)庫中檢索Keywords：lung cancer，共得到相關(guān)基因23 107個，按score評分取中位數(shù)得關(guān)鍵基因共1 449個；檢索Keywords：cough，共得到相關(guān)基因4 396個，按score評分取中位數(shù)得關(guān)鍵基因共1 850個，再將百部的活性成分對應(yīng)的102個靶點基因與肺癌和咳嗽對應(yīng)的關(guān)鍵基因進行交集，共得到37個交集靶點，見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點合集venny圖

2.3.1 疾病-靶點-有效成分網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將疾病與藥物有共同靶點的活性成分和共同靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件，見圖2，構(gòu)建了疾病-靶點-活性成分的網(wǎng)絡(luò)圖，其中包括活性成分27個，按照degree排序依次主要包括刺芒柄花素、β-谷甾醇、7-甲氧基-3-甲基-2,5-二羥基-9,10-二氫菲、芝麻素、二去氫新對葉百部堿、二去氫百部新堿B、蔓生百部酰胺、直立百部類生物堿B等。

圖2 疾病-關(guān)鍵靶點-活性成分網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖

2.3.2 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖

將篩選出的37個交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，置信度設(shè)為＞0.400，剔除游離的靶點蛋白，進行蛋白質(zhì)相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建，見圖3，得到百部對肺癌與咳嗽異病同治的蛋白靶點作用網(wǎng)絡(luò)圖。同時將結(jié)果通過Cytoscape 3.8.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)分析，節(jié)點Degree中位數(shù)為17，獲得關(guān)鍵靶點14個，按靶點與成分相關(guān)性考察，依次為PTGS2、AR、NOS2、NR3C1、ESR1、PGR、JUN、MAPK14、CASP3、CASP8、CASP9、CCND1、IL10、IL4、NOS3、PPARG、TGFB1（見圖3），這些靶點可能是百部對肺癌和咳嗽異病同治中潛在關(guān)鍵點。

圖3 交集靶點PPI關(guān)聯(lián)圖

2.4 基因功能分析

2.4.1 GO富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫設(shè)置物種參數(shù)H species，P值小于0.01，對百部和肺癌與咳嗽共同有效作用靶點進行GO功能富集分析，得到767條富集結(jié)果，見圖4，其中生物學過程（Biological Processes，BP）條目683個，主要包括細胞對有機環(huán)狀化合物的反應(yīng)、對雌二醇的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、血液循環(huán)、髓細胞分化、血管形態(tài)發(fā)生等。細胞組成（Cellular Components，CC）條目27個，主要包括膜筏、細胞器外膜、受體復合物、轉(zhuǎn)移酶復合物、轉(zhuǎn)移含磷基團。分子功能（Molecular Functions，MF）條目57個，包括核受體活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號通路等。

圖4 GO BP、CC、MF富集圖

2.4.2 KEGG富集分析

利用數(shù)據(jù)庫Metascape對百部、肺癌與咳嗽疾病共同有效作用靶點進行通路富集分析，共165條（見圖5），經(jīng)篩選（P＜0.05）主要涉及癌癥的途徑、利什曼原蟲感染、內(nèi)分泌抵抗、病毒致癌、小細胞肺癌、癌癥中的蛋白多糖、血清促能突觸、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、催產(chǎn)素信號通路、腫瘤中的MicroRNAs等。

圖5 KEGG Pathway氣泡圖

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學[7]是以系統(tǒng)生物學為基礎(chǔ)，結(jié)合計算機技術(shù)，通過構(gòu)建“疾病-靶點-有效成分”網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)地揭示藥物多組分與疾病多靶點的關(guān)系及其作用機制，與中醫(yī)學整體論、辨證論治的指導原則相符[8]，并用于闡釋中醫(yī)“異病同治”理論和實踐[6]。傳統(tǒng)中藥百部在肺癌及咳嗽的治療中被廣泛應(yīng)用，且肺癌患者多伴有咳嗽，因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學手段，探討百部“異病同治”的可能治療靶點及作用機制。

百部的化學成分研究已分離出150多種百部生物堿[9]，藥理學研究包括驅(qū)蟲、鎮(zhèn)咳、抗腫瘤、抗結(jié)核、抗慢性阻塞性肺疾病等[10]。在治療咳嗽方面，有學者發(fā)現(xiàn)百部可降低組胺動物模型呼吸中樞的興奮性，使支氣管平滑肌痙攣松弛；降低咳嗽因子TRPA1基因及蛋白水平的表達[11]。在抗腫瘤方面，對葉百部總生物堿可能通過抑制PI3K/Akt信號通路和激活JNK/p38 MAPK信號通路，誘導人肺癌A549細胞凋亡[12]，對肝癌[13]、甲狀腺瘤[14]、結(jié)直腸癌[15]等均有顯著的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，百部治療肺癌和咳嗽相關(guān)的主要基因有PTGS2、AR、NOS2、NR3C1、ESR1、PGR、JUN、MAPK14、NOS3等。其中前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）基因已證實可以促進腫瘤、癌癥的形成[16]，腫瘤血管生成、表型改變、細胞黏附增加和抗凋亡也與PTSG2其上調(diào)有關(guān)，特別是PTGS2多態(tài)性與肺癌有潛在的協(xié)同關(guān)聯(lián)[17]。同時，百部對PTGS2靶點的影響在基因和蛋白質(zhì)水平均得到有效驗證[18]。雄激素受體（AR）是一種調(diào)節(jié)基因表達的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子[19]，有學者發(fā)現(xiàn)AR信號通路基因中單核苷酸表現(xiàn)出的多態(tài)性，與非小細胞肺癌（EGFR敏感突變的）發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的風險密切相關(guān)[20]。作為啟動子參與細胞增殖和靶組織分化增生的NR3C1可能負性調(diào)控內(nèi)毒素誘導的小鼠急性肺損傷中MAPK4的表達[21-22]。c-JUN是調(diào)控細胞程序JUN家族成員之一[23]，肺癌發(fā)生發(fā)展可能與其過度表達有關(guān)，在提示NSCLC的診斷、轉(zhuǎn)移及預后方面均有一定的臨床應(yīng)用意義。NOS3基因與肺癌患者發(fā)生≥2級放射性肺損傷的風險顯著相關(guān)[24]。NOS2和JUN[25]、MAPK14在肉瘤大鼠中參與蛋白信號轉(zhuǎn)導，在抑制腫瘤的生成、增殖、遷移以及血管生成中發(fā)揮重要作用[26]，其中MAPK14在百部治療咳嗽靶點得到有效進行驗證[18]。

GO和KEGG富集結(jié)果中癌癥途徑、小細胞肺癌途徑、病毒致癌途徑、腫瘤中的MicroRNAs途徑、VEGF信號通路和肺癌直接相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與許多基因的轉(zhuǎn)錄啟動相關(guān)，參與免疫和炎癥反應(yīng)及腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，NF-κB誘導多種炎性細胞，參與多個氣道慢性炎癥反應(yīng)環(huán)節(jié)[27]，同時多種原癌基因和化學物質(zhì)也可以激活NF-κB，通過正反饋或負反饋環(huán)路調(diào)控MicroRNAs的表達和功能，形成網(wǎng)絡(luò)型基因調(diào)控，在腫瘤相關(guān)性炎癥信號中處于核心地位，將炎癥與腫瘤在分子層面緊密連結(jié)[28]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），參與腫瘤心血管生成[29]和呼吸系統(tǒng)疾病中的氣道重塑[30]，是治療腫瘤和呼吸系統(tǒng)疾病的主要靶點之一。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學推測，百部中的多種化學成分，通過PTGS2、NOS2、NR3C1、ESR1、JUN等多靶點，轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤中的MicroRNAs、VEGF信號通路、癌癥途徑、癌癥中蛋白多糖通路等途徑參與肺癌和咳嗽的雙向調(diào)節(jié)機制，為百部異病同治肺癌和咳嗽的藥理學研究提供新的思路和一定方向。但本研究僅利用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)，雖然部分靶點或通路已在百部治療肺癌或者咳嗽中得到驗證，但具體的調(diào)控機制及關(guān)鍵靶點，需進一步通過分子模擬對接、譜效關(guān)系、基礎(chǔ)實驗研究等方法進行探索和驗證。